Abstract
Bakgrunn
Trinnvis oppkjøp onkogene mutasjoner og sletting /inaktivering av tumorsuppressorgener prege utvikling av tykktarmskreft (CRC). Disse genetiske hendelser samvirke med diskrete morfologiske overganger fra hyperplastisk slimhinne til adenomatøse områder, etterfulgt av in situ ondartet transformasjon, og til slutt invasivt karsinom. Målet med denne studien var å identifisere vev markører for adenom-karsinom morfogenetiske overganger i CRC.
Metoder og funn
Vi analyserte mønstre av uttrykk for vekstregulerende og stamcellemarkører på tvers av disse forskjellige morfologiske overgangssoner i 735 primær CRC svulster. I 202 tilfeller med konservert adenom-adenokarsinom overgang, identifiserte vi, i 37,1% av tilfellene, en sone av adenomatøs epitel, som ligger i umiddelbar nærhet av den invasive komponent, som viste hurtig vekslende intraglandular strekninger av PTEN + og PTEN- epitel. Denne sonen nøyaktig overlappet med tilsvarende vekslende uttrykk for Ki-67 og omvendt med transformerende vekstfaktor-beta (TGF-β) vekst regulator SMAD4. Disse sonene viser også parallelle vekslende nivåer og /eller subcellulære lokalisering av flere kreft stilk /stamceller (CSC) markører, inkludert β-catenin /CTNNB1, ALDH1, og CD44. PTEN ble alltid gjen uttrykkes i invasive svulster i disse tilfellene, i motsetning til de med fullstendig tap av PTEN uttrykk. Genomisk microarray analyse av CRC med prominente CSC-lignende utvidelser viste en høy frekvens av
PTEN
genomisk sletting /haploinsufficiency i tumorer med CSC-lignende overgangssoner (62,5%), men ikke i svulster med nedregulert, men ikke-alternerende PTEN uttrykket (14,3%). Det var ingen signifikante forskjeller i nivåene av
KRAS
mutasjon eller
CTNNB1
mutasjon i CSC-lignende svulster i forhold til umarkerte CRC tilfeller.
Konklusjoner
i konklusjonen, har vi identifisert en særegen CSC-lignende pre-invasiv overgangssone i
PTEN
-haploinsufficient CRC som viser konvergent on-off regulering av PTEN /AKT, TGF-β /SMAD og Wnt /β -catenin veier. Dette flaskehals-lignende sone er vanligvis etterfulgt av fremveksten av invasive svulster med intakt PTEN uttrykk, men feilregulert TP53 og jevnt høye priser spredning
Citation. Arvai KJ, Hsu YH, Lee LA, Jones D (2015) A Transition Zone Viser Meget Usammenhengende eller Vekslende Nivåene av Stem Cell og spredning Markører karakteriserer Utvikling av
PTEN
-Haploinsufficient tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (6): e0131108. doi: 10,1371 /journal.pone.0131108
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 16 januar 2015; Godkjent: 28 mai 2015; Publisert: 22 juni 2015
Copyright: © 2015 Arvai et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:. det er ingen aktuelle finansieringskilder for denne studien. Quest Diagnostics gitt støtte i form av reagenser /materialer og lønn for alle forfattere, men har ikke noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Den vitenskapelige publikasjoner ansatte på Quest Diagnostics anmeldt manuskriptet før innlevering, med navnene på disse vurderinger oppført i erkjennelse delen, med sin godkjenning
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Alle forfattere ble ansatt av quest Diagnostics på tidspunktet for undersøkelsen, et kommersielt laboratorium som tilbyr noen av flekker beskrevet som produkter, herunder stamcelle markør, SMAD4 og PTEN immunhistokjemi. En patentsøknad er inngitt på bruken av disse analysene for svulst profilering (61/932543, «Metoder og komposisjoner for å påvise Adenom-Adenocarcinoma Transition in Svulster»). Arbeidet presenteres her ble utført helt på Quest Diagnostics. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
regulert vekst av epitel i normal kolon er drevet av krypten-lokaliserte tarm stamceller (ISC), som veksler mellom stillestående og proliferativ stater [1]. Skift i subcellulære lokaliseringen av Wnt-assosiert beta (β) -catenin (
CTNNB1
) -kompleks og signalisering gjennom den transformerende vekstfaktor (TGF) -beta og PTEN /PIK3CA /AKT veier er blitt vist å påvirke ISC sykling [2,3].
En fenotypisk og funksjonelt lik populasjon av kreft stamceller (CSC) er postulert å forekomme i tykk- og endetarmskreft (CRC) og andre svulster [4,5]. Cscs har blitt postulert å dukke opp i CRC på de tidligste stadiene av transformasjon [6], eventuelt samkjøre med endringen beskrevet som avvikende krypten foci [7]. Men senere stadier av tumorprogresjon i CRC har blitt oftere modellert som stegvise overganger fra hyperplastiske slimhinne endringer adenomatøse områder (AD), deretter i situ malign transformasjon og endelig invasiv adenokarsinom (ACA) [8,9]. I dette skjemaet er økende spredning priser og genetisk ustabilitet fører til gradvis mer feilregulert og vekstfaktor-uavhengig vekst. Hittil forlikte usammenhengende modell for spredning og quiescence som ligger til grunn for CSC-modellen med den trinnvise evolusjonære modellen av hyperplasia-adenom-karsinom-serien er fortsatt problematisk [10].
Her viser vi, ved hjelp av en stor serie av primære CRC tilfeller som i godt orientert vevssnitt, mange colontumorer viser en klart atskilt sone med hurtig vekslende proliferativ og hypoproliferative kolonepitelet hvor mange ISC /CSC markørene er også modulert i parallell. Denne overgangssone, noe som sannsynligvis overgrodd av invasiv komponent i noen svulster, fremhever en kritisk sone av endrede signal ved invasiv grensen i CRC.
Metoder
Etikk uttalelse
studien ble gjennomgått og godkjent av Western Institutional Review board (IRB) under protokollen 2014-003, fornyet 12/31/2014. Kliniske prøver benyttet var mer- /kasserte prøvene som ble anonymisert før inkludering i studien uten å identifisere pasientinformasjonen beholdes og anses fritatt med fraskrivelse av informert samtykke.
Case utvalg og immunhistokjemi
Cases inkluderer primære CRC tilfeller sendes til quest Diagnostics Nichols institutt for molekylær eller immunfenotyping analyse mellom november 2011 og november 2013. saker inkludert var et tilfeldig utvalg av primære colontumorer med tilstrekkelig formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev seksjoner. Funksjonene i morfologiske overganger ble tatt opp med hematoxylin og eosin (HE) beiset lysbilder for hvert enkelt tilfelle. Fra normal til hyperplastic slimhinner, hyperplastisk å adenomatøs endring, og adenomatøs endring i in situ og invasive adenokarsinom
Immunohistochemistry ble utført på 4-mikrometer FFPE- seksjoner ved hjelp av Bond Max III (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland), Ultra Benchmark (Ventana, Tucson, AZ), og Link (Dako, Carpinteria, CA) automatiserte flekker plattformer, med epitop henting utført på-instrument for Leica (epitop Retrieval Løsning 2, pH 9,0-buffer) og Ventana (Cell Conditioner 1, pH 9,0-buffer) og frakoblet for Dako plattformen (TRS, pH 9,0 buffer i 40 minutter). Antistoff kloner og arbeids fortynninger er oppført i S1 tabell. Spesifisiteten av PTEN (6H2) og SMAD4 (B-4) antistoff kloner som anvendes er tidligere i stor utstrekning validert i vev og transfektanter ved hjelp av Western blot og andre teknikker [11, 12]. PTEN antistoff spesifisitet ble ytterligere demonstrert av fraværende uttrykk ved Western blot analyse av cellelysatene og FFPE- deler av
PTEN
-null cellelinjer CEM og Jurkat [13]. En peroksydase blokk ble brukt til alle lysbilder før antistoff søknad. Primære antistoff inkuberingene var ved romtemperatur i 12-32 minutter, med påvisning ved hjelp av 3,3-diaminobenzidin (DAB) (inkludert Bond Polymer Spesifisert for Leica, Ultra DAB for Ventana og ser for Dako). Lysbilder ble kontra med hematoksylin og etterkontra med bluing.
Immunostains ble scoret semi-kvantitativt av to av forfatterne (KA, DJ), med bilder tatt med Aperio XT lysbilde skanner til rette bilde overlegg og til vurdere subcellulære flekken lokalisering. For Ki-67, ble mønstre og antall celler med sterke kjerne positivitet registrert. PTEN farging ble scoret som uniform /normal i tumor; nedregulert i tumor sammenlignet med tilstøtende normal tykktarm; komp /sone tap av flekker i hele eller deler av tumorene; eller som har en multifokal vekslende mønster med områder med tap sidestilte siden av tumorceller med et normalt mønster. For andre markører, inkludert ALDH1, β-catenin, CD44, EZH2, MGMT P53, p-SMAD (1/5/8), og SMAD4, ble fargingsintensitet vurdert på tvers svulsten i forhold til ikke-neoplastisk epitel og /eller i blanding lymfocytter, samt den subcellulære lokalisering (kjernekraft, cytoplasma, membran eller kombinasjoner).
Fluorescent
in situ
hybridisering (FISH)
glass inneholder 4-mikrometer FFPE seksjonene ble bakt ved 56 ° C over natten og deretter avvokses og rehydrert ved bruk av xylen og etanol. Lysbilder ble behandlet ved hjelp av 0,2 N HCL, formalin, forbehandling buffer vask, og protease før du legger den FISH sonde. Prøvene ble deretter ko-denaturert ved 72 ° C i 5 minutter og tillatt å hybridisere over natten (14-18 timer) i et fuktighetskammer innstilt på 37 ° C. Slides ble analysert ved hjelp av en CL
PTEN /GRID1
3-farge sletting probe (MetaSystems, D-5971-100-TC).
PTEN
locus-spesifikk probe er merket med oransje på en 315 kb region på kromosom bandet 10q23.3. Andre sonder i cocktail inkluderte en locus-spesifikk probe for
GRID1
plassert på kromosom bandet 10q23.2, merket med grønt, og en sonde for centromeric kontrollområdet (10p11.1-q11.1) merket i blå.
Lysbilder ble evaluert for
PTEN
sletting ved å telle 30 tumorceller i ACA og Ad-ACA overgangssone (hvis tilgjengelig) og sammenligne antall
PTEN
signaler til hver av de to kontrollområdene på
PTEN /GRID1
probe (dvs. 2R2G2B for normal, R2G2B for enkelt tap, og 2G2B for biallelic tap). Et cutoff-verdi for
PTEN
delesjon av 10% av celler ble etablert ved å bestemme den midlere falskt positive pluss tre standardavvik ved hjelp av 10 tilfeller med normal tykktarm epitel [14]. For å lokalisere Ad-ACA synaptiske områder, var fisk bilder overlappet med IHC og /eller HE-bilder for å markere Ad-ACA overgang. Disse resultatene ble sammenlignet med regioner som viser tap av PTEN uttrykk.
Oligonukleotidrettet /enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) matrise
Etter macrodissection av FFPE- tumorsnitt ble genomisk DNA ekstrahert ved hjelp av QiaAmp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) og vurderes etter CytoScan HD 2600000-probe microarray plattform (Affymetrix, Santa Clara, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Opp til 1 pg DNA ble spaltet med restriksjonsenzymet Nsp I, ligert til adaptere, og amplifisert med PCR. Produktet ble deretter renset ved anvendelse av en magnetisk separasjonsteknikk, fragmentert, og merkes før hybridisering til microarray. Prøvekvaliteten ble vurdert ved PCR rensetrinnet. Fem prøver med fremtredende CSC-lignende Ad-ACA overgangsområdene var makro dissekert og analysert uavhengig av dypere invasive ACA.
Resultatene ble analysert ved hjelp av kromosomanalyse Suite (Chas) programvare (Affymetrix). For sammenligninger av hyppigheten av IHC mønstre og unormal loci av oligonukleotid /enkeltnukleotidpolymorfi array (OSA) i CSC-lignende tilfeller med tilfeller med intakt PTEN, ble p-verdier generert ved hjelp av Fishers eksakte test.
Mutation analyse
Mutasjon analyse av genomisk DNA ekstrahert fra macrodissected svulst i FFPE- seksjoner ble utført for ekson 3 hotspot av
CTNNB1 Hotell og
KRAS plakater (kodon 12, 13 og 61) ved pyrosekvensering, med en omtrentlig følsomhet på 2% til 5%. I 11 tilfeller med fremtredende CSC-lignende overgangssoner, ble Ion sekvensering utført for mutasjon hotspots i 34 kreftassosierte gener, som i tillegg inkluderte
PTEN
,
SMAD4
, og
TP53
, ved hjelp av Ampliseq Cancer array (Life Technologies, Carlsbad, California). Protokollen ble henhold til produsentens anvisninger, med DNA-sekvensering utført på Ion PGM plattform og data analysert ved hjelp SequencePilot programvare (JSI MedSystems, Tyskland).
Resultater
Alternating spredning streker Ad-ACA overgang i en undergruppe av CRC
Vi har undersøkt uttrykk mønster av en rekke sprednings markører over normal-hyperplastisk-Ad-ACA morfologiske overganger på godt orientert FFPE tumor deler av 735 primær CRC tilfeller. I en undergruppe av svulster, identifiserte vi et lokalt område som viste påfallende intraglandular endring mellom Ki-67 + proliferativ og Ki-67- hypoproliferative strekninger av adenomatøs epitel i et område som grenser til invasiv kreft. Disse soner av diskontinuerlige Ki-67 ekspresjonen skjedde over en strekning på ti til flere hundre tumorceller (figur 1A). Til tross for den slående vekslende mønster IHC, Ki-67 + og Ki-67 strekninger var i stor grad skilles morfologisk fra hverandre og var ikke tilstede ved normal /hyperplastisk epitel overgang (Fig 1 A) eller i den invasivt karsinom (figur 1A). I en undergruppe av 4 tilfeller undersøkt, vi også bemerket parallell usammenhengende uttrykk for flere cellesyklus regulatorer, inkludert cyclin D1, MYC og P53, i disse Ad-ACA overgangssoner (figur 2)
(A) ki- 67 immunhistokjemisk farging av en primær tykktarmskreft delen viser prolifererende celler begrenset til krypter i normal /hyperplastisk epitel (venstre); strecthes av vekselstrøm Ki-67 + prolifererende og Ki-67- hvilende celler i adenomatøs området ved de første områdene av invasive svulster (i midten); og jevn spredning i invasivt karsinom (til høyre). (B) PTEN farging fra samme tumor viser uniform PTEN uttrykk i normal /hyperplastisk epitel (til venstre), og i de fleste av adenomatøs epitel og invasive svulster (til høyre). Et område innenfor Ad-ACA overgangssone viser on-off alternerende PTEN uttrykk overlappende med av /på-Ki-67 uttrykk.
farging i Ad-ACA overgangssoner av en primær CRC svulst viser focal tap av PTEN, Ki-67, P53, og EZH2 i den samme delen av kjertelen som viser oppregulering av SMAD4 og MGMT. Strekningen av celler mellom de to grønne pilene (A B) fremhever en eksakt overlapping av PTEN tap og SMAD4 oppregulering
I likhet med Ki-67, vekstregulator PTEN demonstrert like og overlappende brå. intragland endringer i proteinnivå, med svært diskrete /usammenhengende grenser (fig 1b). Dette på /av Ad-ACA overgangssone, som oppdaget av PTEN IHC, var fremtredende i 50 av de 735 (6,8%) tilfeller studert, men var minst fokalt stede i 75 av de (37,1%) tilfeller 202 med intakt Ad- ACA veikryss (tabell 1). Dette ble ikke observert i 20 konvensjonelle colonic adenom uten assosiert invasivt karsinom (ikke vist).
Denne veksel PTEN mønsteret var tydelig fra både nedregulert (men fortsatt jevnt uttrykt) PTEN IHC mønsteret sett i 275 tilfeller (37,4%) og den komp PTEN tap mønster sett i 89 (12,1%) (tabell 1). Den spesifikke mønster av PTEN uttrykk var ikke signifikant korrelert med tumorstadium, tilgjengelig i 108 tilfeller. I de 75 tilfellene med vekslende PTEN og en evaluerbare Ad-ACA overgang, tilstøtende invasiv ACA viste gjen uttrykk for PTEN i invasive områder i alle tilfeller (figur 1B, nederst panel).
Svulster med brå og uniform tap av PTEN uttrykk ved IHC hadde ingen identifiserbare Ad-ACA veikryss i 85 av 89 tilfeller (95,5%); fraværet av rest adenomatøs komponent var sterkt assosiert med svulster som viste komplett PTEN tap (p 0,0001). Svulster med komplett PTEN tap av uttrykk også manglet en foregående vekselvis på /av mønster av PTEN uttrykk innenfor svulst eller tilstøtende vev i alle, men 2 tilfeller.
I svulster med vekslende PTEN, SMAD4, en formidler av TGF beta-signalisering, viste også on-off-protein modulasjon i de samme områdene i 15 av 21 tilfeller (71,4%), men med et mønster invers til PTEN (figur 2A og 2B). PTEN-SMAD4 dobbelt farging bekreftet dette i stor grad inverse forholdet mellom SMAD4 og PTEN flekker nivåer (ikke vist). Andre komponenter i TGF-beta sti, inkludert pSMAD1 /5/8 og pSMAD2 /3 har ikke vist lignende på /av uttrykk innenfor Ad-ACA overgangssoner (S1 fig).
Mønster av kreft stamcelle markør uttrykk ved Ad-ACA overgang
med den rollen PTEN /AKT signalering i formidling ISC sykling [4,15,16], undersøkte vi nivået og subcellulære lokalisering av CSC markører i 21 CRC tilfeller med PTEN /SMAD4 /Ki-67 vekslende overgangssoner. Disse samme proliferativ-hypoproliferative soner viste også dramatisk diskontinuitet i uttrykket av ALDH1, EZH2, og MGMT, så vel som nivåene og lokalisering av CD44, og endringer i cytoplasmiske /membran og nukleær lokalisering av β-catenin (figurene 2 og 3). I de strekninger av celler med lav-til-fraværende PTEN og Ki-67 positivitet, ble β-catenin forskjøvet til kjernen (figur 3C). Vekk fra Ad-ACA overgangssoner, β-catenin var enten fullt translocated til kjernen eller tilstede i membran /cytoplasmatiske steder i nesten alle celler, med bare spredte enkeltceller eller små klynger av celler med kjernefysisk-lokaliserte protein. CD44 ble både downregulated og distribuert til basal epitel grensen i PTEN- områder (Fig 3D). MGMT ble oppregulert i områder som viste nedregulering /fravær av EZH2 og ALDH1 farging (Fig 2E og 2F) (Fig 3E og 3F).
(AD) adenomatøs epitel ved siden av invasive svulster viser fremtredende multifokale soner av PTEN tap og redusert Ki-67, med kjernefysiske lokalisering av β -catenin og redusert nivå og basalmembran relocalization av CD44. (E, F) Ad-ACA overgang i en annen tumor viser multifokale strekninger av adenomatøs epitel med tap av EZH2 og ALDH1 uttrykk. De grønne pilene markere områder der ut-av-fase vekslende mønstre av CSC-lignende markører er oppstått.
Selv om to eller flere av stamcellemarkører viste vekslende uttrykk i alt 21 PTEN /Ki-67 vekslende tilfeller testet, den nøyaktige plasseringen av på-av markør uttrykk for stamcelle markørene var mer variabel som kan være relatert til den relative nivåer eller stabiliteten for de involverte proteiner (for eksempel figur 3 i forhold til figur 2). Regnskap for denne variasjonen, Ki-67 + proliferative soner viste en PTEN + P53 + EZH2
lav ADLH1-MGMT
høy SMAD4- immunfenotype med den inverse immunfenotypen stede i Ki-67- stillestående soner.
korrelasjon av
PTEN
genomisk status med PTEN uttrykk mønster
i CRC tilfeller med fremtredende CSC-lignende overgangssoner, undersøkte vi de genomiske funn av microarray (tabell 2) og mutasjons funn av sekvense paneler , herunder for ekson 3 mutasjon hotspot i
CTNNB1
samt
KRAS
,
PTEN
,
SMAD4
, og
TP53
. Analysen ble utført i macrodissected svulst i løpet av de invasive områdene
Hyppigheten av genomisk tap på 10Q /
PTEN
som vurderes av OSA. (10/16; 62,5%) var mye høyere i CRC med fremtredende CSC lignende utvidelse, slik det er definert ved PTEN IHC mønster, enn i tilfeller med uniform PTEN uttrykket (1/16; 6,3%, p = 0,0007) (figur 4A). I CSC-lignende tilfeller, hyppigheten av
PTEN
sletting var enda høyere (13/17; 76,4%) når analysert av fisk. Ved hjelp av FISH, vi også vurdert den genetiske supplement i enkelte celler i CSC-lignende sone selv og i invasive komponenten. Disse studiene viste mye mer variabel sletting av kromosom 10 og
PTEN
locus mens i invasiv ACA vekk fra krysset, mønsteret av
PTEN
FISH var mer jevnt heterozygot sletting (fig 4B 4E og S2 tabell).
(A) oligonukleotid /SNP array-resultatene viser hyppig sletting (røde linjer) av
PTEN
locus på kromosom 10 (svart stiplet pil) i CRC med fremtredende CSC -lignende overgangssoner (blå bakgrunn) og i svulster med komplett PTEN tap av IHC (rosa bakgrunn) sammenlignet med de med uniform PTEN downmodulation eller normal uttrykk (hvit og gul bakgrunn). Saker med slettinger av p arm av kromosom 17 omfatter
TP53 product: (i midten) og sletting av kromosom 18 (til høyre) ble ofte nevnt i CRC og var uavhengig av PTEN IHC mønster. (B-E) Sammenligning av PTEN IHC og FISH i en CSC-lignende svulst (Sak 1 fra S2 tabell). (B) høy forstørrelse av PTEN IHC med typiske alternerende uttrykksmønster ved overgangssonen. (C) Den matchet
PTEN
FISH bildet viser et heterogent mønster for tap av
PTEN Hotell og kromosom 10 kopiantall i tumor epitelceller. (D) PTEN IHC i invasive ACA bort fra overgangs viser uniform uttrykk. (E) FISH analyse i invasiv ACA område vekk fra overgangen viser et enhetlig mønster for en kopi
PTEN
tap. (F) PTEN IHC i en CRC tilfelle med fraværende PTEN staning. (G)
PTEN
FISH i en serie del av samme svulst som (F) viser homozygot
PTEN
sletting. De underliggende stromale celler på den grønne pilen viser normale
PTEN
kopiantall.
Den høye frekvensen av
PTEN
sletting i CSC-lignende svulster var lik de viser komplett PTEN tap av IHC. I den sistnevnte gruppen, men nivåene av 10Q tap av OSA i en undergruppe av tilfellene var i samsvar med biallelic sletting et funn bekreftet av fisk i 5 tilfeller (figur 4F). Påvisbare
PTEN
mutasjoner var uvanlig i alle grupper.
De frekvenser av genetiske forandringer på kromosom 18q /
SMAD4
12/16 (75%) og kromosom 17p /
TP53
9/16 (56,3%) i CSC-lignende tilfeller var lik de i tilfeller med andre PTEN uttrykk mønstre (figur 4A).
KRAS
mutasjoner (83/178, 46,7%) og
CTNNB1
ekson 3 mutasjoner (1/46, 2,2%) var til stede i CSC-lignende tilfeller på et tilsvarende frekvens fra svulster med andre mønstre av PTEN uttrykk. I en undergruppe av 7 tilfeller med fremtredende CSC-lignende overgangssoner, DNA-sekvensering avslørte mutasjon av frekvenser på 14,3% for
TP53 product: (1/7), 28,6% for
SMAD4 plakater (2 /7), og 57,1% for
APC product: (4/7), noe som indikerer en mulig høyere
SMAD4 Hotell og lavere
TP53
mutasjonsraten enn uselekterte CRC tilfeller [17] .
Expression endringer mellom Ad-ACA krysset og i invasive svulster komponent
med unntak av MGMT, som viser mer kompleks variabel på /av uttrykk mønster i de fleste svulster, de studerte markører som var vekslende i Ad-ACA overgangssonen ble i stor grad ensartet uttrykk innenfor invasiv ACA bort fra overgangen. Som nevnt ovenfor, tilfeller med fremtredende veksel PTEN uttrykk ved overgang alltid re-uttrykte proteinet i de invasive svulster; et lignende mønster ble sett for ALDH1 og EZH2. Men SMAD4 og CD44 uttrykk ble tidvis fullstendig tapt i invasive svulster. Mest slående, var imidlertid P53 uttrykk: TP53 uttrykk viste en høy grad av fullstendig tap (50%) eller uniform gevinst (41,7%) i invasiv ACA bort fra Ad-ACA overgang (figur 5). I disse svulstene, vekslende P53 uttrykk sett i løpet av de CSC-lignende overgangssonene ikke lenger var observert.
P53 IHC viser bare enkelt celle /fokus uttrykk i normal epitel og mest adenomatøse områder, vekslende uttrykk i pre- invasiv /overgangssonen (innfelt) og jevnt oppregulert P53 protein uttrykk i de senere stadier av invasiv adenokarsinom. Dette tumor er den samme som den som er vist i figur 1. De vanligste funksjonene i hver morfologisk overgang i CRC tilfeller med fremtredende CSC-lignende funksjoner vises.
Diskusjoner
Etter eksamen av morfogenetiske overgangssonene i et stort antall primær CRC tumorer, avdekket vi en lokalisert CSC-lignende overgangssone av multifokal alternerende hvile /proliferativ adenomatøs epitel som påvirker flere stamcelle og cellesyklus markører, inkludert Ki-67, ALDH1, β-catenin , CD44, EZH2, MGMT, MYC, PTEN, P53, og SMAD4. Denne overgangssone, er sentrert i den pre-invasiv adenomatøs epitel inntil invasiv tumorområder, i kontrast til den mer ensartet spredning og homogene uttrykk profiler av den dypere invasiv ACA og adenomatøse områder som grenser til ikke-neoplastisk epitel.
den svært signifikant sammenheng av
PTEN
sletting /haploinsufficiency med CRC saker som har fremtredende CSC-lignende soner impliserer lavere nivåer av PTEN protein og dermed forskjellsmodulering av AKT kinase aktivitet som en utløser for CSC-lignende fenotype. Tallrike studier i cellelinje og mus genetiske modeller har støttet en rolle for haploinsufficiency eller reduserte nivåer av PTEN fremme kreft progresjon [18-20]. Videre sykling av AKT-aktivitet, på grunn av PTEN variasjoner eller andre faktorer som TCL1 svingning, er også et vanlig funn i både kreft-relaterte og ikke-neoplastiske stamcelle funksjon og embryogenese [21-24]. Men avkastningen av PTEN til normale nivåer uten sone endringer i invasive komponenten i disse CSC-lignende svulster impliserer koordinere feilregulering av andre veier ved Ad-ACA veikryss. I denne forbindelse, påvises AD /ACA veikryss og fraværet av en CSC-lignende alternerende fenotype i CRC med total PTEN IHC tap tyder på at den naturlige historien om tykktarmskreft med komplett PTEN tap er særegent [25].
Gitt det store tilgjengeligheten av både PTEN og SMAD4 immunofarging, kan disse to markører kan anvendes alene eller i kombinasjon (som inkluderer dobbelt IHC) for å komplettere morfologisk undersøkelse for å identifisere CSC-lignende Ad-ACA overgang i begrensede vevsprøver. Faktisk, som rapportert for andre svulster [26], vises PTEN IHC overlegen gensekvensering, FISH og microarray i å fremheve den dynamiske PTEN regulering ligger til grunn for CSC-lignende overgang. For både microarray og FISH analyse, spesielt, kan PTEN funksjonell status være vanskelig å dissekere gitt hyppige tilstedeværelse av Aneuploidy og genetisk ustabilitet i CRC. Videre kompliserer saken, er mange invasive CRC svulster omgitt av stromale celler som kan inneholde ulike, mindre komplekse, genotyper enn nabotumorceller. Dette fører til redusert teknisk følsomheten FFPE- microarray analyser. Mens FISH er en overlegen metode for å undersøke knutepunkter genetiske hendelser, mikromatriser var i stand til å oppdage
PTEN
sletting med tilstrekkelig nøyaktighet. Genomisk analyse avdekket imidlertid ut til at uniform downmodulation av PTEN nivåer i invasiv CRC relatert til
PTEN
genet sletting og uten tilknytning til CSC fenomen.
Selv om dette CSC-lignende sone er fremtredende i bare en liten prosentandel av CRC-tilfeller (figur 3), er det fokalt til stede i en betydelig prosentandel av tilfellene som viser morfologisk intakte Ad-ACA overganger (figur 2). Eksistensen av disse diskrete CSC-lignende soner ved Ad-ACA veikryss i en stor gruppe av primære CRC tyder på at de kan tjene som en nyttig forløper lesjon, forutsi begynnende invasiv transformasjon. I denne forbindelse, de ligner mønsteret av PTEN regulering sett i kjertel- forstadier sett i endometrial cancer [27,28]. Hvorvidt disse endometrial lesjoner viser samme mønster av CSC-lignende spredning /quiescence og representerer en lignende konvergens av signalbaner krever videre studier.
colocalization men ikke perfekt overlapping av on /off grenser for mange CSC markører antyder at modulering av proliferasjon /hvile fenotype er sannsynligvis ganske hurtig i overgangssonene. Disse dyssynchronous grenser sett for noen markører er sannsynlig på grunn av varierende halveringstider og forskjellige mekanismer for nedregulering hvert protein, inkludert proteolytisk spaltning, transkripsjonen nedregulering, og proteosom klaring [29,30]. Likevel, Ki-67 + /PTEN + /MYC + /TP53 + soner som alternerer med Ki-67- /MGMT + /β-catenin
NUC /Smad + soner er det karakteristiske mønsteret sett i mange tilfeller.
Mønsteret av vekslende markører observert i overgangssonene favoriserer aktivering og hemmende interaksjoner mellom TGF-beta /SMAD, PI3K /Akt og wnt /β-catenin signalveier [31]. Interaksjoner mellom AKT og BMP /TGF-beta signalering, som nevnt her for PTEN og SMAD4, er en funksjon av stamcelleforskningen fenotype i enkelte modeller [16,32,33]. Modulering av SMAD signalering (som vurdert ved fosfo-SMAD antistoffer) og SMAD4 ekspresjon i opposisjon til PTEN i en rekke av de CSC-lignende tilfeller kan reflektere hyperreaktivitet av junctional epitel for BMP /TGF-beta-signalisering. For å bidra til å drive de sykliske proliferative /hvilende egenskapene til overgangssonen, effekter av SMAD aktivering på hemming av Wnt signal [34,35] kunne motsette effekten av økt EZH2 om kjøring β-catenin aktivitet [36].
en annen mulig coregulator av CSC-lignende fenotype ved Ad-ACA overgangen er MYC, som også veksler i parallell med PTEN, Ki-67, og SMAD4. I cellelinje-modeller, kan MYC overekspresjon kjøre PTEN oppregulering og EZH2 downmodulation ved å hemme AKT [37]. Når PTEN nivåer og AKT-aktivitet begynner å svinge, effekter av den bredere stamcelle transkripsjonen program blir sannsynligvis [38]. AKT-aktivitet i fravær av PTEN er også blitt vist å fremme genetisk ustabilitet, som er observert ved CSC-lignende overgang og ville ha en tendens til å fremme genetisk progresjon [39].
I de fleste CRC med fremtredende CSC lignende soner TP53 feilregulering, noe som gjenspeiles av uniform P53 IHC tap eller gevinst, skjedde i invasive svulster bort fra overgangssonen. Dette tyder på at TP53-drevet utvekst av en dominerende invasiv CRC klone vanligvis følger og er kanskje drevet av genetisk seleksjon i CSC-lignende overgangssone. Det er mulig at disse overgangssoner er et generelt fenomen av pre-invasiv fase av carcinogenese, hvor AKT og Wnt /β-catenin syklisk regulert.
