Abstract
Gitt at langvarig eksponering for østrogen og økt telomerase aktivitet er forbundet med livmorkreftutvikling, vårt mål var å evaluere samspillet mellom MAPK sti og østrogen induksjon av telomerase aktivitet i livmorkreftceller. Estradiol (E2) indusert telomeraseaktivitet og hTERT mRNA-ekspresjon i østrogenreseptor (ER) positiv -α, Ishikawa endometrial cancer cellelinje. UO126, en meget selektiv inhibitor av MEK1 /MEK2, hemmet telomerase-aktivitet og hTERT mRNA-ekspresjon induseres av E2. Lignende resultater ble også funnet etter transfeksjon med ERK-1/2-spesifikk siRNA. Behandling med E2 resulterte i rask fosforylering av P44 /42 MAPK og økt MAPK aktivitet som ble avskaffet av UO126. Den hTERT-promoteren inneholder to østrogen responselementer (eres), og luciferase-analyser viser at disse eres aktiveres av E2. Eksponering for UO126 eller ERK-1/2-spesifikk siRNA i kombinasjon med E2 motvirket den stimulerende effekt av E2 på luciferase-aktivitet fra disse eres. Disse funnene tyder på at E2-induksjon av telomerase aktivitet formidles via MAPK veien i menneskelige endometrial kreft celler
Citation. Zhou C, Steplowski TA, Dickens HK, Malloy KM, Gehrig PA, Boggess JF, et al . (2013) Østrogen Induksjon av Telomerase aktivitet gjennom Regulering av Mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) Avhengig Pathway i Human Livmorkreftceller. PLoS ONE 8 (2): e55730. doi: 10,1371 /journal.pone.0055730
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 06.11.2012; Godkjent: 29 desember 2012; Publisert: 07.02.2013
Copyright: © 2013 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble sjenerøst støttet av V Foundation for kreftforskning og Steelman fondet (Bae-Jump VL og Gehrig PA). Prosjektet er beskrevet ble også støttet av (1) Award Antall KL2RR025746 (UNC Clinical translasjonell Science Award-K12 Scholars Program) fra National Center for Forskning Resources (Bae-Jump VL) og (2) Award Number 1K23CA143154-01A1 (NIH /NCI K23 mentor pasientrettet forskning Career Development Grant). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Livmorkreft kreft~~POS=HEADCOMP er den mest vanligste kreftformen hos kvinner i USA [1]. Endogen og eksogen østrogeneksponering er viktige risikofaktorer for utvikling av type I livmorkreft; Imidlertid gjenstår det molekylære koblingen mellom østrogen og livmorkreft dårlig forstått. Vårt tidligere arbeid vist at østrogen regulering av telomerase potensielt kan spille en rolle i den maligne transformasjon av endometrium [2].
Telomerer er spesialiserte strukturer av den distale ende av kromosomer og funksjon i kromosom beskyttelse, posisjonering, og replikering. Med aldring, humane telomerene uunngåelig undergå progressiv forkortning i normale somatiske celler gjennom replika-avhengige sekvens tap ved terminale endene av DNA. Den progressive forkortelse av telomerer til slutt resulterer i kromosomal ustabilitet, noe som fører til cellulær begynnende alderdom. Telomerase er en ribonucleoprotein revers transkriptase som syntetiserer telomeric DNA i kromosomendene. Dette enzymet gjenkjenner G-rike streng av et eksisterende telomer repetisjonssekvensen og syntetiserer en ny kopi av den valgte sekvensen i fravær av en komplementær DNA-tråd, med et segment av den interne RNA-komponent som tjener som et templat [3], [4 ]. Således er telomerase består av et RNA-templat (human telomerase RNA, HTR) og den katalytiske protein hTERT (human telomerase revers transkriptase, hTERT) som har revers transkriptaseaktivitet [5] – [7]. Ekspresjonen av hTERT observeres ved høye nivåer i telomerase-positive cancerceller, men ikke i telomerase-negative celler, og er ansett som den hastighetsbegrensende faktor for telomeraseaktivitet [7], [8].
Over 85% av humane endometrielle karsinomer uttrykke telomeraseaktivitet [9] – [12], og nivået av telomerase-aktivitet er blitt korrelert med avansert stadium sykdom og med bekkenlymfeknutemetastase [12]. Den menneskelige endometrium er et unikt dynamisk vev, som består av epitelceller kjertler og bindevev som gjennomgår komplekse mønstre av spredning, sekresjon, og sammenbrudd i hele den reproduktive år. I løpet av menstruasjonssyklusen, er endometrial epitelceller regulert av kjønnshormoner østrogen og progesteron, og livmor carcionogenesis antas å være forbundet med langvarig eksponering for østrogen, uten motstand av progesteron. I den normale endometrium, blir ekspresjon av telomerase korrelert med cellulær proliferasjon, er vanligvis lokalisert i epitel-kjertelceller, og reguleres i et hormonelt-drevet, menstruasjonsfaseavhengig måte [13], [14]. Økt telomeraseaktivitet er observert i den proliferative fase når østrogennivåer er maksimal fulgt av nær fraværende nivåer i den sekretoriske fase når progesteronnivåene er høye [13]. Et slikt bevis tyder på en sammenheng mellom kjønnshormonnivåer, modulering av telomeraseaktivitet og utviklingen av endometrial cancer.
promoter-regionen i hTERT er blitt klonet og karakterisert, og inneholder to mulige østrogen responselementer (eres), noe som tyder en direkte sammenheng mellom østrogen og telomerase regulering [2], [15] – [18]. Vi har tidligere funnet at telomeraseaktivitet og hTERT mRNA ble øket i respons til østrogen i en østrogenreseptor-α (ERα) avhengig måte i endometrial cancer-cellelinjer [2]. Videre har vi demonstrert binding av kompleks østrogen med ERα til de eres innenfor den hTERT-promoteren, en indikasjon på en mulig underliggende mekanisme mellom telomerase induksjon og ondartet transformasjon av hormonavhengige endometrieceller [2].
mitogen aktiverte protein-kinaser (MAPK) er en viktig familie av proteinkinaser som er involvert i overføring av signaler fra cellemembranen til kjernen. Det er vel kjent at P44 /42 MAPK signalveien aktiveres av mitogene stimuli fra vekstfaktorer og sex steroid hormoner slik som østrogen, progesteron, og epidermal vekstfaktor (EGF) i human bryst, ovarier og endometrial kreft celler, bl.a. [ ,,,0],19] – [21]. For å få innsikt i de molekylære mekanismene som styrer reguleringen av telomerase aktivitet av østrogen, undersøkte vi sammenhengen mellom MAPK sti og østrogen-indusert telomerase aktivitet i humane endometrial kreft celler.
Materialer og metoder
Cell Kultur og reagenser
regulering av telomerase uttrykk ble undersøkt i eR-positive (Ishikawa) og eR-negative (HEC-1B) menneskelige livmorkreft cellelinjer [22], [23]. Disse cellelinjene ble gitt som gave av Dr. Bruce Lessey (Senter for kvinne- Medicine, Greenville, SC). Som tidligere beskrevet, ble østrogen-indusert ERE kloramfenikol-acetyltransferase (CAT) aktivitet bestemt i hver av disse cellelinjer for å bekrefte funksjonell ER status [24]. Ishikawa og HEC-1B-celler ble dyrket i MEM supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i nærvær 5% CO
2 ved 37 ° C. Endometrial kreft cellelinjer ble dyrket i fenol-rød fritt medium med 0,5% trekull-dekstran-behandlet FBS for en dag før behandling med østrogen eller U0126.
Kjemi og plasmid
Alle hTERT reporter promoter luciferasepreparater plasmider ble gitt av Dr. I. Horikawa (National Institute of Health, Bethesda, MD). 17-β østradiol (E2) ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). UO126 ble kjøpt fra Calbiochem (La Jolla, California). Den anti-fosforylert p42 /44 og anti-nonphosphorylated P42 /44-antistoffer var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Den anti-β-aktin-antistoff var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). De forbedrede Chemiluminescence Western blotting gjenkjenning reagenser var fra Amersham (Arlington Heights, IL). Alle andre kjemikalier var fra Sigma (St. Louis, MO).
E2 og U0126 Behandling
Celler ble sådd på 4 × 10
5 celler per T25 kultur kolbe eller 1,5 × 10
5 celler per brønn i en 12-brønners plate inneholdende enten 5 ml eller 1,2 ml vanlig medium, respektivt. Mediet ble deretter byttet til fenol-rødt fritt medium med 0,5% strippet FBS for inkubering ved 37 ° C over natten. Umiddelbart før behandlingen ble mediet i de kulturplater aspirert, triply vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) og erstattet med friskt medium. E2 oppløst i etylalkohol eller U0126 løst i DMSO ble deretter tilsatt til hver brønn. Samtidig ble den samme mengde etylalkohol eller DMSO tilsatt til kontrollbrønnene.
Telomerase Activity Assay
Telomerase-aktivitet ble målt ved å bruke en PCR-basert telomeric gjenta amplifikasjonsprotokoll (TRAP) (TRAP -eze telomerase deteksjon kit, Oncor, Gaithersburg, MA). Kort sagt ble cellepelletene lysert, homogenisert med 105 ul iskald 1 x CHAPS, satt på is i 30 minutter, og sentrifugert ved 13000 g i 21 min ved 4 ° C. Den resulterende supernatanten ble deretter overført til et nytt rør og lagret ved -80 ° C. En prøve fra ekstraktet ble deretter tatt og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av BCA-kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Mellom 0,25 og 05 ug protein som er lagt inn i en 50 pl reaksjonsblanding ble anvendt for TRAP-analysen. Etter 30 minutters inkubering ved 30 ° C ble 27 sykluser med PCR-amplifisering utført (30 min ved 94 ° C etterfulgt av 30 minutter ved 59 ° C). PCR-produktene ble deretter analysert ved elektroforese på 10% polyakrylamidgeler for ikke-denaturerende geler. Geler ble analysert og kvantifisert ved hjelp av PhosphorImaging system med Imagequant programvare (Molecular Dynamics inc., Sunnyvale, CA). Hvert eksperiment ble utført to ganger.
Sanntids RT-PCR for hTERT
Total RNA ble isolert ved anvendelse av RNAqueous sett (Ambion, Austin, TX) og ytterligere renset ved hjelp av DNA-free sett (Ambion, Austin, TX). Revers transkripsjon og PCR-reaksjonene ble utført ved anvendelse av TaqMan gull ett-trinns RT-PCR kit i ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Revers transkripsjon ble utført ved 48 ° C i 30 minutter. PCR-betingelsene besto av en 10-minutters trinn ved 95 ° C og 40 sykluser mellom 95 ° C i 15 s og 65 ° C i 1 min. En rengjøring kontroll-genet, sur ribosomalt fosfoprotein P0 (RPLP0, også kjent som 36B4), ble anvendt som en intern kontroll for å korrigere for forskjeller i mengden av RNA i hver prøve [25]. Primere og fluorogene prober for hTERT og RPLP0 har blitt beskrevet tidligere [25]. Standardkurven for hTERT ble generert ved bruk av fortynninger av en kjent mengde av cRNA syntetisert ved
in vitro
transkripsjon av et klonet fragment. Den normaliserte nivå av hTERT i hver prøve ble beregnet ved et forhold for den hTERT nivå til RPLP0 nivå, som tidligere beskrevet [25]. Forsøk ble utført i duplikat og gjentatt to ganger for konsistens.
Western Blot analyse
Ishikawa-celler ble sådd ut i en tetthet på 3 x 10
5-celler /brønn i seks-brønns plater. Etter 24 timer, ble mediet aspirert og erstattet med serumfritt medium. Etter 24 timer ble cellene behandlet med E2, UO126 eller begge i kombinasjon i minst 15 minutter og et maksimum av 24 timer. Platene ble skrapet med RIPA buffer og cellelysatene ble utarbeidet i 2 × SDS buffer. Cellelysatene ble separert ved 12% SDS-PAGE-gel og overført til en nitrocellulosemembran. Membranen ble blokkert for en time i TBS-T + 5% fettfri tørrmelk, og deretter inkubert med phosphophorylated-P44 /42 MAPK monoklonalt antistoff (1:2000) eller pan-P44 /42 MAPK polyklonale antistoff (1:1000) over natten ved 4 ° C (Cell Signaling, Beverly, MA). Membranen ble deretter vasket i TBS-T og inkubert med et sekundært peroksidase-konjugert antistoff i 1 time. Antistoffbinding ble påvist ved hjelp av en forbedret chemiluminescence deteksjonssystem (ECL). Band netto intensiteter ble kvantifisert ved hjelp av en Millipore Digital Bioimaging System (Bedford, MA). Hvert eksperiment ble utført to ganger.
In Vitro
kinase analysen
Aktivitet av P44 /42 kinase aktivitet ble målt
in vitro
bruker P44 /42 MAP-kinase-analysesett (Cell Signaling, Danvers, MA). Kort sagt ble Ishikawa-celler sådd ut i en tetthet på 3 x 10
5-celler /brønn i seks-brønns plater. Etter E2 og UO126 behandling ble platene vasket 4 ganger med iskald PBS, og 0,5 ml iskald lyseringsbuffer 1 mM PMSF ble tilsatt til hver brønn. Cellene ble skrapet, ultralydbehandlet og sentrifugert ved 10.000 g i 10 min ved 4 ° C. Den resulterende supernatanten ble inkubert med 15 pl av resuspendert immobilisert fosfo-P44 /42 MAP kinase (Thr202 /Tyr204) monoklonalt antistoff i 12 timer ved 4 ° C. Immunkomplekset ble vasket med lyseringsbuffer 5 ganger og en gang med kinasebuffer uten substrat. Immunopresipitert MAPK ble deretter inkubert i 30 minutter ved 30 ° C i kinase-buffer med 2 ug Elk1 fusjonsprotein og 200 uM ATP. Kinasereaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 25 ul av 3 x SDS buffer. ElK1 ble separert ved hjelp av SDS-PAGE-gel, og ble deretter inkubert med anti-fosfo-Elk1 (Ser 308) antistoff ved 4 ° C over natten. Elk1 ble påvist med ECL som beskrevet for Western blot-analyse. Hvert eksperiment ble utført to ganger.
Luciferase-analyse
Transient transfeksjon av luciferase-rapportør plasmider ble utført ved bruk av TransFast Transfection Reagent (Promega, Madison, WI). I korthet, 8 x 10
4 av Ishikawa-celler ble sådd ut i 24-brønners plater over natten og transfektert med luciferase promoter plasmider (0,5 ug /brønn). PRL-SV40 (2 ng /brønn) inneholdende Renilla reniformis luciferase ble ko-transfektert i hver transfeksjon som en intern kontroll for å normalisere den transkripsjonelle aktivitet av hTERT promotor plasmider. Luciferase-assay ble deretter utført ved anvendelse av den doble luciferase reporter Assay System (Promega, Madison, WI) i henhold til protokoller levert av produsenten. Alle forsøk ble utført in triplo for hvert plasmid, og hvert forsøk ble utført to ganger.
ERK 1/2 siRNA assay
ERK 1/2 liten interfererende RNA (siRNA) ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). I henhold til produsentens instruksjoner, ble Ishikawa-celler sådd ut i 6-brønns plater eller 12-brønners plater ved den anbefalte cellekonsentrasjon. Etter 24 timer ble transfections utført på ca 60% sammenflyt ved hjelp av transfeksjon reagens (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). For hver transfeksjon reaksjon, ble 100 nM ERK 1/2 siRNA eller tak siRNA som brukes for fremstilling av siRNA transfeksjon komplekser ved romtemperatur i 15 min. Transfeksjoner ble utført i 0,5 (12-brønns plate), eller 1,5 ml (6-brønns plate) serumfritt medium i 8 timer. Etter inkubering ble transfeksjon komplekser fjernet og erstattet med de tilsvarende medium. I hvert forsøk ble det ubehandlede kontroller mottar transfeksjon reagens inkludert. Transfeksjonseffektiviteten (80% -90%) ble bestemt ved fluorescens mikroskop i fluoresceinmerkede uspesifikke siRNA transfekterte celler og ved Western blotting-analyse. Celler ble benyttet for Western blotting-analyse, TRAP analysen, lucifersae aktivitet og sanntids PCR på 36-48 timer etter transfeksjon.
Resultater
Effekten av E2 på hTERT mRNA og telomerase aktivitet i Ishikawa cellene
i Ishikawa-cellelinjen, ble E2 funnet å øke telomeraseaktivitet i en doseavhengig måte som bestemt ved TRAP-analyse (figur 1A). Den økte aktiviteten var avhengig av både E2 konsentrasjon og lengden av tid for eksponering. Når 0,1-10 uM av E2 ble tilsatt, telomerase-aktivitet ble oppregulert på 12 timer, som vedvarte inntil minst 72 timer etter behandlingen. Behandling av celler med 1-10 mikrometer av E2 i mer enn 48 timer indusert maksimal telomerase aktivitet. Ingen effekt av E2 på telomerase-aktivitet ble detektert i ERα negativ endometrial cancer cellelinje (HEC-1B), under de samme behandlingsforhold (data ikke vist).
Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av E2 (0,1 -10 uM) i 48 timer eller behandlet med 1 uM E2 i en tidsforløpet måte (A). Telomerase-aktivitet ble bestemt ved TRAP-analysen. hTERT RNA-ekspresjon ble undersøkt ved sanntids RT-PCR (B). Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD av dupliserte prøver fra minst to uavhengige eksperimenter. (ITAS = intern telomerase analysen standard, C = kontroll).
For å forstå den underliggende mekanismen for induksjon av telomerase aktivitet, vi kvantifisert ved real-time RT-PCR analyse nivået hTERT mRNA uttrykk i henhold de samme forhold. Den hTERT-genet koder for den katalytiske subenhet av telomerase og er vanligvis den hastighetsbegrensende faktor for telomerase enzymatisk aktivitet. E2 øket hTERT mRNA-ekspresjon i en doseavhengig måte (1-10 pM). Denne oppregulering av aktivitet ble observert i løpet av 6 timer etter behandling E2, og maksimal induksjon av hTERT mRNA-ekspresjon ble observert ved 48 timer. E2-indusert hTERT mRNA uttrykk forble forhøyet i mer enn 72 timer (figur 1B). Disse funnene tyder på at reguleringen av telomerase aktivitet ved E2 kan oppstå på transkripsjonsnivået i livmorkreftceller.
Effekten av UO126 på telomerase aktivitet og hTERT mRNA uttrykk i Ishikawa celler
Å adresse rollen av MAPK-reaksjonsveien i E2-indusert telomeraseaktivitet i Ishikawa-celler, vi utgangspunktet vurderes evnen til UO126, en spesifikk MEK1 og MEK2 inhibitor, for direkte å inhibere telomerase-aktivitet. I Ishikawa-celler, UO126 hemmet telomerase-aktivitet i en doseavhengig måte (0,1-10 uM) som demonstrert av TRAP-analyse (figur 2A og 2B). Parallelt redusert UO126 hTERT mRNA-ekspresjon i en doseavhengig måte, som kvantifisert ved sanntids RT-PCR (figur 2C). Disse resultater viser at UO126 er tilstrekkelig til å inhibere telomeraseaktivitet og hTERT mRNA transkripsjon i endometrial kreft celler.
Ishikawa-celler ble behandlet med UO126 ved varierende konsentrasjoner (0,1-10 uM) i 24 timer. Telomerase-aktivitet ble bedømt ved TRAP-analyse (A og B) hTERT-ekspresjon ble bestemt ved sanntids RT-PCR (C). (C = kontroll).
Effekten av UO126 på E2-indusert telomerase aktivitet og hTERT mRNA uttrykk i Ishikawa celler
For å undersøke effekten av UO126 på E2-indusert telomerase aktivitet og hTERT mRNA-ekspresjon, ble cellene behandlet med 10 pM av UO126, 1 uM av E2, eller begge i kombinasjon (10 uM UO126 + 1 uM E2) i 24 timer, og telomerase-aktivitet og hTERT ekspresjon ble deretter bestemt. Som vist i figur 3, induserte E2 øket telomeraseaktivitet og hTERT mRNA-ekspresjon til omtrent 2-3 ganger større enn kontrollene, og disse stimulerende virkninger ble nesten opphevet i nærvær av UO126 (10 uM). Disse data antyder at funksjonen av MEK-inhibitor, UO126, forekommer ikke bare ved nivået for den telomerase enzymet i seg selv, men også på transkripsjonsnivået av hTERT-genet.
Celler ble behandlet med 10 uM UO126 ( U), 1 uM E2 eller begge i kombinasjon i 24 timer. (A) Telomerase-aktivitet ble vurdert ved TRAP-analyse. (B) Telomerase-aktivitet fremstilt grafisk i å bruke TPG (totalt produkt generert) som tilsvarer relativ telomerase-aktivitet. TPG blir beregnet fra forholdet av TRAP produkt bånd til det indre telomerase prøvestandard band. (C) hTERT mRNA-ekspresjon ble bestemt ved sanntids RT-PCR. (C = kontroll).
Effekten av UO126 på E2-indusert aktivering av P44 /42
For å vurdere samspillet mellom E2 og MAPK veien, brukte vi en fosforylert-spesifikk P44 /42 MAPK-antistoff for å identifisere E2-indusert tyrosinfosforylering av disse kinaser i Ishikawa-cellelinjen. Under serum-sultet forhold, ble det observert et lavt nivå av basal tyrosin-fosforylerte former av P44 /42. Etter behandling med 1 uM E2, fosforylering av P44 /42 ble hurtig indusert og nådde maksimal induksjon 30 minutter etter behandling. Graden av fosforylering av P44 /42 forble forhøyet i omtrent 60 min (figur 4A). Den totale P44 /42 MAPK-protein nivå holdt seg konstant gjennom disse forsøk, som bestemt ved hjelp av en ikke-fosforylert antistoff til P44 /42 til de samme cellemembraner. Inkubering med 10 uM UO126 fullstendig blokkert E2-indusert fosforylering av P44 /42 (figur 4B og 4C).
Celler ble behandlet med 1 uM E2, 10 uM UO126 (U) eller begge deler i kombinasjon for minimum 15 min og maksimalt 24 timer. Fosforylering av p42 /44 ble bestemt ved Western blotting-analyse. MAPK-aktivitet ble bestemt ved immunoutfelling analyse for Elk1. E2 indusert fosforylering av p42 /44 (A) og MAPK-aktivitet i en tidsavhengig måte (D). UO126 hemmet fosforylering av p42 /44 og MAPK-aktivitet indusert av E2 (B, C og E). (C = kontroll).
For å bekrefte at den økte fosforyleringen av P44 /42 representerte den enzymatiske aktiviteten til proteinet, vi målte P44 /42 kinase aktivitet via et immunkompleks kinase analyse hvor Elk1 servert som substrat. Den Elk1 transkripsjonsfaktor er en velkjent nedstrøms mål for P44 /42 og betraktes som en markør av MAPK-aktivitet. Vi observerte en målbar økning i aktiviteten av P44 /42 etter E2 stimulering, med en maksimal topp ved 30 min. Den P44 /42 kinase aktivitet var proporsjonal med graden av fosforylering av P44 /42. UO126 redusert også P44 /42 kinase aktivitet indusert av E2 (figur 4D og 4E). Disse dataene bekrefter en sammenheng mellom E2 signalering og MAPK veien i Ishikawa cellelinje.
Effekten av E2 og UO126 på hTERT promoter aktivitet
Basert på våre tidligere arbeid i livmorkreft cellelinjer [2], kan den transkripsjonelle aktivitet av hTERT-promoteren være mediert av ERα binding til eres som ligger på denne promoter. Den regulerende promoteren Sekvensen til hTERT-genet inneholder to mulige eres i den 5 «flankerende sekvens: den distale en på -2777 /-2755 og den proksimale en på -979 /-956 som overlapper med en Sp1-bindingssetet [16], [ ,,,0],17]. For å bestemme om UO126 er involvert i regulering av hTERT promotoraktivitet indusert av E2, utførte vi en serie av forbigående transfeksjoner med luciferase reporter-plasmider inneholdende de varierende lengder av 5»-promoter-regionen til hTERT-gen. I korte trekk ble de Ishikawa-celler transfektert med ERE-responsive to reportere, hvorav den ene inneholdt både ERE områder, og den andre som inneholdt bare den proksimale ERE /Sp1 området (figur 5A). Som vist i figur 5B, økt E2 luciferaseaktiviteten fra begge reportere til omtrent 2,5 til 3 ganger større enn kontrollen. UO126 blokkerte effektivt luciferaseaktivitet fra disse reportere i nærvær av E2 (figur 5B). Disse resultatene tyder på at MAPK-reaksjonsveien er involvert i E2 /ERα-aktivering av eres i hTERT-promoteren; og således kan denne bane være kritisk i å mediere hTERT transkripsjonen aktivitet som induseres av E2.
Skjematisk diagram av hTERT promotor luciferase plasmider som viser to ERE-bindingsseter og kjerne promoter (A). Ishikawa-celler ble transfektert med hTERT promotor luciferase plasmider og luciferaseaktiviteten ble målt etter eksponering til 1 uM E2 eller 10 uM UO126 (U) i 36 timer. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD av dupliserte prøver fra minst to uavhengige eksperimenter. (C = kontroll).
Effektene av ERK1 /2-spesifikke siRNA i kombinasjon med E2 på telomerase aktivitet, hTERT uttrykk og hTERT promoter aktivitet i Ishikawa celler
For å kunne bekrefte involvering av MAPK-reaksjonsveien i E2 induksjon av telomerase-aktivitet, undersøkte vi konsekvensene av transfeksjon med ERK-1/2-spesifikk siRNA i kombinasjon med E2 på telomeraseaktivitet, hTERT uttrykk og hTERT promoter-aktivitet i Ishikawa cellelinje. ERK1 /2-spesifikk siRNA redusert fosforylering av p42 /44 indusert av østrogen ved 48 timer, bestemt ved Western blotting-analyse (figur 6A). Ved densitometrisk kvantifisering normalisert til å styre protein eIF4E, økt E2 fosforylering av p42 /44 med 29%, og E2 i nærvær av ERK1 /2 spesifikk siRNA redusert fosforylering av p42 /44 med 79%. Telomeraseaktivitet og hTERT ekspresjon ble analysert ved hjelp av TRAP-analyse og sanntids RT-PCR ved 48 timer (figur 6B og 6C). I likhet med behandling med U0126, E2 indusert økning telomeraseaktivitet og hTERT mRNA-ekspresjon til omtrent 2-3 ganger større enn kontrollene, og disse stimulerende virkninger ble nesten opphevet i nærvær av ERK 1/2-spesifikk siRNA. Lucifersae aktivitet ble analysert etter at cellene ble transfektert med ERK1 /2 siRNA i 24 timer, etterfulgt av transfeksjon med hTERT promoteren luciferase plasmid (P3915) og deretter behandling med 1 uM østrogen til 36 timer (figur 6D). Som funnet for UO126, transfeksjon med ERK-1/2-spesifikk siRNA effektivt blokkert luciferaseaktivitet fra P3915 promoter i nærvær av E2. Disse resultatene gir ytterligere bevis på det innbyrdes forholdet mellom MAPK sti og E2-mediert induksjon av hTERT transkripsjonen aktivitet.
Cellene ble enten transfektert med ERK1 /2 siRNA eller negativ kontroll (Neg) i 8 timer og deretter behandlet med 1 uM østrogen i 36-48 timer. Effekten av transfeksjon med ERK 1/2-specfic siRNA på fosforylering av p42 /P44 indusert av østrogen ble bestemt ved Western blotting ved 48 timer (figur 6A). Telomeraseaktivitet og hTERT ekspresjon ble analysert ved hjelp av TRAP-analyse og sanntids RT-PCR ved 48 timer (figur 6B og 6C). Lucifersae aktivitet ble analysert etter at cellene ble transfektert med ERK1 /2 siRNA i 24 timer, etterfulgt av transfeksjon med hTERT promoteren luciferase plasmid (P3915) og deretter behandling med 1 uM østrogen til 36 timer (figur 6D). (ITAS = intern telomerase analysen standard, C = kontroll).
Diskusjoner
Vi har tidligere vist at E2 induserer telomerase aktivitet og hTERT mRNA uttrykk i ER-positive livmorkreft cellelinjer , potensielt gjennom binding av kompleks østrogen med ERα til Eres innenfor den hTERT promoter. I denne studien ønsket vi å lokke fram den underliggende molekylære mekanismen involvert i regulering telomerase aktivitet og hTERT mRNA uttrykk indusert av E2 i ERα-positive Ishikawa cellelinje. Gitt den veletablerte forholdet mellom ERα og MAPK veien, virket det logisk at denne veien kan være involvert i induksjon av telomerase av E2.
Behandling med UO126, en svært selektiv hemmer av både MEK1 og MEK2, hemmet telomerase aktivitet og hTERT mRNA uttrykk i Ishikawa celler. Dessuten U0126 blokkerte fullstendig E2-stimulert telomeraseaktivitet og hTERT mRNA-ekspresjon. Lignende resultater ble også funnet etter transfeksjon med ERK 1/2 -spesifikk siRNA. Behandling med E2 resulterte i hurtig fosforylering av P44 /42 MAPK og øket MAPK funksjonell aktivitet, og denne effekten kan oppheves ved tilsetning av UO126. Luciferase-analyser viser at eksponering for UO126 eller ERK-1/2-spesifikk siRNA motvirket den stimulerende effekt av E2-behandling på eres som ligger i hTERT-promoteren. Derfor gir vi bevis for at E2 induserer telomerase aktivitet og hTERT mRNA uttrykk i ERα-positive endometrial kreft celler som er avhengig av signale gjennom MAPK veien. Så vidt vi vet, har bare en annen studie innblandet et samarbeids rolle for MAPK i reguleringen av hTERT med ER, og dette var spesielt for ERβ i humane bukspyttkjertelen cellelinjer [26].
En rekke studier har vist at responsen av målgener til østrogen er avhengig av flere viktige faktorer, inkludert arten av østrogen reseptor, ligand og celle sammenheng target genpromoteren og spesifikke transkripsjonsfaktorer, så vel som midler som påvirker protein kinase-aktivering og protein-fosforylering [2] , [16], [27] – [29]. Den menneskelige hTERT promoter inneholder en ufullkommen østrogenrespons element (ERE) og et ERE /SP1 halv side. Vi og andre har funnet at østrogen-induserte hTERT genekspresjon og telomeraseaktivitet kan resultere fra den direkte binding av ERα til to ERE områder som ligger i promoterregionen av hTERT-genet [2], [15] – [17]. I tillegg til eres, besitter denne regionen konsensussekvenser for binding av transkripsjonsfaktorer så som Sp1, Ap2, AP4, c-Myc, NF-1 og E-box [8], [29] – [31]. Det har blitt demonstrert at E2 aktivering av kjernen hTERT-promoteren kan være fullstendig eliminert når c-myc områder er opphevet ved mutasjoner [16]. E2 er også blitt funnet å vesentlig aktivere c-Myc-promoteren i luciferase-analyser ved bruk av c-myc-promoter-rapportør plasmider [16]. Basert på denne kulminerte bevis, kan det bli postulert at østrogen kan mediere hTERT transkripsjonen aktivitet gjennom ERα direkte bindings eres i hTERT promoter eller alternativt ved E2-aktivering av transkripsjonsfaktorer som kommuniserer med denne promoter, eller mest sannsynlig via en kombinasjon av begge mekanismer.
MAPK signalkaskade regulerer en rekke cellulære aktiviteter, inkludert cellevekst, differensiering, overlevelse og celledød. Denne veien er antatt å være viktig for reguleringen av ERα transkripsjon, blant annet en ny mekanisme ved hvilken ERα og ERK2 co-lokalisering ved kromatin bindingsseter og samarbeide i reguleringen av hormonet stimulering av proliferasjon [32], [33]. Østrogenreseptor signalering og aktivering av MAPK-reaksjonsveien har også vært implisert i utvikling og progresjon av hormonelt-drevne kreftformer, slik som brystkreft og livmorkreft. Progesteron er blitt funnet å inhibere den østrogen-induserte aktivering av telomerase-aktivitet i bryst- og endometrial cancer-cellelinjer [34], og den MAPK reaksjonsveien ble vist å være delvis ansvarlig for den antagonistiske virkning. Tamoxifen, et felles adjuvant terapi for brystkreft, har østrogen-lignende egenskaper i livmorvev, og er assosiert med en øket risiko for endometrial cancer. Behandling av endometrial kreft celler med tamoksifen har blitt vist å føre til induksjon av telomerase-aktivitet som kan bli effektivt blokkert av en MEK-inhibitor. SP1 bindingssteder og ETS familiemedlem motiver har blitt funnet i hTERT promoter 5′-flankerende sekvens [30], [35] – [37], og disse representerer potensielle transkripsjonsfaktorer som er målrettet av MAPK sti og kan induseres gjennom østrogen og progesteron signalering.
