Abstract
kreft stamceller (cscs) er ansvarlig for kreft progresjon, metastaser, og gjentakelse. Til dags dato, de spesifikke markører for cscs forbli uoppdaget. Målet med denne studien var å identifisere nye biomarkører for mage cscs for klinisk diagnose ved hjelp av proteomikk-teknologi. CSC-lignende SP-celler, OCUM-12 /SP-celler, OCUM-2MD3 /SP-celler, og de overordnede OCUM-12-celler og OCUM-2MD3 celler ble anvendt i denne studien. Protein lysates fra hver cellelinje ble analysert ved hjelp QSTAR Elite væskekromatografi med Tandem massespektrometri, kombinert med isobariske koder for relativ og absolutt kvantifisering teknologi. Kandidat proteiner oppdaget av proteomikk-teknologi ble validert ved immunhistokjemisk analyse av 300 mage kreft. Basert på resultatene av LC-MS /MS, åtte proteiner, inkludert RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, og KRT18, var oppregulert i begge OCUM-12 /SP celler og OCUM-2MD3 /SP celler når sammenlignet med de tilsvarende overordnede celler. RT-PCR-analyse viste at uttrykket nivået av
RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
, og
CK18
var høy i OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP, i forhold til kontroll av overordnede OCUM-12 og OCUM-2MD3. Disse proteinene var signifikant assosiert med avansert invasjon dybde, lymfeknutemetastase, fjernmetastaser eller avansert klinisk stadium. RBBP6, DCTPP1, HSPA4, og ALDOA uttrykk spesielt var signifikant assosiert med dårlig prognose i 300 mage kreftpasienter. RBBP6 var fast bestemt på å være en uavhengig prognostisk faktor. Bevegeligheten-stimulerende evne OCUM-12 /SP celler og OCUM-2MD3 /SP celler ble hemmet av
RBBP6
siRNA. Disse funnene kan tyde på at de åtte proteiner, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, og KRT18, utnytte komparative proteomikk analyse, ble oppfattet å være potensielle CSC markører for magekreft. Av de åtte kandidat proteiner, ble RBBP6 foreslått å være en lovende prognostisk biomarkør og et terapeutisk mål for magekreft
Citation. Morisaki T, Yashiro M, Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et al. (2014) Sammen Proteomics Analyse av magekreft stamceller. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10,1371 /journal.pone.0110736
Redaktør: Anita B. Hjelmeland, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 3 mai 2014; Godkjent: 16 september 2014; Publisert: 07.11.2014
Copyright: © 2014 Morisaki et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer. Deponeringsnummer for protein data inngår som Uniprot /Swiss-Prot i tabell 2.
Finansiering: Denne studien er delvis finansiert av KAKENHI (Grant-i-Aid for Scientific Research, Nos 22390262, 23390329, og 26293307. ), av National Cancer Center Research and Development Fund (23-A-9), og etter prioritet forskningsfond av Osaka City University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft stamceller (cscs) er definert som en unik undergruppe i svulster som har evnen til å initiere tumorvekst og opprettholde selvfornyelse [1]. Det er blitt foreslått at de kan føre til at den heterogene avstamning av kreftceller som inngår i svulsten, så vel som å spille en viktig rolle i progresjon av ondartet karsinom, slik som fjernmetastaser, gjentakelse, og chemoresistance [2] – [4]. Cscs ble først identifisert i akutt myeloid leukemi [5], men har nylig blitt rapportert å eksistere i en rekke forskjellige krefttyper, inkludert magekreft [6]. Identifiseringen av CSC markører kan åpne en ny terapeutisk perspektiv på basis av selektivt rettet mot denne lille populasjon av celler [7], [8]. Nylig har det blitt rapportert at cscs muligens uttrykker sine egne unike markører, for eksempel aldehyd-dehydrogenase 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], og CD133 [12]. Men mange av de publiserte markørene er ikke unikt for cscs. Kvantitativ protein uttrykk profilering tillater effektiv identifisering av nøyaktige og reproduserbare differensial uttrykk verdier for proteiner [13]. Isobariske koder for relativ og absolutt kvantifisering (iTRAQ) kombinert med flerdimensjonal væskekromatografi (LC) og tandem massespektrometri (LC-MS /MS) analyse fremstår som en kraftfull metode i jakten på kreft biomarkører [14]. Vi har tidligere rapportert at side befolkningen (SP) celler er i stand til å fornye seg selv og produsere ikke-SP celler, og at kreftceller i SP fraksjoner har stort potensial for tumorigenicity, fjernmetastaser [3], og chemoresistance [2]. Dette tyder på at SP celler av magekreft har kreft stamcellelignende egenskaper. Derfor er målet med denne studien var å påvise en ny CSC markør (er) av magekreft ved å sammenligne proteom hos foreldreceller og stamcellelignende SP-celler som har vært kjent for å ha en rik CSC befolkning [15].
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC
To mage kreft cellelinjer, OCUM-2MD3 [16] og OCUM-12 [17], ble brukt i denne studien. Disse cellelinjer ble avledet fra diffus-type magekreft. Kulturen tilstand ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM; Nikken, Kyoto, Japan) med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum (FCS, Life Technologies, Grand Island, New York), penicillin og streptomycin, og 0,5 mM natriumpyruvat, og inkubert ved 37 ° C. OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP cellelinjer var SP celler som ble evaluert av en flowcytometrisk analyse ved hjelp av Hoechst 33342 fra sine foreldre cellelinjer, OCUM-2MD3 og OCUM-12, henholdsvis. Sortering ble utført tre ganger for å etablere en stabil bestand av SP-beriket celler. Etter en tre måneders inkubasjonstid postsortering, OCUM-12 /SP-celler (6,5%) og OCUM-2MD3 /SP-celler (12,2%) representerte fremdeles en høy prosentandel av SP fraksjonen, sammenlignet med moder OCUM-12 (3,2% ) og OCUM-2MD3 (6,3%) celler (Figur S1). Deretter disse SP-beriket celler med en stabil befolkning var de cellelinjer som benyttes for analyse, som tidligere rapportert [18].
Menneskelige vevsprøver og Pasientinformasjon
Vevsprøver ble oppnådd fra 300 pasienter diagnostisert med magekreft tillatte operasjoner på Osaka City University. Tabell 1 viser egenskapene til de clinicopathologic 300 magekreftpasienter. Det var 208 mannlige og 92 kvinnelige pasienter, med median alder på 64 år (fra 28-85 år) på tidspunktet for operasjonen. Diagnosene ble bekreftet av minst to personer. Staging ble fastsatt i samsvar med den japanske klassifisering av magekreft (14
th edition) [19]. Denne studien ble godkjent av Osaka City University etiske komité (Osaka, Japan). Skriftlig informert samtykke fra donor ble oppnådd for bruk av denne prøven i forskning.
Protein identifikasjon og kvantifisering av QSTAR Elite LC-MS /MS
Kreftcellene (60 mikrogram hver ) ble homogenisert og deretter lysert ved hjelp av enten 100 ul av T-PER lyseringsbuffer (Thermo Scientific) eller 500 pl av 9 M urea og 2% CHAPS lyseringsbuffer med en protease inhibitor. Deretter cellelysatet ble deretter behandlet ved ultralydbehandling. Etter utfelling aceton, ble proteinkonsentrasjonen målt ved BCA proteinanalyse (Pierce, IL, USA). Reduksjon, alkylering, fordøyelse, og påfølgende peptid merking av 50 ug av protein for hver prøve ble utført ved anvendelse av AB Sciex iTRAQ Reagens Multi-Plex Kit (AB Sciex, Concord, ON, Canada) [20]. De iTRAQ-merkede prøver ble lastet på en ICAT kationerbytter kassett (AB Sciex). Peptidene ble eluert som seks fraksjoner (1 ml KCL oppløsning av 10, 50, 70, 100, 200, og 350 mM), og supernatanten av hver ble avdampet i en vakuumsentrifuge. Prøvene ble deretter avsaltet og konsentrert ved hjelp av Sep-Pak Lett C18 patron (Waters Corporation, Milford, MA), inndampet i en vakuumsentrifuge, resuspendert i 20 ul 0,1% (v /v) maursyre, og deretter påført på QSTAR Elite LC -MS /MS. Hver prøve ble kjørt i 150 minutter. MS /MS data ble søkt mot sveitsiske Protein database (human) bruker ProteinPilot programvaren (versjon 2.0, AB Sciex) med trypsin angitt som fordøyelsen enzymet og metyl methanethiosulfinate som cystein modifisering. For å fjerne overflødige treff og komparativ kvantifisering, ble søkeresultater oppnådd bearbeides videre ved ProteinPilot programvare ved hjelp av Paragon algoritme. Dette resulterte i minimalt sett med forsvarlige identifiserte proteiner. Alle rapporterte data ble brukt med 95% sikkerhet cut-off grensen. Relativ kvantifisering av peptider ble beregnet som et forhold ved å dividere iTRAQ reporter intensitet. Forholdet mellom peptider som støtter eksistensen av en protein ble midlet for den relative proteinkvantifisering. Deretter ble den ProteinPilot analyse og oppfinnsomhet pathway analyse (IPA) (Oppfinnsomhet System, Mountain View, California) utføres. Etter å ha utført en enkel t-test på en av de beregnede gjennomsnitts protein-forhold mot en for å vurdere validiteten av protein uttrykk forandringer, ble en p-verdi rapportert. Protein-forhold med en p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som pålitelige. Det bør være kjent at i 90% av iTRAQ eksperimentelle kjøringer gjort tidligere, standardavvikene proteinforhold, som stammer fra tekniske variasjoner, ble rapportert å være mindre enn 0,3. Derfor endrer uttrykk som er større enn 1,2 ganger eller mindre enn 0,8 ganger så normaliserte uttrykk nivåer ble vurdert å være utenfor omfanget av teknisk variabilitet. Vi utførte også et ikke-merket analyse, og detektert tilstedeværelse av proteiner bare innenfor OCUM-12 /SP-celler og OCUM-2MD3 /SP-celler, men ikke innenfor foreldreceller [21]. Hver prøve ble kjørt to ganger. Det påførte LC-MS /MS-undersøkelse kombinert med iTRAQ teknologi har blitt rapportert som en pålitelig kvantitativ metode for proteinekspresjon, som er enda mer følsom enn den western blot som avhenger av typen av anvendt antistoff [22].
IPA og utvelgelse av kandidat proteiner
IPA database brukes primært innen proprietære ontologi, som inneholder opptil 300.000 biologiske artikler inkludert gener, proteiner, molekylære og cellulære prosesser. Derfor IPA ble anvendt for analyse av proteinmolekyl funksjoner, lokalisering. I tillegg ble detaljert informasjon angående funksjonene og cellulære plasseringer av de identifiserte proteiner erholdt. Basert på resultatene av LC MS /MS og IPA analyser, proteiner som ble observert til å være over-uttrykt i SP cellelinjer, sammenlignet med deres tilsvarende frekvens av ekspresjon i modercellelinjene, ble valgt som kandidat biomarkører for SP-celler av magekreft. Identifiseringen av nettverk av samspill proteiner, så vel som funksjonelle grupper og trasé ble generert av IPA, og analysen avhenger av tidligere karakteriserte assosiasjoner.
Kvantitativ Sanntids revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR )
Gastric kreftceller ble dyrket. Og totalt cellulært RNA ble ekstrahert ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Carlsbad, CA). cDNA ble fremstilt fra 2 pg RNA ved hjelp av tilfeldige primere (Invitrogen). For å bestemme fold endringer i hvert gen, ble RT-PCR utføres på ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), med kommersielt tilgjengelig genekspresjon analyser (Applied Biosystems) for
RBBP6 product: (
retinoblastom bindende protein 6
; Hs00544663),
HSPA4 product: (
heat shock 70kDa protein 4
; Hs00382884),
HSPA9 product: (
heat shock 70 kDa protein 9
; Hs00269818),
GLG1 plakater (Golgi glykoprotein 1; Hs00939452),
DCTPP1 product: (
dCTP Pyrophosphatase en
, Hs00225433),
VPS13A
(
vacuolar protein sortering 13 homolog A
; Hs00362891),
CK18 (keratin 18
; Hs028277483),
ALDOA (aldolase A
; Hs00605108),
CD44 product: (Hs01075862),
CD133 plakater (Hs01009250) og
Nanog plakater (Hs02387400). GAPDH (SIGMA) ble anvendt som en intern standard for å normalisere mRNA-nivåer. Den terskel syklus (Ct) verdiene ble anvendt for å beregne de relative uttrykk forholdene mellom kontroll og behandlede celler.
Western blot-analyse
Ekspresjon nivå av RBBP6 og ALDOA i kreftceller ble undersøkt som følger. Cellelysater ble samlet etter ulike behandlinger. Etter at proteinkonsentrasjonen av hver prøve ble justert, ble elektroforese utført ved anvendelse av 10% Tris /Gly-geler (Life Technologies, Carlsbad, CA). Proteinbåndene ble oppnådd ble overført til en Immobilon-P Transfer membran (Amersham, Aylesbury, UK). Deretter ble membranen plassert i PBS-T-løsning inneholdende anti-RBBP6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-ALDOA (HPA004177, ATLAS), og anti-β-aktin (1:300 fortynning; Sigma- Aldrich), og tillatt å reagere ved romtemperatur i 2 timer. Nivåene av spesifikke proteiner i hvert lysat ble oppdaget av forbedret chemiluminescence hjelp ECL pluss (Amersham) etterfulgt av autoradiografi.
Små interfering RNA Design
Sekvensene for
RBBP6
liten interfererende RNA (siRNA) er utformet som følger: si
RBBP6
forstand, 5′-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 «; antisense, 5’AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 «, og nontargeting siRNA (negativ-siRNA) ble kjøpt fra Ambion (Life Technologies, Carlsbad, California) .OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP celler ble utarbeidet ved 60% samløpet i seks-brønns retter. Transfeksjon Blandingen ble fremstilt ved å tilsette 150 ul av OPTI-MEM med 9. ul Lipofektamin RNA iMAX Regant (Life Technologies) i 150 ul av OPTI-MEM inkludert 90 pmol av siRNA og inkubering i 5 minutter ved romtemperatur. Til slutt ble den ovennevnte transfeksjon blandingen ble tilsatt til klare for seks-brønners skål. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble RT-PCR utføres.
sårhelende analysen
Kreftceller ble dyrket i 96-brønners plater (Essen Instruments, Birmingham, UK). Etter at cellene nådde semi-konfluens, ble et sår laget i cellemonolaget med den 96-brønns ved WoundMaker (Essen Bioscience, MI, USA). Ripete felt ble tatt avbildet hver 3 timer og ble overvåket med Incucyte live-Cell Imaging System og programvare (Essen Instruments). Graden av celleoverføringer ble analysert 24 timer etter sårbehandling som en prosent av viklet konfluens. Gjennomsnittet av 4 felt ble beregnet som prøven verdi.
Invasion analysen
Vi brukte chemotaxicell kamre (Kubota, Osaka, Japan) med en 12-mikrometer pore membranfilter belagt med 50- ug Matrigel (Collaborative Research Co, Bedford, MA). Kammeret (øvre komponent) ble plassert i en 24-brønners dyrkingsplate (lavere komponent). Gastrisk kreft celler ble resuspendert til en sluttkonsentrasjon på 5 x 10
3 celler /ml. Neste, 500 mL lavere komponenter. Etter inkubering i 48 timer ble kreftcellene på den øvre overflaten av membranen fjernet ved å tørke og farget med hematoksylin. Kreftceller som invaderte gjennom et filter belagt med Matrigel i den nedre membranen er manuelt tellet under et mikroskop ved 200 x forstørrelse. Seks tilfeldig utvalgte felt ble telt for hver analyse. Gjennomsnittet av fire felt ble beregnet som prøveverdi. For hver gruppe, ble kultur gjort i tre eksemplarer.
Validering av Protein Expression av Immunohistochemistry
Immunohistokjemi ble utført på formalinfiksert, parafininnstøpte vevsprøver som ble deparaffinized i xylen og dehydrert gjennom gradert etanol. Seksjonene ble oppvarmet i 10 minutter ved 105 ° C etter autoklav i Target Retrieval Solution (DAKO). Prøvene ble deretter inkubert med 3% hydrogenperoksid for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet. De følgende antistoffer ble anvendt i immunhistokjemisk prosessen: anti-RBBP6 (retinoblastoma binding protein 6; WH0005930M1, 6:1000; Sigma-Aldrich), anti-GLG1 (Golgi glykoprotein 1; HPA010815, 1:80; ATLAS), anti-VPS13A (fruktose-aldolase A,, HPA004177, 1:400, ATLAS), anti-ALDOA (Novus Biologicals vacuolar protein sortering 13 homolog A;; NBP1-85642, 1:500), anti-DCTPP1 (dCTP Pyrophosphatase 1; HPA002832, 1:200, ATLAS), anti-HSPA9 (heat shock 70 kDa protein 9; HPA000898, 1:200, ATLAS), anti-HSPA4 (heat shock 70kDa protein 4; HPA010023, 1:200, ATLAS), og anti-KRT18 (keratin 18; ab668, 1:500, Abcam). Prøvene ble inkubert med hvert antistoff over natten ved omtrent 4 ° C. Deretter ble prøvene ble inkubert i bevilget immunoglobulin G i 10 minutter, etterfulgt av tre vaskinger med PBS. Alle prøvene ble deretter behandlet med streptavidin-peroksydase reagens og inkubert i PBS diaminobenzidin og 1% hydrogenperoksyd (vol /vol), fulgt av kontra med Mayers hematoksylin.
Immunhistokjemisk Evaluation
RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, og KRT18 uttrykk nivåer ble evaluert av både intensiteten i farging og andel fargede tumorceller. Den fargeintensitet ble scoret på en skala fra 0-3 (0 = ingen, 1 = mild, 2 = moderat, 3 = intens). Farging proporsjoner ble scoret på en skala fra 0-4 (andelen var annerledes med hver antistoff) basert på prosentandelen av positivt fargede celler. Derfor ville det endelige flekker poengsum, som ble regnet som et multiplum av fargeintensitet score og farging andelen score, være på en skala fra 0-12. Expression nivåer av DCTPP1 ble betraktet som positive når det fikk en score på 3. uttrykk nivåer av HSPA4 ble betraktet som positive når det fikk en score på 6. uttrykk nivåer av ALDOA, KRT18, VPS13A, og GLG1 ble betraktet som positive når hver fikk en score på 8. RBBP6, evalueringen av hvilke bare fargings andelen resultatet ble anvendt for beregning, ble betraktet som positive når den har mottatt en score på 3. HSPA9, evalueringen av hvilke bare fargingsintensitet ble benyttet for beregningen, ble betraktet som positive når den fikk en score på 3. Alle evalueringer ble gjort av to observatører som var uvitende om kliniske data og resultat. Når et avvikende evaluering mellom de to uavhengige observatører ble funnet, ble lysbildene kontrolleres på nytt og revurderes etter diskusjon.
Statistical Analysis
SPSS programvare (SPSS Japan, Tokyo, Japan) ble brukt for dataanalyse. Statistisk signifikans av assosiasjoner mellom ekspresjonen av proteiner og de forskjellige clinicopathological variabler, inkludert alder, kjønn, makroskopisk typen, tumor differensiering, totalt antall resected lymfeknute, og type kirurgi (D1 eller D2 gastrektomi) ble evaluert ved bruk av Fisher og Chi -squared tester. Overlevelseskurver ble beregnet ut fra operasjonsdagen til tidspunktet for død eller til den siste oppfølging observasjon ved hjelp av Kaplan-Meier metoden. I tillegg ble noen forskjeller mellom overlevelseskurver vurdert ved hjelp av log-rank test. Multivariate analyser ble utført i henhold til Cox regresjonsmodellen å bestemme sammenhengen mellom clinicopathological variabler og dødelighet. P-verdier for 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Den stemness av magekreftcellelinjer
De prosenter av SP celler var høyere i OCUM-12. /SP og OCUM-2MD3 /SP celler enn i foreldrenes OCUM-12 og OCUM-2MD3 celler (Figur S1). Cancer stilk cellemarkører med SP-celler, OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP, slik som CD44, CD133, og Nanog, ble analysert ved RT-PCR. Ekspresjonsnivået av disse markørene var signifikant økt i begge cellelinjer SP, i sammenligning med de overordnede cellelinjer (figur S2). Antallet spheroid kolonien var signifikant høyere i begge OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP celler enn sine foreldre OCUM-12 og OCUM-2MD3 celler (data ikke vist).
Påvisning av søker Proteiner
Vi har undersøkt hvorvidt proteiner ble forskjellig eller uavhengig uttrykt i SP celler, og sammenlignet våre funn til de av sine foreldre celler ved hjelp QSTAR Elite LC-MS /MS. I analysere biologiske prosesser, og med 95% sikkerhet cut-off grense og p 0,05, identifiserte vi at proteiner ble faktisk uttrykt forskjellig. Resultatene av disse funnene er presentert i figur 1. De fleste av proteinene ble over-uttrykt i cytoplasma av tumorceller (figur 1A). P verdi i oppfinnsomhet analysen er angitt i tabell S1. Disse proteinene ble funnet å være relatert til cellulære prosesser, slik som celledød, metabolisme, cellulær organisasjon, DNA-metabolisme, proteindegradering, og prosessering av RNA (figur 1B). . De øverste kanoniske trasé forbundet med disse målene og identifisert med IPA er vist i Tabell S2
(A) Lokalisering; (B) Biologiske prosesser av identifiserte proteiner. Vi kategorisert proteiner basert på deres funksjonelle oppgaver ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis. De molekylære funksjoner rapportert inkluderer celledød, metabolisme, cellular organisasjon, metabolisme av DNA, protein degradering, bearbeiding av RNA, produksjon av reaktive oksygenforbindelser, nitrogenoksid, molekylær transport, cellesyklus, folding protein, og cellulær bevegelse. % = 100 X antall identifiserte proteiner /alle 932 proteiner analysert. (C), A Venn-diagram konferere Tabell 2. Forty proteiner ble betydelig økt i OCUM-12 /SP celler i forhold til sine foreldre OCUM-12 celler. Trettifem proteiner ble betydelig økt i OCUM-2MD3 /SP celler i forhold til sine foreldre OCUM-2MD3cells. Åtte kandidat proteiner, RBBP6, HSPA4, HSPA9, GLG1, DCTPP1, VPS13A, CK18 og ALDOA, overlapping i både OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP celler. (D), mRNA-ekspresjon. RT-PCR-analyse viste at uttrykket nivået av
RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
, og
CK18
var høy i OCUM-12 /SP (9,15 ganger, 9,36 ganger, 4,14 ganger, 7,80 ganger, 2,08 ganger, 1,46 ganger, 3,44 ganger, og 1,99 ganger, henholdsvis) og OCUM-2MD3 /SP (6,15 ganger, 1,71 ganger 2,33 ganger, 2,30 ganger, 2,03 ganger, 1,32 ganger, 1,35 fold, og 1,31 ganger, henholdsvis), i forhold til kontroll av overordnede OCUM-12 og OCUM-2MD3. (E), Korrelasjonen av signalveier mellom RBBP6 og Forskjellig-uttrykte proteiner i CSC-lignende SP celler. RBBP6 er over-uttrykt (rød) i CSC-lignende SP celler (OCUM-12 /SP celler og OCUM-2MD3 /SP celler). HSP90, HSPA4, og TAGLN2 (rosa) oppregulert i CSC-lignende SP celler var assosiert med RBBP6 signalveien.
Når forhold til sine respektive moderceller, 40 proteiner var oppregulert i OCUM-12 /SP, og 35 proteiner var oppregulert i OCUM-2MD3 /SP. Blant disse proteinene, åtte var oppregulert i begge OCUM-12 /SP celler og OCUM-2MD3 /SP celler, mens ingen slik sammenheng ble observert mellom de tilhørende overordnede celler (tabell 2 og figur 1C). Av disse åtte proteinene, de tre proteiner, RBBP6, GLG1, og VPS13A, ble uavhengig av hverandre detektert i både SP cellelinjer, men ikke i deres tilsvarende stamceller. De fem proteiner, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, og KRT18, var betydelig over uttrykt av minst 1,2 ganger i både SP celler i forhold til sine respektive moderceller.
mRNA uttrykk nivået av disse 8 kandidatmolekyler,
RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
, og
CK18
ble økt i OCUM-12 /SP (9,15 ganger 9,36 ganger, 4,14 ganger, 7,80 ganger, 2,08 ganger, 1,46 ganger, 3,44 ganger, og 1,99 ganger, henholdsvis) og OCUM-2MD3 /SP (6,15 ganger, 1,71 ganger 2,33 ganger, 2,30 ganger, 2,03 ganger, 1,32 ganger, 1,35 ganger, og 1.31 fold, henholdsvis) celler, sammenlignet med de av kontrollen av moder OCUM-12 og OCUM-2MD3 celler (figur 1D). Western blot analyse indikerte at uttrykket nivået av RBBP6 og ALDOA var høy i cum-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP celler, sammenlignet med at OCUM-12 og OCUM-2MD3 celler (Figur S3).
nettverket vist i figur 1E ble generert av IPA, og analysen avhenger av tidligere karakteriserte og rapportert protein interaksjoner. Således RBBP6, som ble observert til å være over-uttrykt i CSC-lignende SP-celler, OCUM-12 /SP-celler og OCUM-2MD3 /SP-celler, var direkte knyttet til HSPA4 og Rb, og indirekte forbundet med HSP90 og TAGLN2. HSPA4, HSP90 og TAGLN2 ble også funnet å være oppregulert i CSC-lignende SP celler.
Effekt av siRBBP6 transfeksjon på migrasjon og invasive evner av magekreftceller
Figur 2A viser at si
RBBP6
transfeksjon betydelig redusert mRNA uttrykk nivå av både SP cellelinjer (OCUM-12 /SP var 12%, p 0,01, OCUM-2MD3 /SP var 2,5% p. 0,01), i forhold til at negativ-siRNA transfeksjon.
RBBP6
siRNA knockdown betydelig redusert invasjonen (figur 2B) og migrering aktivitet (figur 2C) av begge SP-celler.
(A), OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP viste høyere nivå av
RBBP6
mRNA uttrykk enn sine foreldre celler, OCUM-12 og OCUM-2MD3. RBBP6 uttrykk i OCUM-12 /SP og OCUM-2MD3 /SP celler ble effektivt nedregulert ved si
RBBP6
transfeksjon. (B), Representative bilder av invaderende OCUM-12 /SP celler viste antall kreftceller invadere pore membranfilter ble redusert med
RBBP6
siRNA behandling. si
RBBP6
transfeksjon for OCUM12 /SP celler betydelig hemmet invasjonen evner. Data er presentert som gjennomsnitt og SD (feilfelt) på fire forsøk. *
p
0,05, **
p
0,01. (C), si
RBBP6
behandling for OCUM12 /SP og OCUM-2MD3 /SP celler betydelig hemmet migrasjon evner, sammenlignet med den for kontroll av
negativ-siRNA
behandling. Data er presentert som gjennomsnitt og SD (feilfelt) på fire forsøk. *
p
0,05, **
p
. 0,01
Immunhistokjemisk Vurdering av søker Proteiner og deres forening med Clinicopathological funksjoner
RBBP6, DCTPP1, og HSPA9 ble observert å være først og fremst uttrykt i cytoplasma og kjerner av mage kreftceller. GLG1, VPS13A, HSPA9, HSPA4, ALDOA, og KRT18 ble observert å være først og fremst uttrykt i cytoplasma (figur 3A). I normale epitelceller, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, og HSPA9 uttrykk ble funnet noen celler i epitel kjertel. KRT18 ble uttrykt i de fleste epitelceller. HSPA4 og ALDOA uttrykk ble ikke funnet i normale celler. BBP6, DCTPP1, og HSPA9 ble uttrykt i cytoplasma og kjerner av normale epitelceller. GLG1, VPS13A, HSPA9, og KRT18 ble observert i cytoplasma av epitelceller (figur 3B).
(a) Uttrykk i kreftceller. RBBP6, DCTPP1, og HSPA9 ekspresjon ble observert i første rekke i cytoplasma og cellekjernen. GLG1, VPS13A, HSPA4, ALDOA, og KRT18 ble uttrykt i cytoplasma. (B) Ekspresjon i epitelceller. RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, og HSPA9 uttrykk ble funnet noen celler i epitel kjertel. KRT18 ble uttrykt i de fleste epitelceller. HSPA4 og ALDOA uttrykk ble ikke funnet i normale celler.
Vi har utforsket sammenhengen mellom uttrykket nivået av de åtte kandidat proteiner og clinicopathological funksjoner. Antall saker til hvert rente for de åtte målene ble vist i tabell S3. Disse åtte proteiner ble fast bestemt på å bli assosiert med potensielt ondartede prosesser, for eksempel fjernmetastaser, lymfeknute (LN) metastase, invasjon dybde, eller scene avansement (tabell 3). De beregnede p-verdier var som følger: RBBP6 var signifikant assosiert med invasjon dybde (p 0,001), LN metastase (p 0,001), fjern metastase (p = 0,013) og klinisk stadium (p 0,001); GLG1 var signifikant assosiert med bare fjernmetastaser (p = 0,045). VPS13A var signifikant assosiert med invasjon dybde (p = 0,005), LN metastase (p 0,001), og scenen avansement (p = 0,005); DCTPP1 var signifikant assosiert med invasjon dybde (p 0,001), LN metastase (p 0,001), fjernmetastaser (p 0,001), og scenen avansement (p 0,001); HSPA9 var signifikant assosiert med invasjon dybde (p 0,001), LN metastase (p 0,001), og scenen avansement (p 0,001); HSPA4 var signifikant assosiert med invasjon dybde (p 0,001), LN metastase (p 0,001), fjernmetastaser (p = 0,007), og scenen avansement (p 0,001); ALDOA var signifikant assosiert med invasjon dybde (p = 0,034), LN metastase (p = 0,004), og scenen avansement (p = 0,029); og KRT18 var signifikant assosiert med invasjon dybde (p = 0,001), LN metastase (p = 0,001), fjernmetastaser (p = 0,034), og scenen avansement (p = 0,004).
Prognose
Kaplan-Meier plott antydet at av de åtte over uttrykte proteiner, RBBP6, DCTPP1, HSPA4, og ALDOA, var signifikant assosiert med dårlig overlevelse hos alle pasienter (figur 4). Den kumulative fem års total overlevelse rate av RBBP6-positive tilfeller (61%) var signifikant mindre (p = 0,002) enn for RBBP6-negative tilfeller (78%). Videre, i pasienter ved stadium III, den totale overlevelsen av RBBP6-positive tilfeller var betydelig mindre (p = 0,034) enn for RBBP6-negative saker. Prognosen for pasienter med DCTPP1-positive tumorer (63%) var vesentlig dårligere (p = 0,016) enn for DCTPP1-negative tumorer (75%). De fem-års overlevelse rate av HSPA4-positive tilfeller (66%) var signifikant mindre (p = 0,047) enn for HSPA4-negative tilfeller (75%). De fem-års overlevelse rate av ALDOA-positive tumorer utstilling over-uttrykk (61%) var signifikant dårligere (p = 0,043) enn for ALDOA-negative tumorer (72%). Derimot ble det ikke observert noen signifikante sammenhenger mellom andre proteiner og pasient overlevelse. Etter univariat analyse, ble RBBP6, DCTPP1, HSPA4, og ALDOA uttrykk nivåer signifikant assosiert med dårlig prognose i 300 mage kreftpasienter (tabell 4). I tillegg makroskopiske type (type 4), histologisk type (diffus), T kategori (T2-4), kar invasjon, infiltrasjon mønster (INF b, c), peritoneal metastase, og LN metastaser ble bestemt til å være signifikant assosiert med en dårlig prognose. Multivariat analyse ble utført ved hjelp av Cox modell for alle vesentlige variabler i univariate analysen. Ved analyse ferdigstillelse, RBBP6 uttrykk (p = 0,023), Borrmann type 4 (p 0,001), bukhule positive (p = 0,001), LN metastase (p = 0,003), og levermetastaser (p = 0,001) ble bekreftet som uavhengige faktorer korrelert med overlevelse (tabell 3).
