Abstract
Semaphorin signaliserer gjennom Plexin ofte deltar i tumorigenesis og ondartet progresjon i ulike typer kreft. Spesielt rollen semaphorin signalisering i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) forblir uutforsket, til tross for en høy sannsynlighet for metastasering og dødelighet. I motsetning til andre epiteliale ondartede sykdommer som ofte uttrykker et lite antall av spesifikke gener i Semaphorin /Plexin familien, er fem eller mer ofte uttrykt i humane PDAC. Slik samtidig ekspresjon av disse SEMA3 /Plexin familiemedlemmer er ikke et resultat av genamplifikasjon, men (i det minste delvis) av økt gentranskripsjon aktivert ved SOX4 de novo uttrykt i PDAC. Via kromatin-immunoutfelling, luciferase promoter aktivitetsanalysen og elektroforese mobilitet shift assay blir SOX4 vist å binde til konsensus-sete ved promoteren av hver
SEMA3
og
Plexin
gen for å øke transkripsjonen aktivitet. Motsatt er RNAi-knockdown av SOX4 i PDAC cellelinjer resulterer i redusert uttrykk for SEMA3 /Plexin familiemedlemmer og forbundet med begrenset tumorvekst både
in vitro Hotell og i SCID-mus. Vi viser videre at SOX4 nivåer parallelt med summert uttrykk for SEMA3 /Plexin familiemedlemmer (
P
= 0,033,
NPar
Kruskal-Wallis
en
–
måte
analyse), som også korrelerer med dårlig overlevelse i menneskelig PDAC (
P
= 0,0409,
Kaplan-Meier
analyse). Forbløffende nok MIR-129-2 og MIR-335, som begge målrette SOX4 for nedbrytning, er co-trykt i humane PDAC saker knyttet til oppregulert SOX4 i en statistisk signifikant måte. I konklusjonen, avslører vi en MIR-129-2 (MIR-335) /SOX4 /Semaphorin-Plexin regulatoriske aksen i tumorigenesis for kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Huang HY, Cheng YY, Liao WC, Tien YW Yang C-HJ, Hsu SM, et al. (2012) SOX4 transcriptionally Regulerer Multiple SEMA3 /Plexin familiemedlemmer og fremmer tumorvekst i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 7 (12): e48637. doi: 10,1371 /journal.pone.0048637
Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 8. mai 2012; Godkjent: 01.10.2012; Publisert: 12.12.2012
Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Taiwan University Hospital intern fondet gis til PH Huang og HY Huang (NTUH.96-M-037). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er den fjerde største årsaken til kreftdød i USA, og en av de ti mest vanlige kreftformer i Taiwan. Diagnostisering av PDAC oppstår ofte først etter utbredt metastasering. Som et resultat, kan dårlig prognose av PDAC tilbakeføres til sin aggressive biologiske oppførsel og dens resistens mot kjemoterapi eller radioterapi, noe som nødvendiggjør en detaljert studie av mekanistisk PDAC for terapeutisk utforming [1].
Genekspresjon og genom -Stort mutasjons studier tyder på at menneskelig kreft i bukspyttkjertelen resultater fra endring av flere gener som fungerer gjennom en kjerne sett av minst 12 cellulære signalveier [2]. Ved en analyse av mer enn 20000 transkripter, har et gjennomsnitt på 63 genetiske endringer i bukspyttkjertelkreft blitt demonstrert. Mekanismene for avvikende uttrykk for hvert enkelt gen i kreft i bukspyttkjertelen er mangfoldig, inkludert punktmutasjon, genet sletting, og forsterkning [2].
Den avvikende uttrykk for klasse 3 Semaphorin samt beslektede reseptorer Plexin (PLXN ) og Neuropilin (NRP) i ulike typer av kreft hos mennesker indikerer at SEMA3-gated Plexin signale regulerer cancercelle adferd [3], [4]. For eksempel, over-uttrykk for SEMA3C og SEMA3E formidler tumorprogresjon og metastase i kreft, inkludert human lunge adenokarsinom, prostatakreft, endometrioid kreft, og mamma adenokarsinomer. I motsetning til
SEMA3F Hotell og
SEMA3B
gener blir ofte slettet i epitel malignitet, noe som resulterer i økt angiogenese [3]. For PDAC, over-ekspresjon av NRP1 og SEMA3A har blitt rapportert å korrelere med en dårlig prognose [5]. Imidlertid har de molekylære prosesser som ligger til grunn for slik ekspresjon under PDAC tumorigenesis ikke er klarlagt, og hvorvidt andre medlemmer av klassen 3 Semaphorin eller Plexin delta i bukspyttkjertelkreft dannelse eller progresjon er ennå ikke kjent. Her undersøkte vi uttrykket av SEMA3 og Plexin /Neuropilin i normale menneskelige bukspyttkjertelen, PDAC kirurgiske prøver, og PDAC cellelinjer. I motsetning til andre epiteliale kreftformer som ofte spesielt over uttrykker et lite antall gener i Semaphorin familien, de fleste PDAC tilfeller over-uttrykke mer enn fem gener relatert til SEMA3 og Plexin. Den underliggende mekanismen samtidig uttrykk for SEMA3 /Plexin familiemedlemmer i PDAC ble dermed undersøkt.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Vi har bekreftet at arbeid med menneske vevsblokker og frisk parvise svulst /ikke-tumorprøver i denne studien ble godkjent av Tissue og etikkomiteen, med skriftlige informerte samtykke innhentes følge retningslinjene fastsatt av Tissue og etikkomiteen ved NTUH.
in vivo
tumorigenesis analyse i SCID-mus ble utført under en godkjenning utstedt av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av National Taiwan University College of Medicine og College of Public Health.
sak utvalg
Sekstito tilfeller av bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom ble identifisert via et søk på de patologiske registrerte i National Taiwan University Hospital (NTUH), Taiwan fra januar 1996 til desember 2006. for kvantitativ real-time PCR, tjuetre tilfeller av sammenkoblede snap-frosset bukspyttkjertelen ikke-tumor og tumorvev ble oppnådd. Valgt demografisk informasjon ble hentet fra sykehuset kreft registret som beskrevet i Utfyllende Tabell S1.
Cell kultur, RNA interferens, og valg av stabile-transfekterte cellekloner
PANC-en, MiaPaCa2, og CAPAN-1-celler ble anskaffet fra ATCC. Alle celler ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C med 5% CO
2.
For RNA-interferens, de er målrettet mot oligonukleotider spesifikke for
SOX4
genet (NM_003107.2: nt.1999-2019 og nt.1362-1382) eller egge sekvenser ble klonet i pSuperGFP /neo vektoren. Lentiviral shRNAs målretting SOX4 via de konstruerte oligonukleotider rettet mot nt.4433-4453 og nt.1101-1121 (NM_003107.2), henholdsvis, ble kjøpt fra RNAi kjerne laboratorium i Taipei Sinica Academica.
PLXNA2
siRNA plasmider ble kommersielt kjøpt (Santa Cruz). De stabilt plasmid-transfekterte kloner ble selektert ved G418 (Sigma). RNAi-knockdown av hvert molekyl ble bekreftet ved RT-PCR og Western blot
Antistoffer, immunhistokjemi, og Western blot
De antistoffer som brukes inkluderte anti-human NRP1 (R = eller = 2 ganger endring) ble observert rundt
SEMA3A
,
3C
,
3D
,
3E
og
PLXNA4
gen loci (angitt med grønn-farget rektangel og pil). (C) SOX4 er uttrykt i PDAC cellelinjer. Cellelysater ble immunopresipitert ved bruk av anti-SOX4 antistoff og immunoblottet med SOX4 eller et kontroll IgG-antistoff. (D) immunhistokjemi av SOX4 og E2F1 i menneskelige PDAC tilfeller. SOX4 og E2F1 ble begge påvist i Panin av ulike karakterer og invasiv adenokarsinom, men ikke i normal ductal og acinar epitel eller kronisk pankreatitt. Scale bar = 100 mikrometer. (E) Rank summen av fargeintensitet for SEMA3 /Plexin /NRP1 korrelerer med SOX4 uttrykk i PDAC tilfeller. Farging av hver seksjon ble scoret 1-3 for å rangere sin intensitet som svak, medium eller sterk. Resultater av alle SEMA3 /Plexin /NRP1 farging for hvert tilfelle ble summert og korrelert med SOX4 uttrykk (NPar Kruskal-Wallis enveis analyse). Median (linje i boksen), maksimal og minimal verdier (øvre og nedre linjer utenfor boksen, henholdsvis) for hver gruppe er vist i boksplott.
En annen vanlig endring i kreftceller er silencing av tumorsuppressorgener etter hypermethylation [8]. Selv SEMA3F og SEMA3B er generelt ansett som tumor suppressors og denaturert
SEMA3F
er rapportert hos lungekrefttilfellene [9], er det neo-uttrykk i stedet for undertrykkelse av SEMA3 /Plexin uttrykk som vanligvis observert i PDACs (se tabell 1). Videre er CpG-rike øyene for metylering endring ikke alltid finnes i den anslåtte promoter regioner SEMA3 /Plexin familie gener (som spådd av Preg CpGPlot Program). Som et resultat, vi neste undersøkt muligheten for at ko-ekspresjon av SEMA3 /Plexin /NRP familiemedlemmer i PDACs er forårsaket av den neo-ekspresjon av noen hovedkontroll gen (er) avgjørende for tumorgenese av PDAC, muligens transkripsjonsfaktor (e) som kan samhandle med en konsensus DNA-bindingsmotiv stede i formidler av hver SEMA3 /Plexin /NRP genet. Flere kandidater, inkludert E2F1, GATA6, og SOX2, ble innhentet via et litteratursøk. Den E2F1 transkripsjonsfaktor kan aktivere
NRP1
transkripsjon i mus cortex etter iskemisk endring [10]. Mus
SEMA3C Hotell og
PLXNA2
er direkte mål for GATA6 under hjerte utvikling [11]. Til slutt,
SEMA3C Hotell og
NRP1
ble rapportert å være direkte målgener av SOX4 [12]. Derfor prøvde vi å finne SOX4-konsensus bindingssetet [(A /T) (T /A) CAA (A /T) G], den GATA6-bindingssetet [(A /T /C) GAT (A /T ) (A)], og den E2F1-bindingssetet [TTT (C /G) (C /G) CGC] i forutsagte promotere for hvert SEMA3 og Plexin-genet [12] – [15]. Som nevnt i Tilleggs tabell S3, alt SEMA3, Plexin, og NRP gener ha minst en antatt SOX4 bindingssete og en E2F1 bindingssetet i den anslåtte promotorområdene.
tilstedeværelsen av den antatte SOX4 og E2F1 bindingssteder i formidler av hver SEMA og Plexin gen bedt oss om å undersøke SOX4 og E2F1 uttrykk i menneskelige PDAC vev og cellelinjer. Immunoblotting viste SOX4 ekspresjon i PANC-1 og MiaPaCa2 celler (Fig. 2C). For menneske PDAC prøver, immunhistokjemi viste at 76,4% av menneskelig PDAC uttrykt SOX4, og 87,9% uttrykt E2F1 (Fig. 2D). I motsetning acinar og duktale epitelceller fra normal bukspyttkjertel og kroniske pankreatitt var ikke immunoreactive å SOX4 eller E2F1. Videre SOX4 og E2F1 ble allerede oppdaget i Panin av ulike karakterer (Fig. 2D), noe som tyder på at SOX4 og E2F1 er de novo uttrykt i de tidlige prosessene i PDAC tumorigenesis.
For å utforske forholdet mellom uttrykket av SOX4 eller E2F1 og at SEMA3 /Plexin /NRP1 hos pasienter med PDAC, rangert vi fargeintensitet for hver SEMA3 og Plexin som et tall 0-3 (0, negativ, 1, svak, 2, moderat, 3, sterk) og analysert hver enkelt pasients rang sum versus SOX4 eller E2F1 uttrykk.
NPar
Kruskal-Wallis
en
–
måte
analyser viste signifikante forskjeller i rang summen av SEMA3, Plexins og NRP1 flekker mellom SOX4-positive og SOX4-negative tilfeller (
P
= 0,046) (fig. 2E). Imidlertid ble det ikke observert noen forskjell når E2F1 uttrykk ble ansett som den variabelen (
P
= 0,9121). Den svært korrelert uttrykk for SOX4 med SEMA3 /Plexin /NRP1 familiemedlemmer i menneskelig Panin og PDAC antyder at SOX4 kan fungere som en mester transkripsjonsfaktor for å drive uttrykk for SEMA3 og Plexin gener i bukspyttkjertelkreft formasjon.
SOX4 aktiverer transkripsjon av SEMA3 og Plexin gener
for å vise at SOX4 kunne regulere transkripsjon aktivitet SEMA3 og Plexin gener i PDAC, vi først undersøkt om SOX4 kunne binde seg til den anslåtte formidler av hver SEMA3 og Plexin genet. Kromatin immunoutfelling utført på PANC-1 celler viste at SOX4 faktisk bundet til promoteren til hver SEMA3 og Plexin-genet (Fig. 3A og 3B). Betydelige brette økning i luciferaseaktivitet ble observert i konstruksjonen drives av promoteren som stammer fra SEMA3 og Plexin gen når transfektert inn i SOX4-uttrykkende HeLa-celler. I tillegg, co-transfeksjon av en SOX4-uttrykke vektor forbedret arrangøren aktivitet (figur 3C, P = 3. Hver bane i figur 3A ble gitt en verdi som er målt ved densitometri og normalisert med verdien av IgG. ChIP effektiviteten er definert som prosentandel av verdien utledet fra PCR av SOX4-immunpresipitatet forhold til den totalt genomisk inngang.
Feilfelt
, standardavvik (SD) fra minst tre eksemplarer. (C) økte luciferase aktivitet av konstruksjoner som inneholder
SEMA3 Anmeldelser – eller
Plexin Anmeldelser – promoter i fravær (hvite søyler) eller nærvær (grå søyler) av co-uttrykt SOX4 i sammenligning med promoterless pGL3-Basic kontroll. Konstruksjonene skjuler en SOX4-konsensus bindingssetet ble transient transfektert inn SOX4 holdig HeLa-celler. Vist er prosenter av ildflue luciferase uttrykk til Renilla luciferaseekspresjon (uttrykt fra ko-transfektert plasmid), målt 48 timer etter transfeksjon, normalisert til gjennomsnittsforholdet fra pGL3-Basic. Feilsøylene viser SD, n = 4. Elevens
t
-test, *,
P
0,01; **
P
0,001. I nærvær av ko-transfektert SOX4, luciferase aktivitet drevet av hvert
SEMA3 Z – eller
Plexin Anmeldelser – promoter er ytterligere forsterket (grå søyler) sammenlignet med mock-transfektert (hvite søyler) og kontroller . (D) Transkripsjonell aktivitet av
PLXNA2
arrangøren drevet av SOX4 dempes når konsensus SOX4-bindingsseter er mutert. Boxed DNA sekvens, konsensus SOX4-bindingssete; Understrek med skygge i brev, de muterte SOX4-bindingssteder. Søylediagram som viser at mutasjon av enten SOX4-bindingssetet forårsaket signifikant nedgang i luciferase-aktivitet drevet av
PLXNA2
promoter, i nærvær av overuttrykt SOX4. Feilfelt, SD, n = 5. Studentens
t
-test, *,
P
0,01; **
P
0,001. (E) EMSA viser at migreringen av en radioaktivt merket DNA-fragment avledet fra
PLXNA2
promoter forsinkes ved SOX4 holdige HeLa rå kjerneekstrakt i en konsentrasjonsavhengig måte. Signalet fra proteinbundet tilbakestående bånd (pilspisser) ble spesielt svekket av kalde sonder som inneholder SOX4 bindende konsensussekvenser og var super-forskjøvet med anti-SOX4 antistoff (tom pilspiss). Asterisk, ikke-spesifikke bindingssignaler; arrow, un-bundet radiomerket probe. (F) effektiv RNAi knockdown av endogen SOX4 i PANC-1 celler vist ved SOX4 immunoblotting. Verdien antydet er den normaliserte relative intensiteten målt ved densitometri (Forholdet SOX4 /Tubulin for egge-siRNA-celler er definert som 1.). To stabile siSOX4 kloner merket som siSOX4 # 1 og siSOX4 # 2 ble konstruert med targeting oligonukleotid rettet mot forskjellige nukleotidsekvenser i
SOX4
genet (siSOX4 # 1, nt.1999-2019 NM_003107.2; siSOX4 # 2 , nt.1362-1382 NM_003107.2). (G) Immunoblotting i SOX4-utarmet celler viser en samtidig reduksjon i protein mengden NRP1, SEMA3- og Plexin- familiemedlemmer. Tubulin ble anvendt som en standard for normalisering i kvantifisering av hvert kjørefelt målt ved densitometri. Forholdet angitt var den normaliserte verdi i siSOX4 celler i forhold til den normaliserte verdi i egge-siRNA-celler. (H) Real-time PCR for å kvantifisere mRNA uttrykk for
SEMA3 Hotell og
PLXN
gener i SOX4 fattige celler i forhold til SOX4-rikelig egge-siRNA celler (vist ved fold-endring). Elevens
t
-test, *,
P
0,01; **
P
. 0,001
RNAi-mediert uttømming av SOX4 undertrykker tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
for å undersøke hvordan SOX4 påvirker tumorigenesis i PDAC celler, effekten av SOX4 knockdown på celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon ble først undersøkt. Den viste at det totale antall levedyktige celler ble signifikant redusert i SOX4-knockdown-celler dyrket
in vitro
i tre dager (fig. 4A). Cellesyklusprogresjon og apoptose ble kvantitativt sammenlignet mellom SOX4-trykkes og -competent celler, og ingen signifikant forskjell ble observert ved flowcytometri eller TUNEL assay utfordret av genotoksiske middel (fig. 4B og 4C). I motsetning til spredning av SOX4-trykkes (siSOX4 # 1 og siSOX4 # 2 celler) ble åpenbart redusert, da mindre Ki-67 immunoreaktivitet og mye mindre BrdU-merkingen ble observert i siSOX4 celler (fig. 4D), som indikerer at antallet celler inn i cellesyklusen reduseres når SOX4 er oppbrukt. Dette funnet antyder at SOX4 kan fungere for å lette celleproliferasjon når uttrykt i kreft i bukspyttkjertelen celler.
(A) Cell spredning påvirkes i PANC-1 celler med RNAi-undertrykkelse av SOX4. 30000 celler ble sådd i hver brønn i en 12-brønns plate. Ved 24, 48 eller 72 timer etter utsåing ble cellene høstet og tellet ved trypanblått-eksklusjon assay.
Feilfelt
, SD fra seks uavhengige eksperimenter, Student
t
-test. (B) Representant flowcytometri av siSOX4 celler farget med propidiumjodid viser ingen signifikant variasjon fra egge-siRNA celler i apoptose (avbildet av sub-G1) eller i cellesyklusprogresjon. Prosentandelen av celler i sub-G1, G0 /G1, S og G2 /M fase ble vist til høyre nedover hjørne på hver tomt. (C) representative TUNEL-merking av celler utfordret av den genotoksiske middel cisplatin (10 ug /ml, 12-H). Forskjeller i apoptose ble ikke observert mellom SOX4-knockdown (siSOX4 # 1 og siSOX4 # 2) og kontroll (egge-siRNA) celler. (D) nedre celleformeringshastigheten og redusert antall celler som bor på M fase i siSOX4 celler. siSOX4 og egge-siRNA-celler ble sådd ut på dekkglass og inkubert i 48 timer. Før høsting og fiksering med paraformaldehyd ble cellene inkubert med 10 pM av BrdU i 3 timer og ble deretter utsatt for anti-Ki-67 eller anti-BrdU immunofluorescerende farging. Tjue tilfeldig utvalgte høy effekt felt (X400) ble talt for statistisk analyse (Student
t
-test). (E) Tumor xenograft av siSOX4 /PANC-1-celler vokser mindre enn den for kontrollceller (egge-siRNA) i en SCID-mus. Musene ble avlivet 30 dager etter subkutan inokulering av kontrollcellene til venstre og siSOX4 cellene på høyre side av flanken. (F) mindre og lettere tumorxenotransplantater av siSOX4 celler sammenlignet med de av kontroll (n = 9, Student
t
-test). (G) representative H E, Ki-67, PHH3 immunfarging, og TUNEL merking i vevssnitt fra tumorxenotransplantater. Skala barer = 50 mikrometer. (H, I og J) kvantifisering av spredning (Ki-67 merking), apoptose (TUNEL flekken) og mitose (PHH3-immunfarging). Atten tilfeldig utvalgte felt (X200) i hvert Ki-67-farget seksjon og celler i tjuesju tilfeldig utvalgte felt (X400) for TUNEL merking eller PHH3 immunfarging ble telt i hvert xenograft tumor. Den prolifererende indeksen og de mitotiske tellinger av siSOX4 tumorceller er betydelig lavere enn for kontrollceller, mens andelen av apoptotiske celler ikke var forskjellig (Student «s
t
-test). n, det totale antall celler telles.
Ved hjelp av en
in vivo
tumorigenesis analysen, viste også vi at svulster vokser fra SOX4 undertrykt celler var mye mindre i størrelse og vekt sammenliknet med de som vokser fra kontroll SOX4-kompetente celler (fig. 4E og 4F). Som vist på fig.
