Abstract
Bakgrunn
kakeksi påvirker de fleste pasienter med fremskreden kreft og er assosiert med en reduksjon i behandlingstoleranse , respons på behandlingen, og varigheten av overlevelse. En hindring mot effektiv behandling av kakeksi er en validert klassifikasjonssystem.
Metoder
41 pasienter med resectable øvre gastrointestinal (GI) eller kreft i bukspyttkjertelen gikk karakterisering for kakeksi basert på vekt-tap (WL ) og /eller lav muscularity (LM). Fire diagnostiske kriterier ble brukt 5% WL, 10% WL, LM, og LM + 2% WL. Alle pasientene gjennomgikk biopsi av rectus muskelen. Analyse inkludert immunhistokjemi for fiber størrelse og type, protein og nukleinsyre konsentrasjon, vestlige blotter for markører for autofagi, SMAD signalering, og betennelser.
Funn
Sammenlignet med ikke-cachectic kreftpasienter, pasienter med LM eller LM + 2% WL, mener muskelfiberdiameter ble redusert med ca 25% (henholdsvis p = 0,02 og p = 0,001). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i fiberdiameter hvis pasientene hadde WL alene. Uavhengig av klassifisering, var det ingen forskjell i fiber antall eller andel av fibertypen i alle myosin tung kjede-isoformer. Bety muskelproteininnholdet ble redusert og forholdet av RNA /DNA redusert hos pasienter med enten 5% WL eller LM + 2% WL. Sammenlignet med ikke-cachectic pasienter, ble SMAD3 protein nivåer økt hos pasienter med 5% WL (p = 0,022) og med 10% WL, beclin (p = 0,05) og ATG5 (p = 0,01) protein nivåer ble økt . Det var ingen forskjell i fosfor-NFkB eller fosfor-Stat3 nivåer over noen av gruppene.
Konklusjon
Muskel fiber størrelse, biokjemisk sammensetning og sti fenotype kan variere avhengig av om de diagnostiske kriteriene for kakeksi er basert på vekttap alene, et mål for lav muscularity alene eller en kombinasjon av de to. For intervensjonsstudier hvor det primære endepunktet er en endring i muskelmasse eller funksjon, kan bruk av kombinerte diagnostiske kriterier tillate identifikasjon av en mer homogen pasient kohort, redusere størrelsen på utvalget som kreves og forbedre tidsskala innen hvilke prøvelser kan gjennomføres.
Citation: Johns N, Hatakeyama S, Stephens NA, Degen M, Degen S, Frieauff W, et al. (2014) Klinisk Classification of Cancer kakeksi: Fenotypiske relaterer i Human Skeletal Muscle. PLoS ONE 9 (1): e83618. doi: 10,1371 /journal.pone.0083618
Redaktør: Imed Eddine Gallouzi, McGill University, Canada
mottatt: 02.10.2013; Godkjent: 05.11.2013; Publisert: 03.01.2014
Copyright: © 2014 Johns et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne «fikk en liten stipend fra Royal College of Surgeons: https://www.rcsed.ac.uk/fellows-members/awards-and-grants/grants/small-research-grants.aspx. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Shinji Hatakeyama, Martin Degen, Simone Degen, Wilfried Frieauff, Christian Lambert, Ronenn Roubenoff David Glass og Carsten Jacobi er alle ansatte i Novartis. Når det gjelder de ansatte i Novartis, ikke dette endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft kakeksi er nylig blitt definert som en multifaktoriell syndrom kjennetegnes av en pågående tap av skjelettmuskelmasse (med eller uten tap av fettmasse) som ikke fullt ut kan reverseres ved konvensjonell ernæringsmessig støtte og fører til progressiv funksjonsnedsettelse [1]. Kakeksi påvirker de fleste pasienter med fremskreden kreft og er assosiert med en reduksjon i behandlingstoleranse, respons på behandling, livskvalitet og varighet av overlevelse. Skjelettmuskulatur tap synes å være den mest betydningsfulle arrangementet i kreft kakeksi, og er assosiert med en dårlig prognose [1], [2]. Den internasjonale enigheten om klassifisering av kreft kakeksi antydet at diagnostiske kriterier bør ta hensyn til ikke bare at vekttap er et signal tilfelle av cachectic prosessen, men at den første reserve av pasienten bør også vurderes (enten lav BMI eller lavt nivå av muscularity). Selv om sistnevnte begrepet har noen validering i form av klinisk risiko [2], har det ikke vært noen vurdering av de biologiske korrelater i form av endringer i skjelettmuskulatur selv.
Menneskelig skjelettmuskulatur består av muskelfibre som er klassifiseres avhengig av hastigheten av sammentrekning og fremherskende form for energimetabolisme. Muskelfibrene kan klassifiseres som type I (slow-napp) og type II (raske rykk) fibre basert på deres dominerende myosin tung kjede (MyHC) isoform innhold. Vanligvis Type I og Type IIa fibre utnytte oksidativ fosforylering, mens skriver IIx og IIb fibre utnytte primært anaerob metabolisme å generere ATP. Både den prosentvise og strukturelle morfologi av fibertypen vil bestemme den fenotypiske kapasitet og funksjonell utførelse av en hvilken som helst gitt muskel. Miljøfaktorer i både helse og sykdom har en direkte innvirkning fører til endringer i fibertype /morfologi og påfølgende funksjonalitet; slike prosesser innbefatter aldring, mosjon, kronisk sykdom, kakeksi og [3] – [7]. Endringen, konservering eller tap av fibre kan påvirke kliniske symptomer, og det er bevis på at alle typer MyHC er rettet selektivt i kreft kakeksi [8]. Pågående tap av protein i muskelvev kan føre til muskelfiber krymping og en reduksjon i tverrsnittsareal (CSA). Likeledes kan tap av muskelfiber CSA føre til tap av aerob kapasitet (VO
2 max) hos friske personer samt kreftpasienter [5], [9].
Selv om systemisk inflammasjon er generelt antatt å være en viktig mediator oppstrøms av kreft kakeksi [10], den presise molekylære mekanismer som formidler endringer i proteinsyntese og nedbrytning som til slutt fører til atrofi av muskelfibre i kreft kakeksi hos mennesker er ikke kjent. For hvert dyr modell som har blitt studert, har ulike veier vært innblandet. Fra slike dyremodeller er det et fremherskende inntrykk av at økt nedbrytning via aktivering av ubiquitin proteasom-reaksjonsveien (UPP) er viktig [10]. I motsetning til dette, er meget begrenset human-data. Aktivering av protein degradering via UPP har ikke vært en gjennomgående funn [11] [12]. Dette har ført til forslag om at autofagi kan være viktig eller at veier som kan påvirke både syntese og nedbrytning kan være viktige (f.eks TGF-β /SMAD signale) [13].
I denne studien valgte vi å evaluere forholdet mellom de forskjellige definisjoner kreftkakeksi, systemisk inflammasjon (serum C-reaktivt protein) og eventuelle inflammatoriske signalveier i muskel (fosfo-STAT3 og fosfo-NFkB). Vi har også undersøkt for mulige sammenhenger mellom de ulike kreftkakeksi definisjoner og aktivering av autofagi trasé eller TGF-β /SMAD signalering.
Hensikten med denne studien var å undersøke endringer i muskelfiber biologi med hensyn til morfologiske struktur og sammensetning, for å studere endringer i ulike baner som kan forklare endret fiber størrelse og relatere disse endringene til de ulike diagnostiske kriterier som er foreslått som en del av den siste internasjonal enighet om klassifisering av kreft kakeksi [1].
Materialer og metoder
Pasient Rekruttering, Identifikasjon, Samtykke og etikk
Pasienter med resectable sykdom og ble identifisert som passer for studiet via den øvre gastrointestinal kreft tverrfaglig team (MDT) møter på royal Infirmary, Edinburgh, UK. Skriftlig samtykke ble gitt før innreise i studien. Alle prosedyrer ble godkjent av NHS Lothian lokale forskningsetisk komité. Studien dannet standardene satt av Helsinkideklarasjonen.
Beregning av vekttap
Forhånds sykelig vekt ble tilbakekalt av pasienten og bekreftet hvor mulig fra de medisinske notater. Selv om det kan være tilbakekalling skjevhet, for å bevis støtter påliteligheten av selv rapporterte vekt og vekten historie [14], [15] er godt dokumentert. Individuell vekttap ble beregnet og uttrykt som prosentandel av pre-sykelig kroppsvekt tapt
Classification of Cancer kakeksi
Vekttap . 5% over siste 6 måneder (i mangel av enkle sult) (WL 5%)
Vekttap 10% i løpet av siste 6 måneder (i mangel av enkle sult) (WL 10%)
Stature justert skjelettmuskulatur indeksen forenlig med lav muscularity (LM) (se «CT-bildeanalyse» for cut-offs)
Stature justert skjelettmuskulatur indeksen i samsvar med lav muscularity og noen grad av vekttap 2% (LM + 2% WL)
rectus abdominis muskel biopsi og bagasje til biokjemisk analyse
Alle biopsier ble tatt i starten av åpen abdominal kirurgi under generell anestesi. Pasientene hadde fastet over natten før operasjonen. Kanten av rectus abdominis ble eksponert og en 1 cm
3 prøven fjernet ved anvendelse av skarp disseksjon. Den biopsi ble ryddet av brutto blodsmitte. Åpen fett /bindevev ble fjernet før den plasseres i en kryorør og blir snap frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C.
rectus abdominis muskel Prøvepreparering for Cryo-seksjon
En 0,1-0,5 cm
3-delen av muskel ble kuttet. Flytende nitrogen ble brukt til å avkjøle isopentan løsningsmiddel i et rør til en temperatur på ~-190 ° C. Den delen av muskelen ble sydd på et segment av kork. Oktober løsning ble plassert ved overgangen mellom korken base og muskelen. Dette ble så senket med kork øverste (dvs. muskel først) inn i avkjølte oppløsningsmiddel og holdes i ca. 5 minutter (til muskelen var frosset). Prøvene ble deretter lagret ved -80 ° C inntil bruk.
CT Image Analysis
CT-skanninger som brukes for analysen ble gjort utelukkende for rutinemessig kreftbehandling. En tverrgående CT bilde fra den tredje lumbale ryggvirvler (L3) ble vurdert for hver skanning dato og volumer vev beregnet [16]. Alle CT-bildene ble analysert ved hjelp av en enkelt trenet observatør. Tverrsnittsareal for muskel og fettvev ble normalisert for vekst (cm
2 /m
2).
Anslag over hele kroppen lagrer ble samlet inn rådata (cm
2 ) ved hjelp regresjonsligningene av Mourtzakis et al. [17], som viser en nær sammenheng mellom muskel- og fett områder i CT-bilder på den tredje lumbale ryggvirvler og hele kroppen avdelinger av fettfri masse (FFM) og fettmasse (FM) indolene respektive indekser for FFM og FM ( kg /m
2) ble beregnet.
Cutoffs for lav muscularity var basert på en CT-basert sarcopenic fedme studie av kreftpasienter ved Prado et al. (Dvs. L3 skjelettmuskulatur Indeks: ≤38.5 cm
2 /m
2 for kvinner og ≤52.4 cm
2 /m
2 for menn). [18]
CT brukt var rutinemessige diagnostiske iscenesettelse CT som ble utført innen 30 dager av en diagnose av kreft og alt var i behandlingsnaive pasienter. Median tid til biopsi etter CT scan var 18 dager.
Immunohistochemistry
De frosne muskel seksjonene ble co-farget for laminin (L9393, Sigma-Aldrich, Buchs, Sveits) og myosin tung kjedet type i eller IIa for å skjelne hver fibertype (BA-D5 for type i, SC-71 for type Ila). De parafinsnitt ble farget for fosfor-STAT3 (D3A7, cellesignalisering Technologies, Danvers, MA, USA) med en Ventana oppdagelse XT (Roche gruppe, Tucson, USA). Bilder av hele vev delen ble anskaffet ved hjelp av en VS120 lysbilde scanner (Olympus Corporation, Tokyo, Japan). Fordelingen av myosin-tungkjede fibertyper, tverrsnittsarealet av de enkelte fibrene i avsnittet, og det fosfo-STAT3 positive kjerner og farging tetthet ble analysert ved hjelp av proprietær bildeanalyse plattform Astoria (Automatisert lagrede bildeanalyse) utviklet av Novartis /Prekliniske sikkerhets.
tissue Forberedelse til DNA, RNA og protein Utdrag
Skeletal muskelvev var hakket og malt på tørris. Aliquoter ble veid ved å bruke en analytisk vekt (Mettler Toledo) og lagret ved -80 ° C inntil bruk.
DNA og RNA ekstraksjon og linearitet av ekstraksjonsmetoden
DNA og RNA fra human skjelettmuskel vevet ble ekstrahert og renset med den automatiserte Maxwell 16 system (Promega, Duebendorf, Sveits). For å bestemme lineariteten av de utvinningsmetoder ved hjelp av Maxwell 16 system, DNA og RNA ble ekstrahert fra 4 mg, 6 mg, 8 mg, og 10 mg muskel, respektivt. Beregning av total DNA og RNA-innhold pr våtvekt (som i et lineært utvinningssystem skal være lik for alle alikvoter), tillot oss å definere lineære området for Maxwell 16 utvinningssystem. Basert på disse foreløpige studiene ble porsjoner av 4-8 mg humant skjelettmuskulatur vev som brukes for alle påfølgende DNA og RNA ekstraksjon. Ved hjelp av flere utgangsmaterialet drastisk redusert total DNA og RNA-innhold pr våtvekt (data ikke vist).
For DNA-ekstraksjon ble den Maxwell 16 LEV Blod-DNA Kit (Promega) som brukes sammen med en svakt innrettet protokoll sammenlignet med den manuelle instruksjoner. Kort fortalt ble 300 ul Tail Lysis Buffer fra settet ReliaPrep gDNA Tissue Miniprep System (Promega) tilsatt hakket og malt menneskelig skjelettmuskulatur vev i Precellys 24 lyse kit rør. Vevet ble ytterligere homogenisert ved hjelp av high-throughput-homogenisator Precellys 24, 10 s. Etter avkjøling på is i 5 minutter, 30 ul av proteinet K og 5 mL av 1-Thiolglycerol løsning ble tilsatt. Denne blandingen ble inkubert ved 56 ° C i 2 timer. Deretter ble lysatet overført til vel en av de LEV Blood DNA patron, og fortynnet med 300 pl nuklease-fri vann. For elueringen, ble 50 ul elueringsbuffer tilsatt til eluering rør. Maxwell 16 Instrumentet ble tatt i bruk DNA Blood programmet.
For RNA ekstraksjon ble Maxwell 16 LEV simplyRNA Tissue Kit brukes (Promega), etter manuelle instruksjoner. I korthet ble hakket og jord human muskelvev ble inkubert i 200 ul kald 1-tioglycerol /Homogenisering oppløsning og ytterligere homogenisert ved hjelp av Precellys 24 system (se DNA). Etterpå ble prøvene oppvarmet ved 70 ° C i 2 minutter, deretter lysatene ble tillatt å kjøle seg ned. 200 ul lyseringsbuffer ble tilsatt til den avkjølte ned homogenat, blandet kraftig, etterfulgt av overføring av de totale 400 pl i brønnen 1 av Maxwell 16 LEV patron. 5 pl DNAse ble tilsatt til vel 4 av patronen, og 50 ul RNase-fritt vann ble tilsatt til 0,5 ml Eluerings-rør og RNA-ekstraksjon ble startet på Maxwell 16 instrumentet.
ekstrahert DNA og RNA ble målt spektrometrisk ved hjelp av en Trinean DropSense Instrument (Trinean, Gentbrugge, Belgia) for kvantitet og kvalitet.
protein Utdrag
Hvis du vil trekke proteiner, 300 ul PhosphoSafe Ekstraksjonsreagens (Millipore) ble lagt til en bestemt mengde (mellom 8 og 18 mg) av homogenisert human skjelettmuskel vev. For ytterligere å homogenisere prøvene ble Precellys 24 system som brukes (se ovenfor). Etter inkubasjon på is i 5 minutter, ble lysatene sentrifugert ved 800 x g i 5 min ved 4 ° C. Supernatanter ble overført til nye rør og sentrifugert i ytterligere 12 min ved 1600 x g ved 4 ° C. Supernatanter ble oppsamlet, og proteinkonsentrasjonen målt ved anvendelse av BCA Protein Assay Kit (Pierce) med BSA som en standard. Etterpå ble fosfatase-inhibitor cocktail (Roche) tilsatt, og prøvene ble lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
Western avsetninger
20 ug av human skjelettmuskelproteinekstrakter (se ovenfor) for å redusere Laemmli SDS-prøvebuffer ble kokt i 5 min ved 95 ° C og deretter separert ved SDS-PAGE på 4-20% gradient-geler (Bio-Rad, Cressier, Sveits), blottet til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad) ved å bruke trans-blot Turbo Transfer System (Bio-Rad), blokkert i 1 time i 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltløsning + 0,05% Tween-20, inkubert over natt med primært antistoff, skylt og inkubert i 1 time med peroksidase -konjugert geit-anti-kanin-IgG (1:5000) (Santa Cruz, Heidelberg, Tyskland) ved romtemperatur. Blottene ble utviklet ved hjelp av ECL (Roche, Rotkreuz, Sveits) eller SuperSignal West Femto substrat (Thermo Scientific, Wohlen, Sveits) og utsatt for Kodak film (Kodak, Rochester, NY, USA).
Rabbit monoklonale antistoffer som brukes var: Beclin-en (klon D40C5), Atg5 (klone D1G9), Atg7 (klone D12B11), Atg12 (klone D88H11), SMAD3 (klone C67H9), fosfor-NF
κ
B p65 (Ser536) ( klone 93H1) og α-tubulin (klone 11H10) (alle fra cellesignalisering Technologies, Danvers, MA, USA), fosfor-SMAD3 (Ser423 /Ser425, klone EP823Y) (Millipore, Billerica, MA, USA). Kanin polyklonale antistoffer som ble brukt var:. Gelsolin (cellesignalisering Technologies)
Vest-blotter ble analysert densitometrically hjelp ImageJ programvare versjon 1.45 (NIH, Bethesda, MD, USA; https://rsbweb.nih.gov/ij) . Band intensiteten av hver prøve ble normalisert til at av α-tubulin
C -. Reaktivt protein (CRP)
ble målt med en automatisert immunoturbidimetric analyse av klinisk kjemi avdeling Serum CRP konsentrasjon, Royal Infirmary Edinburgh, ved hjelp av blod oppsamlet fra pasienten ved tidspunktet for rekruttering og før en hvilken som helst terapeutisk intervensjon.
Statistical Analysis
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt (± SEM). Sammenligninger mellom grupper ble utført ved hjelp av uparet Student t-tester, mens mulige relasjoner ble evaluert ved hjelp av Pearsons korrelasjoner. Resultatene ble ansett som vesentlig dersom p-verdiene var mindre enn 0,05. Programmet SPSS (versjon 20, SPSS, Chicago, IL, USA) ble brukt for alle statistiske tester.
Resultater
demografisk
Totalt 41 kreftpasienter med resectable UGI eller kreft i bukspyttkjertelen ble rekruttert. Generelt pasientene var over 65 år, hovedsakelig mannlige og hadde vedvarende i gjennomsnitt 5% tap av vekt sammenlignet med pre-sykdom nivåer (tabell 1). Pasientene ble gruppert basert på ideene fra International Classification Work [1] i henhold til vekttap eller vekttap i forbindelse med lav muscularity. De spesifikke fenotyper mente var vekttap 5% (WL 5%), vekttap 10% (WL 10%), lav muscularity (LM), og LM med vekttap 2% (LM + . 2% WL gruppene hadde en signifikant lavere fettfri mass index (tabell 1)
Muscle Fibre Size, Antall og Type
Hvis pasienter ble klassifisert som cachectic av LM eller LM + 2% WL, fiber størrelse ble redusert betydelig (alle typer myosin tung kjede fiber) sammenlignet med ikke-cachectic pasienter og kontroller ( figur 1A). Foreningen av kakeksi med redusert fiberstørrelse ble ikke observert om pasienter ble klassifisert i henhold til WL alene. Representative immunohistologiske seksjoner som viser forskjeller i fiberdiameter mellom en frisk kontroll og et individ i gruppe II sammenlignet med gruppe IV er vist i figur 1B. Immunohistologi for type I og IIa resulterte i komplementær farging generelt, mens fibertype IIb resulterte i meget lav fargeintensitet som rapportert andre steder [19]; derfor kvantitativ analyse ble utført bare med type I og Ila, men ikke med type Ilb (tabell 2). Som kunne forventes fra en reduksjon i fiber størrelse, var det en trend over alle grupper for fibertettheten til å øke i de med kakeksi. Men på grunn av store variasjoner, dette var ikke statistisk signifikant. Det var ingen tegn til selektiv fiber atrofi over noen av klassifiseringsgrupper (tabell 2).
(A) Mean (± SEM) fiber størrelse for både MyHC1 og MyHCIIa. En sammenligning er gjort mellom pasienter med den foreslåtte cachexia definisjonen fraværende (mørk grå) og de med den foreslåtte cachexia definisjonen til stede (lys grå) for de fire definisjonene fastsatt i Methods (I-IV). (*, P 0,05 og **, P 0,01, ved Student t-test). (B) immunhistokjemi deler av muskelen for en sunn kontroll, pasient med vekttap alene (10,1%) (gruppe II), og pasient med lav muscularity og 2% vekttap (gruppe IV). Laminin vises i grønt, MyHC1 vist i rødt, og MyHCIIa vises i blått.
proteininnhold
Resultatene for skjelettmuskelproteininnhold er vist i figur 2 (EN). Sammenlignet med ikke-kakektiske pasienter, ble muskelproteininnholdet reduseres betydelig (ca. 13%) hos pasienter med enten 5% WL eller LM + 2% WL (figur 2A og tabell 3). Men hvis LM kriterier ble anvendt alene, ble det ikke observert noen forskjell i proteininnholdet. I tillegg har pasienter med viste 10% WL en 10% reduksjon i proteininnhold sammenlignet med ikke-cachectic pasienter, men denne forskjellen var ikke statistisk signifikant (figur 2A og tabell 3)
En sammenligning er. mellom pasienter med den foreslåtte cachexia definisjonen fraværende (mørk grå) og de med den foreslåtte cachexia definisjonen til stede (lys grå) for de fire definisjonene fastsatt i metoder (i-IV). (A) Gjennomsnittlige (± SEM) våtvekt proteininnhold. (B) Mean (± SEM) RNA innhold. (C) Mean (± SEM) DNA innhold. (C) Midlere (± SEM) RNA /DNA-forhold. (*, P 0,05 av Student t-test)
RNA, DNA og RNA /DNA Ratio
Resultatene for skjelettmuskulatur DNA og RNA innhold er også. vist i figur 2 (B, C og D) og tabell 3. RNA-innholdet var ikke signifikant forskjellig i kakektiske pasienter når sammenlignet med ikke-kakektiske pasienter i henhold til hvilket som helst av de diagnostiske kriterier (figur 2B og tabell 3). I kontrast, ble DNA innhold økt med 50% med 5% WL men redusert med ~40% hos pasienter med LM (figur 2C). Forholdet RNA /DNA ble redusert (ca. 30%) hos pasienter med 5% WL og LM + . 2% WL (figur 2D)
Autophagy Pathways
Hos pasienter med 10% WL, Beclin og ATG5 proteinnivåer ble økt betydelig i cachectic pasienter sammenlignet med ikke-cachectic pasienter (figur 3). ATG7 og 12 nivåer var ikke forskjellig i kakektiske pasienter når sammenlignet med ikke – kakektiske pasienter i henhold til hvilket som helst av de diagnostiske kriterier (Tabell 3)
Western blot-analyse med angitte antistoffer, α-tubulin ble anvendt som en lasting. kontroll. Diagrammet viser den midlere (± SEM) proteinnivå representert i vilkårlige enheter (A.U). (*, P 0,05 og **, P 0,01, ved Student t-test).
SMAD Signale
Hos pasienter med 5% WL, SMAD3 proteinnivået var betydelig økt sammenlignet med non-kakektiske pasienter (figur 4). Det var ingen signifikante forskjeller i fosfo-SMAD3 /SMAD3 på tvers av en hvilken som helst av gruppene (figur 4).
Western blot-analyse med angitte antistoffer, α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. Diagrammet viser den midlere (± SEM) proteinnivå representert i vilkårlige enheter (A.U). (*, P 0,05 av Student t-test).
Inflammatory Pathways
systemisk inflammasjon ble beregnet ved hjelp av pasientenes serum CRP-nivå (tabell 1). Pasientene ble klassifisert til å ha systemisk inflammasjon hvis deres CRP ble ≥10 mg /l. Det var ingen forskjell i andelen av pasienter med eller uten systemisk inflammasjon i henhold til definisjonen av kakeksi. Nivåer av fosfor-NFkB og fosfor-STAT3 var ikke signifikant forskjellig hos pasienter med eller uten kakeksi (bruker noen av definisjonene: tabell 4). Eller med eller uten systemisk inflammasjon (Figur 5)
(A) Western blot-analyse i nærvær eller fravær av systemisk inflammasjon med angitte antistoffer, ble α-tubulin anvendt som en lasting kontroll. (B) Diagram viser den midlere (± SEM) proteinnivået av fosfo-NF-kB, representert i vilkårlige enheter (A.U). (C) Representant immunhistokjemi og kjerner telling av fosfor-STAT3 (område vist er representative for feltet) av en pasient med eller uten systemisk inflammasjon. (D) Diagram viser flekker tetthet av fosfo-STAT3 kjerner (AU) (± SEM) i nærvær eller fravær av systemisk inflammasjon.
Diskusjoner
Fibre Size
Den diagnostiske kriterium for kreft kakeksi har lenge vært basert på vekttap alene [1] og kan reflektere tap i enten fett eller avdelinger lean vev. Gitt at nøkkelen vevstap i kreft kakeksi anses å være skjelettmuskulatur, foreslo en konsensusprosess som de diagnostiske kriteriene for kakeksi bør også ta hensyn til lave grunnlinjenivå muscularity [1]. I denne studien, når pasientene ble klassifisert som cachectic eller ikke i henhold til ≥5% vekttap var det ingen signifikant forskjell i hele kroppen muscularity (FFMI) eller muskel fiber CSA. I kontrast, når pasientene ble klassifisert i henhold til lav muscularity og ≥2% vekttap, ble FFMI redusert og fiber tverrsnitt ble også betydelig redusert (figur 1). Slike resultater viser at heterogenitet i forhold til lav muscularity og fiber atrofi kan reduseres i samsvar med den kliniske definisjonen av kakeksi. Dette funnet kan være viktig, spesielt når de vurderer inklusjonskriteriene for kliniske studier som tar sikte på å teste effekten av legemidler rettet mot reversering av muskelsvinn hos kreftpasienter. Reduksjonen i størrelse fiber i alle MyHC isoformer observert i denne studien er i samsvar med tidligere dyr [20] og humane studier av kreft kakeksi [4] – [7]. Rectus muskel av pasienter med oesophago-magekreft kakeksi har vist seg å tape alle type MyHC innhold, så vel som gjennomgår en reduksjon i fiber størrelse [4]. Like i bukspyttkjertelen kreftpasienter med kakeksi, ble både type I og type II MyHC protein nivåer redusert med 45% sammenlignet med kontroller [6].
Fibertype
For å studere forskjeller i muskel fiber morfologi og sammensetning innenfor de ulike kreftkakeksi kategorier, utførte vi immunhistokjemisk analyse av menneskelige muskelprøver. For at vi først etablert og validert fargemetoder for myosin tungkjede antistoffer som er spesifikke for de ulike fibertyper (I, IIa og IIb). Farging for type I og Ila fibre ført til en sterk spesifikk farging spesifisitet, men bare svak farging ble observert mot type Ilb MyHC, har dette funnet også blitt rapportert andre steder [19]. De dominerende typer MyHC fiber i rectus abdominis muskelen er I og Ila og bare 8% av type IIb positive fibre er tidligere blitt beskrevet [21]. Av de voksne skjelett isoformer, er hvert uttrykt i varierende grad i både mus og menneskelig skjelettmuskulatur. Imidlertid, selv om MyHCIIb blir høyt uttrykt både på budbringer-RNA (mRNA) og proteinnivå i murine skjelettmuskel, bevisene inntil nå indikerer at denne isoformen er effektivt bare uttrykkes på mRNA-nivå i en meget liten del av spesialiserte muskler i voksent menneske [22]. Som nevnt ovenfor, er MyHCIIb uttrykk vanligvis assosiert med høye krefter sammentrekning kombinert med hurtig kontraktile egenskaper, og det har blitt foreslått at de kontraktile egenskaper ved MyHCIIb kan være inkompatibel med de biomekaniske begrensninger av større muskler [23], noe som kan forklare mangelen av spesifisitet funnet i rectus muskel av vår pasientpopulasjon.
i kakeksi det er motstridende bevis om hvorvidt det er selektivt tap av fibertype. Det var ingen bevis for selektiv tap av fiber type i denne studien (tabell 2). Bevis fra dyremodeller antyder at type II fibrene er rettet selektivt [24], med relativ bevaring av type I fibre i fastende [25], eksponering for glukokortikoider [26], sepsis [27] og i gastrocnemius muskel av C26 modell av kreft kakeksi [28], [29]. Modeller av kardial kakeksi, men har foreslått en tendens til selektivt tap av type I-fibre og en økning i type II fiber [30]. Videre er ikke alle grupper demonstrert Type I og II fiber forskjeller selv hos dyr. Faktisk i en fersk studie av C26 cachectic musemodell, både glykolytiske og oksidative fibre av (extensor digitorum longus) EDL muskelgikk sløse [20], mens det i en tidligere studie med samme mus modell var det en betydelig økning i mengden av MyHCIIb og en betydelig reduksjon i mengden av type 1 MyHC i soleus muskelen [31]. Det er foreløpig ikke helt klart hvilken type fiber er berørt i human kreft kakeksi, men hos pasienter med oesophago-magekreft kakeksi tidlig tap av alle MyHC isoformer har blitt rapportert [4].
aktivitetsmønstre en muskel er også viktige for å bestemme fenotype. Hvis muskelceller rekrutteres sjelden de utvikler seg til raske /glykolytiske enheter mens hvis de er rekruttert oftere, danner de langsomme /oksidative enheter. I C26 musemodell for kreft kakeksi, har det vært rapporter om bytting av myosin isoformer i soleus muskelen av cachectic mus [31]. I bukspyttkjertelkreft pasienter med kakeksi, ble ingen forskjell i forholdet mellom høy /lav myosin isoform demonstrerte sammenlignet med kontroller [6].
Muscle RNA, DNA og proteininnhold
I den foreliggende studien sammenlignet med ikke-kakektiske pasienter, ble muskelproteininnholdet reduseres betydelig (ca. 13%) hvis pasientene ble klassifisert som kakeksi etter enten 5% WL (p = 0,015) eller LM + 2% WL (p = 0,035), og med 10% hos pasienter med 10% WL. Proteininnhold uttrykt i forhold til vekten av våt muskel har vist seg å avta gradvis (i overkant av 50%) i gastrocnemius muskelen hos mus med MAC-16 tumor [32]. Dette tyder på at ikke bare er det tap av fiberdiameteren, men at kvaliteten av fiberen forandres med tap av sarkoplasmatisk enten eller myofibrillære protein. Slike endringer i fibersammensetningen kan bidra til redusert muskel mekaniske kvalitet (kraft pr enhet tverrsnittsareal) observert i human kreft kakeksi [33].
En reduksjon i både RNA-innhold og aktivitet i skjelettmuskel har vært tilskrives en depresjon av proteinsyntese i mus som bærer den MAC16 tumor [32]. I denne studien, RNA innholdet var uforandret i cachectic pasienter (klassifisert enten med 5% WL eller LM + 2% WL) sammenlignet med ikke-cachectic pasienter. En reduksjon i RNA-innholdet i muskelen hos mus med Ehrlich ascites tumor er også blitt rapportert, men dette forekom senere enn den observerte depresjon i graden av proteinsyntese [34]. Enten muskelproteinsyntese er trykket i human cancer cachexia gjenstår å bli løst [10].
I en murin modell av kreft kakeksi DNA-innhold av gastrocnemius muskelen har vist seg å være relativt konstant, til tross for funn av en reduksjon i protein og RNA-innhold [32].
