Abstract
Vi har tidligere utviklet musemodeller av HER-2-positive livmorhalskreft. Tumorer i nakne mus hadde histologiske strukturer tilsvarende til den opprinnelige tumor og ble farget med anti-HER-2-antistoff i samme mønster som pasientens kreft. Vi har også tidligere utviklet tumor-targeting
Salmonella typhimurium
A1-R og har vist sin effektivitet mot pasient-avledet tumor musemodeller, både alene og i kombinasjon. I denne studien, bestemt vi effekten av
S
.
typhimurium
A1-R i kombinasjon med trastuzumab på en pasient-kreft nude-mus modell av HER-2 positive livmorhalskreft. Mus ble randomisert til 5 grupper og behandlet som følger: (1) ingen behandling; (2) carboplatinum (30 mg /kg, ip, ukentlig, 5 uker); (3) trastuzumab (20 mg /kg, ip, ukentlig, 5 uker); (4)
S
.
typhimurium
A1-R (5 × 10
7 CFU /body, ip, ukentlig, 5 uker); (5)
S
.
typhimurium
A1-R (5 × 10
7 CFU /body, ip, ukentlig, 5 uker) + trastuzumab (20 mg /kg, ip, ukentlig, 5 uker). Alle regimer hadde signifikant effekt sammenlignet med de ubehandlede mus. Den relative tumor volum av
S
.
typhimurium
A1-R + trastuzumab-behandlede mus ble mindre i forhold til trastuzumab alene (p = 0,007) og
S
.
typhimurium
A1-R alene (p = 0,039). Ingen signifikant kroppsvekttap ble funnet sammenlignet med ingen behandling gruppen med unntak av carboplatinum-behandlede mus (p = 0,021). Ved histologisk undersøkelse, ble levedyktige kreftceller ikke oppdaget, og erstattet av stromale celler i svulster behandlet med
S
.
typhimurium
A1-R + trastuzumab. Resultatene av denne studien tyder på at
S
.
typhimurium
A1-R og trastuzumab i kombinasjon er svært effektive mot HER-2-uttrykke livmorhalskreft
Citation. Hiroshima Y, Zhang Y, Zhao M, Zhang N, Murakami T, Maawy A, et al. (2015) Tumor-målretting
Salmonella typhimurium
A1-R i kombinasjon med trastuzumab Eradicates HER-2-positive livmorhalskreftceller i Pasient Avledet musemodeller. PLoS ONE 10 (6): e0120358. doi: 10,1371 /journal.pone.0120358
Academic Redaktør: Juri G. Gelovani, Wayne State University, USA
mottatt: 26 september 2014; Godkjent: 20 januar 2015; Publisert: 05.06.2015
Copyright: © 2015 Hiroshima et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Alle data som ligger til grunn funnene i denne studien er fritt tilgjengelig i avisen. Eventuelle spørsmål kan rettes til forfatterne ([email protected])
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av National Cancer Institute stipend tall CA CA132971 og CA142669 og JSP KAKENHI tilskuddsordninger nummer 26830081 til YH, 26462070 til IE og 24592009 til KT. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Yong Zhang, Ming Zhao og Nan Zhang er ansatt i Anticancer Inc. Yukihiko Hiroshima, Takashi Murakami, Mako Yamamoto, Shinji Miwa, Shuya Yano, og Robert M. Hoffman er ubetalte filialer av kreftbekjempende Inc. Sumiyuki Mii, Fuminari Uehara, Masashi Momiyama og Takashi Chishima var tidligere agenter av kreftbekjempende Inc. Robert M. Hoffman er en PLoS ONE Editorial Board Member. Anticancer Inc. markedsfører dyremodeller av kreft. Det er ingen andre konkurrerende interesser. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Livmorhalskreft er den nest vanligste kreftformen hos kvinner [1]. Det var 454,000 tilfeller og 200.000 dødsfall i 2010 på verdensbasis og 11.000 nye tilfeller og 3870 dødsfall fra livmorhalskreft i USA [2, 3]. Paclitaxel, carboplatin, cisplatinaindusert, bleomycin, mitomycin-C, vinkristin og irinotecan er brukt for livmorhalskreft [4]. Men det er ingen standard behandling for livmorhalskreft.
Forekomsten av HER-2 positivitet i livmorhalskreft ble rapportert fra 1% til 21% [5], og overekspresjon av HER-2 har vært forbundet med mer avanserte stadier og en dårligere prognose [6, 7].
Vi har tidligere utviklet musemodeller av HER-2-positiv pasient livmorhalskreft [8]. Vårt laboratorium har også tidligere utviklet en genetisk modifisert bakterier belastning,
Salmonella typhimurium
A1-R, valgt for svulst målretting in vivo.
S
.
typhimurium
A1-R er auksotrof for leu og arg [9]. Strekk mål og vokser i svulster. I kontrast er normalt vev ryddet av disse bakteriene selv i immunsvikt atymiske mus.
S
.
typhimurium
A1-R er effektiv mot prostatakreft [10], brystkreft [11, 12], bukspyttkjertelkreft [13-16], gliom [17, 18], lungekreft [19], fibrosarkom [ ,,,0],20, 21], osteosarkom [22] og eggstokkreft [23].
i denne studien, viser vi effekten av
S
.
typhimurium
A1-R i kombinasjon med trastuzumab på musemodeller av pasienten livmorhalskreft uttrykker HER-2.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
All dyrestudier ble gjennomført med en anticancer Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) -protocol spesielt godkjent for denne studien og i samsvar med de prinsipper og prosedyrer som er skissert i National Institute of Health guide for omsorg og bruk av dyr i henhold Assurance Antall A3873 -1. For å minimalisere enhver lidelse av dyrene bruk av anestesi og analgesi ble anvendt for alle kirurgiske eksperimenter. Dyr ble bedøvet ved intramuskulær injeksjon av en 0,02 ml oppløsning av 20 mg /kg ketamin, 15,2 mg /kg xylazin, og 0,48 mg /kg acepromazin maleat. Responsen av dyr under operasjonen ble overvåket for å sikre tilfredsstillende anestesidybden. Ibuprofen (7,5 mg /kg oralt i drikkevannet hver 24. time i 7 dager etter kirurgi) ble anvendt for å tilveiebringe analgesia post-operativt i kirurgisk-behandlede dyr. Dyrene ble observert på en daglig basis og humant avlivet av CO
2 inhalasjon når de møtte følgende humane endepunktkriterier: utmattelse, hudlesjoner, betydelig vekttap, pustevansker, neseblødning, roterende bevegelse og kroppstemperaturfall. Bruken av dyr som var nødvendig for å forstå in vivo-effektiviteten, spesielt, anti-metastatisk effekt av de testede midler. Dyrene ble huset med ikke mer enn fem per bur. Dyrene ble plassert i en barriere anlegget på en høy effektivitet partikkelfilter luft (HEPA) utfelt stativ under standard betingelser for 12-timers lys /mørke sykluser. Dyrene ble fôret en autoklav laboratorium gnagerdiett (Supp. Informasjon S1).
Dyr
Kvinne atymiske (
nu /nu
) hårløse mus (Anticancer, Inc., San Diego, CA), 4-6 uker gamle, ble anvendt i denne studien. Mus ble oppbevart i en barriere anlegg under HEPA filtrering. Mus ble matet med Autoclaved laboratorium gnagerdiett. Alle mus kirurgiske prosedyrer og avbildning ble utført med dyrene bedøvet ved intramuskulær injeksjon av en 0,02 ml oppløsning av 20 mg /kg ketamin, 15,2 mg /kg xylazin, og 0,48 mg /kg acepromazin maleat. Alle dyrestudier ble gjennomført med en anticancer Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) -protocol spesielt godkjent for denne studien og i samsvar med de prinsipper og prosedyrer som er skissert i National Institute of Health Guide for omsorg og bruk av dyr i henhold Assurance Antall A3873-1.
Prøvetaking
pasienten gitt skriftlig informert samtykke og kreft prøven ble anskaffet under godkjenning av Institutional Review Board ved University of California i San Diego.
Subkutan implantering av pasientens livmorhalskreft
tumorvev ble oppnådd fra HER-2-positiv kreft i livmorhalsen pasient ved kirurgi og skåret i fragmenter (3-mm
3) og transplantert subkutant i nakne mus [ ,,,0],8].
tissue histologi
tumorvev ble fjernet sammen med omgivende normalt vev ved reseksjon. Vevene ble fiksert i 10% formalin og innstøpt i parafin før seksjonering og farging. Vevssnitt (3 um) ble deparaffinized i xylen og rehydrert i en etanol-serien. Hematoxylin og eosin (H Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA) ved 4 ° C over natten. Bindingen av primære antistoffer ble påvist ved anvendelse av anti-kanin sekundære antistoffer og et avidin /biotin /pepperrot-peroksydase-kompleks (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan) i 30 minutter ved romtemperatur. De merkede antigener ble visualisert med DAB kit (DAKO Cytomation). Til slutt ble seksjonene kontra med hematoxylin og undersøkt med en BH-2 mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) er utstyrt med en INFINITY1 2,0 megapiksel CMOS digitalkamera (Lumenera Corporation, Ottawa, Canada). Alle bildene ble anskaffet ved hjelp INFINITY ANALYSE programvare (Lumenera Corporation) uten etter oppkjøpet prosessering.
Behandling av pasient livmorhalskreft vokser i nakne mus
Seks uker etter implantering, musene ble randomisert til 5 grupper og behandlet som følger: (1) ingen behandling; (2) carboplatinum (Selleck Chemicals, Houston, TX, USA, 30 mg /kg, ip, ukentlig, 5 uker); (3) trastuzumab (Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA, 20 mg /kg, ip, ukentlig, 5 uker); (4)
S
.
typhimurium
A1-R (5 × 10
7 CFU /body, ip, ukentlig, 5 uker); og (5)
S
.
typhimurium
A1-R (5 × 10
7 CFU /body, ip, ukentlig, 5 uker) + trastuzumab (20 mg /kg, ip, ukentlig, 5 uker) ble gitt samtidig. Hver behandling arm omfattet 6 tumorbærende mus. Tumorstørrelse ble bedømt hver 3 eller 4 dager ved kalibermålinger og det omtrentlige volum av tumoren ble beregnet ved bruk av formelen 4 /3π (d /2)
to D /2; hvor d er mindre tumor akse og d er den store aksen tumor. Kroppsvekt av musene ble målt på en balanse hver 3. eller 4. dag. Relativ tumorvolum og kroppsvekt ble beregnet ved sammenligning med dag-1-verdier. Svulster ble fotografert med et Canon EOS 60D digitalt kamera med en EF-S18-55 IS objektiv (Canon, Tokyo, Japan) og høstet for analyse.
Evaluering av histopatologiske svar
Histopatologisk respons kjemoterapi ble definert i henhold til Evans vurderingsordningen: Grade jeg, lille ( 10%) eller ingen svulst celle ødeleggelse er tydelig; Grade II a, ødeleggelse av 10% -50% av tumorceller; Grade II b, ødeleggelse av 51% -90% av tumorceller; Grad III, få ( 10%) levedyktige-vises tumorceller er til stede; Grade IV, ingen levedyktige kreftceller er tilstede [24, 25].
Statistisk analyse
PASW Statistikk 18,0 (SPSS, Inc) ble brukt for alle statistiske analyser. Endelig tumorvolum (ved dag-36) i hver behandlingsgruppe ble sammenlignet med den ubehandlede kontroll ved hjelp av en 2-tailed Student
t
-test. En p-verdi på ≤ 0,05 ble ansett som statistisk signifikant for alle sammenligninger.
Resultater og Diskusjon
Histologi av den opprinnelige svulsten er bevart i musen
Ark-lignende vekst uten kjertel dannelse og stromale vev med fibroblastisk spredning, som trengte inn i reder av kreftceller ble observert i H E farget deler av den opprinnelige tumor (figur 1A). Oval til spindel-formet kreftceller med høy kjernefysiske /cytoplasma ratio ble funnet i høye forstørrelse bilder (fig 1b). I De immun seksjoner med anti-HER-2-antistoff, ble membranen og cytoplasma av kreftceller sterkt farget, men ingen farging ble funnet i det stromale vev (figur 1C og 1D). Alt mus dyrket cervical pasient-avledet tumor hadde histologiske strukturer tilsvarende til den opprinnelige tumor og ble farget med anti-humant HER-2-antistoff (figur 1E-1 H), noe som tyder på at modellen sammenfatter den biologiske oppførsel av den opprinnelige tumor [8] .
(A) H E-fargede delen av den opprinnelige pasientens tumor. (B) høy forstørrelse bilde av (A). (C) immunostained delen av den opprinnelige pasientens tumor ved anvendelse av anti-HER-2-antistoff. (D) høy forstørrelse bilde av (C). (E) H E-fargede delen av muse vokst svulst. (B) høy forstørrelse bilde av (F). (G) immunostained seksjon av muse-tumor dyrket ved hjelp av et anti-HER-2-antistoff. (H) høy forstørrelse bilde av (G). Skala barer: 200 mikrometer (A, C, E og G) og 25 mikrometer (B, D, F og H)
S
..
typhimurium
A1-R + trastuzumab-kombinasjonen er effektiv mot pasient-avledet livmorhalskreft vokser i nakne mus
De relative tumorvolumer på dag-36, sammenlignet med dag-en, i hver gruppe var som følger: (1) ingen behandling: 10,23 ± 2,91; (2) carboplatinum: 1,02 ± 0,43; (3) trastuzumab: 1,23 ± 0,50; (4)
S
.
typhimurium
A1-R: 0,54 ± 0,40; (5)
S
.
typhimurium
A1-R + trastuzumab: 0,08 ± 0,04 (figur 2A). Alle regimer hadde signifikant effekt sammenlignet med de ubehandlede mus. Den relative tumor volum av
S
.
typhimurium
A1-R + trastuzumab-behandlede mus var mindre enn med trastuzumab behandling alene (p = 0,007) eller
S
.
typhimurium
A1-R behandling alene (p = 0,039) (figur 2A).
(A) Vekstkurver av subkutan tumor behandles med ulike rusmidler. Verdiene er middel relative tumorvolumer ± S.D. (barer) i fem forskjellige svulster. * P 0,05, ** p 0,01. (B) Kroppsvekt kurver av mus med subkutane tumorer som ble behandlet med de angitte stoffene. Verdiene er middel relative kroppsvekt ± S.D. (barer) i fem forskjellige mus
Den relative kroppsvekt på dag-36, sammenlignet med dag-en, i hver gruppe var som følger: (1) ingen behandling. 1,13 ± 0,14; (2) carboplatinum: 0,93 ± 0,06; (3) trastuzumab: 1,04 ± 0,22; (4)
S
.
typhimurium
A1-R: 1,09 ± 0,06; (5)
S
.
typhimurium
A1-R + trastuzumab: 1,00 ± 0,08. Ingen signifikant kroppsvekttap ble funnet i forhold til de ubehandlede mus, med unntak av carboplatinum-behandlede mus (p = 0,021) (figur 2B).
S
.
typhimurium
A1-R + trastuzumab eradicates HER-2-positive livmorhalskreftceller i mus som er observert i histologiske snitt
Histopatologisk respons på behandlingen ble definert i henhold til Evans vurderingsordningen. I vevssnitt fra ubehandlet mus, ble mange kreftceller observert (figur 3F). Omtrent 30% av kreftceller ble ødelagt og erstattet av stromale celler i vev seksjoner fra mus behandlet med carboplatinum (figur 3G). Sytti prosent av kreftceller ble ødelagt i vevssnitt fra mus behandlet med trastuzumab (Fig 3H). Seksti prosent av kreftceller ble ødelagt i vevssnitt fra mus behandlet med
S
.
typhimurium
A1-R (Fig 3I). I vev seksjoner fra mus behandlet med
S
.
typhimurium
A1-R + trastuzumab, levedyktige kreftceller ble ikke oppdaget, og ble erstattet av stromale celler (figur 3J). Ubehandlet kontrollgruppe ble bedømt som klasse I; carboplatinum behandling som IIa; trastuzumab behandling som IIb;
S
.
typhimurium
A1-R behandling som IIb; og
S
.
typhimurium
A1-R + trastuzumab behandling som III-IV. Disse resultatene tyder på
S
.
typhimurium
A1-R + trastuzumab kan utrydde HER-2-positive livmorhalskreft hos mus.
(A) Ubehandlet kontroll. (B) Carboplatinum-behandlede mus. (C) trastuzumab-behandlede mus. (D)
S
.
typhimurium
A1-R-behandlede mus. (E)
S
.
typhimurium
A1-R + trastuzumab-behandlede mus. Disse bildene ble tatt på dag-36. Skala barer: 10 mm. Histopatologiske respons på behandlingen ble definert i henhold til Evans vurderingsordningen. Effekten av behandling med ubehandlet kontroll (F) ble bedømt som klasse I; carboplatinum (G) som Ila; trastuzumab (H) som IIb;
S
.
typhimurium
A1-R (I) som IIb; og
S
.
typhimurium
A1-R + trastuzumab (J) som III-IV. Skala barer:. 200 mikrometer
mekanismene for den sterke effekten av kombinasjonen av
S
.
typhimurium
A1-R og trastuzumab er ikke avklart. En medvirkende årsak kan være evnen til
S
.
typhimurium
A1-R for å stimulere (lokkefugl) cellesyklusen av hvilende, resistente celler, som deretter begynner å sykle og blir følsomme for trastuzumab [26]. Etter å ha funnet den sterke effekten av kombinasjonen av
S
.
typhimurium
A1-R og trastuzumab i subkutane modeller, fremtidige eksperimenter vil utnytte ortotopiske modeller, ved hjelp av kirurgisk orthotopic implantasjon (SOI) -metoden vårt laboratorium har utviklet for pasient svulster [27-32]. Tilgang på
S
.
typhimurium
A1-R til ortotopiske svulster har tidligere blitt demonstrert av oss [8-24]. Tilgang til trastuzumab behandling i ortotopiske modeller har allerede blitt demonstrert av oss så vel [33]. De orthothopic modeller av en serie av HER-2 positiv og blandet HER-2 uttrykker livmorhalskreft vil tillate effektiv testing av kombinasjonen av
S
.
typhimurium
A1-R og trastuzumab mot primær og metastatisk sykdom og videre karakterisering av stromale celler og kreftceller før og etter behandling, samt effekten av leukocytter reduserende regimer etter eller før behandlingen. SOI krever kirurgi og siden ketamin kan påvirke immunsystemet, vil forskjellige anestetika bli sammenlignet for noen effekt på behandlingsrespons i fremtidige eksperimenter.
Takk
Denne artikkelen er dedikert til minne om AR Moossa , MD
