Abstract
Innledning
LDH-A, enzymet som er ansvarlig for å transformere pyruvat til laktat, har vist seg å være oppregulert i mange typer av kreft og for å gi opphav til mer aggressiv atferd ved å regulere spredning og anti-apoptose. Imidlertid har sin ekspresjon i magekreft (GC) ikke blitt karakterisert grundig. Hensikten med denne studien var å avklare uttrykk og potensielle virkningen av LDH-A i GC.
Metoder
Vi undersøkte LDH-A uttrykk ved immunhistokjemi på GC vev microarray (TMA) og bruk Western blot på ferske GC vev og cellelinjer. Prognostisk verdi og sammenheng med andre clinicopathologic faktorer ble vurdert. Vi transfektert siRNA inn i GC-celler mot LDH-A. LDH-A ble analysert ved Western blotting og sanntids RT-PCR. Cellevekst ble evaluert in vitro og in vivo. Laktat og ATP produksjonen av celler ble bestemt.
Resultater
Det var signifikant høyere LDH-A uttrykk i carcinoma enn hos ikke-neoplastisk slimhinnen (NNM). Det var en positiv korrelasjon mellom LDH-A uttrykk med alderen, histologisk type og lymfeknutemetastaser. Overlevelsesanalyse viste at høy ekspresjon av LDH-A i GC var assosiert med en lavere total overlevelse (OS). Når stratifisert etter Lauren klasse og histologisk klassifisering, betydning dukket opp i diffuse type og udifferensiert typen GC. I multivariat analyse, LDH-A uttrykk i GC var en uavhengig prognostisk risikofaktor for OS (hazard ratio = 1,829, 95% KI 1,375 til 2,433, P 0,0001). Spesifikk siRNA mot LDH-A i GC cellelinje retardert cellevekst både in vitro og i musemodeller. LDH-A knockdown også redusert laktat og ATP produksjon i GC-celler.
Konklusjoner
Vår studie indikerte onkogene rollen LDH-A i GC. LDH-A uttrykk er en uavhengig prognostisk risikofaktor i GC pasienter og oppregulert uttrykk for LDH-A kan være forutsigbare for dårlige resultater i diffus type og udifferensiert typen GC. Våre resultater antydet at LDH-A kan være en potensiell terapeutisk mål i magekreft
Citation. Sun X, Sun Z, Zhu Z, Guan H, Zhang J, Zhang Y, et al. (2014) Clinicopathological Betydning og prognostisk verdi av laktatdehydrogenase Et uttrykk på magekreft pasienter. PLoS ONE 9 (3): e91068. doi: 10,1371 /journal.pone.0091068
Redaktør: Anthony W.I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 12. august 2013, Godkjent: 07.02.2014; Publisert: 07.03.2014
Copyright: © 2014 Sun et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra forskningsprosjektene i Liaoning-provinsen Science and Technology (No. 2007225017, nr 2009225011-2 og nr 2011415052) og vitenskap og teknologi prosjekter i Shenyang (No. F11-264-1-19). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
de metabolske egenskaper av kreftceller avviker vesentlig fra de i normale celler som kreftceller fortrinnsvis utnytte glykolyse i stedet for mitokondrisk oksidativ fosforylering, selv i nærvær av oksygen; Dette fenomenet er kjent som Warburg virkning [1], [2], [3]. Den overraskende høy hastighet for å ta opp glukose og laktatproduksjon i tumorer i nærvær av oksygen ført Warburg å spekulere i at avvikende metabolisme kan være årsaken til mange kreftformer [2]. Imidlertid er fordelen av den metabolske omdanning overfører til kreftceller er uklar [4], [5]. Nylig har oppdagelsen av sammenhengen mellom onkogener og metabolske prosesser førte til en fornyet interesse for Warburg arbeid. Det er økende bevis indikerer at tilpasning av aerob glykolyse av kreftceller kan legge til rette for kreft spredning [5]. Cancer metabolisme har vært under omfattende leting i håp om å finne nye effektive behandlinger for kreft.
LDH-A, er et viktig enzym som spiller en viktig rolle i det avsluttende trinn av Warburg-effekten ved å omdanne pyruvat til laktat . I forskjellige typer av humane kreftformer, ekspresjonen av LDH-A ble oppregulert [6], [7]. I esophageal plateepitelkarsinom, LDH-A var oppregulert i kreftvevet og fremmet overlevelse av kreftceller [8]. I tillegg, ble LDH-A rapportert å øke vekst og vandring av magekreftceller [9]. Med uttrykket status og funksjonen av LDH-A i magekreft (GC) fortsatt ukjent.
I denne studien undersøkte vi ekspresjonen av LDH-A i en stor kohort av GC prøver og korrelert dens uttrykk med kliniske patologiske parametre og total overlevelse (OS). Våre resultater viser at ekspresjon av LDH-A var oppregulert i de kliniske prøvene magekreft, og protein ekspresjon ble korrelert til alder og histologiske klassifikasjon. I tillegg fant vi at høy LDH-A uttrykk var assosiert med dårligere prognose i GC pasienter. Til sammen vår studie avslørte onkogene funksjon av LDH-A i magekreft og foreslo LDH-A som en ny potensiell prognostisk faktor og en potensiell terapeutisk mål.
Materialer og metoder
Pasienter
Denne studien inkluderte 264 pasienter med GC som fulgte kurativ kirurgi fra januar 2006 til mai 2007 på First Affiliated Hospital Kina Medical University. Gruppen besto av 194 menn og 70 kvinner med en gjennomsnittsalder på 59 (range, 29-81) år. Ingen av pasientene gjennomgikk kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Oppfølging informasjonen var blitt samlet inn fra alle pasienter.
Etikk erklæringen
Etisk godkjenning for denne forskningen ble hentet fra forskningsetiske komité for Kina Medical University, Kina. Alle pasienter som gir svulstvevet samt normale prøver mage vev signerte en samtykkeerklæring før kirurgisk fjerning av magekreft for å tillate denne forskningen som skal gjennomføres. Alle dyr studie prosedyrer var i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og ble utført i henhold til de institusjonelle etiske retningslinjer. Disse forsøksdyr ble kjøpt fra Shanghai Branch Center, Institutt for laboratorie Animal Science, Chinese Academy of Medical Science (også kjent som Shanghai CAS, sertifikat nummer: SCXK [Hu] 2003-0003). Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med institusjonens retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr, og protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité i Kina Medical University, Shenyang, Kina. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse.
vevsprøver og patologi
Alle pasient-avledet parafin innebygd magekreft prøver (n = 264) og deres matchede NNM prøver (2 cm fra carcinoma n = 209) ble samlet inn fra kirurgisk reseksjon og arkivert i henhold til protokoller godkjent av Institutional Review Boards of the First tilknyttet Hospital Kina Medical University. Frisk gastrisk karsinom og tilstøtende NNM ble samlet og frosset i -80 ° C inntil proteinekstraksjon ved homogenisering i RIPA lysebuffer. Den histologiske diagnose og andre mikroskopiske kjennetegn ble bekreftet av patologer og TNM staging for hver magekreft ble evaluert i henhold til Union International Contre le Cancer (UICC) system for omfanget av tumor spredning. Histologisk arkitektur av magekreft ble uttrykt i Lauren klassifisering og Verdens helseorganisasjon (WHO) klassifikasjon. Videre ble tumorstørrelse, dybden av invasjonen, og lymfatiske bestemt.
Cellelinjer og kultur
Den menneskelige magekreft cellelinjer MKN28 (vel differensiert), AGS, SGC-7901 (moderat differensiert ), MGC803 (dårlig differensiert) og den menneskelige normal magecellelinje GES-en er kjøpt fra cellen bank av Chinese Academy of Sciences. Fem cellelinjer ble holdt i RPMI 1640 (Hyclone, Logan by, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Alle cellelinjene var i en 5% CO
2 fuktig atmosfære ved 37 ° C.
Tissue microarray (TMA) og Immunohistochemistry
Representative områder av solide svulster og tilstøtende NNM ble identifisert i HE-fargede delene av utvalgte tilfeller og en 1,5-mm-diameter vev kjerne per donor blokken ble stanset ut og overført til en mottaker blokk med et maksimum på 200 (10 x 20) kjerner ved anvendelse av en 1,5 mm diameter dor instrument. Etter re-smeltet, ble deler (4 mikrometer tykke) fortløpende kuttet fra hvert vev microarray blokk, HE farging ble utført på TMA for bekreftelse av svulsten og mucosavev. ble utført immunhistokjemisk analyse på TMA-seksjoner, ble trykkoker mediert antigen gjenfinning utføres i citrat-buffer (pH 6,0) i 10 minutter. Seksjoner ble inkubert med 1:300 fortynning av LDH-A (muskel-underenhet) Kanin monoklonalt antistoff (epitomics) over natten ved 4 ° C, og deretter inkubert med geite-anti-mus eller anti-kanin Envision System Plus-HRP (Dako Cytomation) for 30 min ved romtemperatur. Etter skylling tre ganger i PBS i 10 minutter hver, ble seksjonene inkubert med DAB i 1 minutt, motfarget med hematoksylin mayer, dehydrert, fjernet og montert. Utelatelse av det primære antistoff ble anvendt som en negativ kontroll.
Western Blot analyse
Proteiner konsentrasjoner av prøver ekstrahert fra vevsprøver og cellelinjer ved hjelp Radioimmun utfelling analyselyseringsbuffer ble bestemt ved anvendelse av Bradford-reagens ( Sigma) i henhold til produsentens instruksjoner. Denaturert protein ble separert på en natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgel (10% akrylamid) og overført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Bedford, MA), som deretter ble blokkert i 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann (pH 7,5). For immunoblotting ble membranen inkubert over natten med LDH-A (muskel-underenhet) Kanin-monoklonalt antistoff (1:1500) (epitomics) ved 4 ° C. Deretter ble det skyllet med TBST og inkubert med sekundære antistoffer i 15 minutter. Signaler ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens (Pierce, Rockford, IL).
Oppfølging etter kirurgi
264 pasienter som gjennomgikk gastroctomy ble utsatt for nøye klinisk observasjon, inkludert bryst /buk /bekken computertomografi (CT) bildebehandling, CEA nivå, og blodprøver på 2 til 3 måneders intervall og en årlig gastroskopi. Oppfølging var i samsvar med National Comprehensive Cancer Network (NCCN) Praksis Retningslinjer ved magekreft. Total overlevelse (OS) Hastigheten ble definert som intervallet fra den første operasjonen til døden. Sluttdato for oppfølgingsstudie for å gjennomføre analysen var 29. juni 2012.
Evaluering av immunhistokjemisk farging
immunreaktivitet ble vurdert uavhengig av to forskere som var blindet for pasientens utfall. Evalueringen var basert på fargeintensitet. Fargeintensitet for LDH-A ble scoret som 0 (negativ); 1 (svak); 2 (moderat); og 3 (sterk). Prøvene ble delt inn i to grupper etter deres score: 0 og 1 er lav uttrykk gruppe; 2 og 3 er høy ekspresjon gruppe. I tilfelle en uoverensstemmelse i scoring, lysbildene ble re-undersøkt av både patologer under et mikroskop.
generasjon av små interfererende (si) RNA Knockdown stabile cellelinjer
Basert på LDH -A-sekvensen, shRNA er utformet ved hjelp av siRNA Target Finder (Ambion): nukleotidsekvensen av det innsatte ShLDH-A var 5′-ATCCAGTGGATATCTTGACCTACG TGGCT-3 «. Cellelinjen ble generert ved å infisere celler med egge plasmid ble brukt som en kontroll. 10 ug shRNA og 25 ul Lipofektamin 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ble blandet sammen med 1350 ul RPMI-1640 medium (uten FBS), og blandingen ble deretter transfektert inn i MGC-803 magekreftceller. Blandingen ble tilsatt til en 25-cm
to kulturflaske som tidligere var belagt med 1 x 10
6 MGC-803 magekreftceller. Dyrkningsmediet ble erstattet med komplett RPMI-1640 medium 6 timer etter vaksinasjonen, og med 28 timer etter transfeksjon ble stabile cellekloner valgt for 2 uker med neomycin og analysert ved immunoblotting.
RNA Utvinning og Real-time kvantitativ RT-PCR-analyse
Total RNA ble isolert fra celler ved hjelp av TRIzol-reagens i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen), og 1 ug RNA ble behandlet direkte til cDNA ved anvendelse av en revers transkripsjon kit (Promega, Madison, Wisconsin), i henhold til produsentens instruksjoner. Amplifikasjons-reaksjoner ble utført i en 20 ul volum med 0,2 ul av SYBR grønn (Bio-Rad, Hercules, California). Disse reaksjoner ble utført i triplikat ved anvendelse av en BioRad iCycler (Bio-Rad). p-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Primerne som ble brukt var som følger: LDH-A, 5′-CTCCTGTGCAAAATGGCAAC-3 «(fremover) og 5′-CCTAGAGCTCACTAGTCACAG-5′ (revers); andβ-Actin, 5»-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3 «(fremover) og 5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3» (bakover). Spesifisiteten til sanntids-kvantitativ PCR ble verifisert ved smelting kurve analyse og agarosegel-elektroforese.
MTT og kolonidannelse Assay
For cellevekstanalyse, et likt antall celler ble sådd ut i 48 -vel platene. Det totale antall av celler ble målt hver dag av MTT-analysen ifølge produsentens protokoll (Roche Applied Science). For kolonidannelse analyse, ble likt antall kontrollceller og celler støydempere ekspresjonen av LDH-A sådd ut på 60 mm kulturskål i tre eksemplarer. Celler ble dyrket i 7 dager, Cellevekst ble stoppet etter 7 dager i kultur ved å fjerne medium og tilsetning av 0,5% krystallfiolett oppløsning i 20% metanol. Etter farging i 5 minutter, ble de fikserte cellene ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS), fotografert og oppløst med 1% SDS. Antallet kolonier i hver gruppe ble telt.
tumorigenitet analysen
MGC-803 GC celler xenotransplantater ble produsert på seks uker gamle kvinnelige atymiske nakne mus (Vital River Laboratories, Beijing, Kina) ved injeksjon av 5 x 10
6-celler i 0,2 ml PBS inn i flanken av hver mus (6 mus /gruppe). Svulstdannelse ble vurdert hver uke. Tumorvolumet ble beregnet i henhold til formelen:. V (mm
3) = a x b
2/2 (der a er den største overfladisk diameter og b er den minste overfladisk diameter)
måling av laktatkonsentrasjonen og ATP Produksjon
Etter 48 timers inkubasjon, laktat, og ATP nivåer i kulturmediet ble målt ved hjelp av kommersielt tilgjengelige analysesett (kjøpt fra BioVision [Mountain View, California], og Roche Applied Science , henholdsvis). Resultatene ble korrigert for den endelige celletall nummer.
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 17.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). Totalt overlevelse ble bestemt ved hjelp av Kaplan-Meier estimatoren, en hendelse som blir definert som død for kreftrelatert årsak. Log-rank-test ble anvendt for å identifisere forskjeller mellom overlevelseskurver. I univariat analyse, tosidige χ
2 tester eller tosidige t-test ble brukt for statistiske sammenligninger. Og Cox proporsjonal-hazard modellen ble brukt i univariat analyse og multivariat analyse, for å identifisere viktige faktorer korrelert med prognose. For alle analyser, bare P verdier. 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
LDH-A Expression i Human Gastric Cancer Tissue
Vi gradert fargete snitt av TMA av GC og NNM vev kjerner for deres cytoplasma immunhistokjemisk fargingsintensitet mot LDH-A-protein. De lesbare prøver inkludert 264 gastrisk karsinom og 209 matchet NNM. Den typiske diffus cytoplasmisk farging av proteinet kan finnes i mange gastrisk karsinom og normal gastrisk vev, slik som vist i figur 1, kreftvev viste positiv cytoplasmatisk farging for 201 tilfeller (76,14%), mens det blant 209 tilfeller av NNM, 131 tilfeller ( 62,68%) hadde LDH-A positive uttrykk (tabell 1). For å undersøke ekspresjon mengden av LDH-A i GC prøvene, ble ekspresjonen av LDH-A undersøkt ved western blot-analyse i syv tilfeldig valgte svulster og sammenkoblede normale vev. Oppregulering av LDH-A ble observert i GC-prøvene sammenlignet med de sammenkoblede normale vev (Fig. 2a). Disse studiene indikerte at LDH-A var signifikant oppregulert i kreftprøvene sammenlignet med tilstøtende ikke-cancerøse vev (tabell 1. p = 0,002)
LDH-A ble uttrykt i cytoplasma av NNM og karsinomer: a. LDH -A positivitet ble observert i cytoplasma av NNM, ble b LDH-A påvist i cytoplasma av differensiert gastrisk karsinom, c og i dårlig differensiert gastrisk karsinom.
a protein~~POS=TRUNC av LDH -En i mage kreftprøver og sammenkoblede normalt vev ble analysert. b Uttrykk for LDH-A i 4 mage kreft cellelinjer og GES-1 ble bestemt. LDH-A uttrykk i GC cellelinjer MGC803 og AGS ble oppregulert sammenlignet med GES-1. GAPDH ble brukt som en intern kontroll.
Expression Analyse av LDH-A i Gastric cellelinjer
ble utført Western blotting-analyse i mage cellelinjer. Den vestlige blot viste at uttrykk for LDH-A var betydelig sterk i dårlig differensiert MGC803 og moderat differensiert AGS; svak i moderat differensiert SGC-7901 og godt differensiert MKN28; og fraværende i menneskelig normal magecellelinje GES-1 (fig. 2 b).
Clinicopathological Variabler i 264 tilfeller av magekarsinom
Som oppsummert i tabell 2, fant vi ut at økt uttrykk av LDH-A var signifikant assosiert med alder av pasientene (P = 0,004) og histologisk typen (P = 0,02), lymfeknutemetastaser (P = 0,043), men ikke med kjønn (P = 0,072), tumor størrelsen (P = 0,086) , dybden av invasjonen (P = 0,328), lymfatisk invasjon (P = 0,738), Lauren Karakter (P = 0,152) eller TNM stadium (P = 0,417).
Survival Analysis
den 5-årige OS hastighet av 264 pasienter med primær magekreft var 46% (122/264), med 142 dødsfall observert i løpet av oppfølgingsperioden. Median varighet av oppfølging var 50 måneder (range, 9-78 måneder). Survival analyse av Kaplan-Meier overlevelseskurve og log-rank test viste at pasienter med høyt uttrykk for LDH-A i svulstvev hadde signifikant dårligere total overlevelse enn pasienter med tumor lav LDH-A uttrykk (P 0,001 Fig. 3) . Med det formål å utforske potensialet forholdet mellom ekspresjonen av LDH-A og prognosen i forskjellige typer av GC, vurderte vi overlevelse av pasienter i forskjellige undergrupper: Når ble utført statistiske analyser stratifisert ved Lauren karakter og histologisk klassifisering, betydning dukket opp i diffuse Type GC og udifferensiert Type GC (P 0,001, respektivt), men ikke i tarm (P = 0,179) eller differensierte (p = 0,104) seg. Multivariat analyse ble utført ved hjelp av Cox modell for alle de viktige variablene i univariate analysen. Tabell 3 viser betydningen: Justert for andre kovariater, resultatene fra den multivariate analysen viste at LDH-A uttrykk (P 0,001), lymfatisk invasjon (P = 0,046) og Lauren Karakter (P = 0,001), TNM stadium (P = 0,006), men ikke alder (P = 0,053), tumor størrelsen (P = 0,111), dybden av invasjon (P = 0,598), lymfeknutemetastase (P = 0,089), eller histologisk type (P = 0,674), ble uavhengig prognostisk risikofaktorer for OS (tabell 3).
Kaplan-Meier kurver for kumulativ overlevelse av pasienter med GC i henhold til GC vev LDH-A uttrykket (a), Kaplan-Meier kurver for kumulativ overlevelse av pasienter med intestinal-type GC (b) og diffus-type GC (c) stratifisert av Lauren klasse, og Kaplan-Meier kurver for differensiert typen GC (d) og udifferensiert typen GC (e) stratifisert etter Histologisk type.
knockdown av LDH-A av siRNA Reduserer uttrykk for LDH-A i MGC-803
Ifølge vestlige blot resultater og real-time RT-PCR, uttrykket av LDH -En redusert effektivt i LDH-A-siRNA uttrykker MGC-803 celler. Som vist i figur 4, ekspresjon av LDH-A-proteinet analysert ved western blot var knapt synlig, og det PKM2 mRNA-nivået ble redusert med 74% i LDH-A-siRNA som uttrykker MGC-803-celler. LDH-A ekspresjon forble uforandret i begge GC cellelinjer og de cellelinjer som uttrykker en kontroll siRNA.
I LDH-A-siRNA uttrykkende celler, ekspresjon av LDH-A-proteinet analysert ved western blot var nesten ikke påvisbar ( en); Betydelig nedregulering av LDH-A på mRNA-nivået ble oppdaget etter siLDH-A infeksjon (b).
knockdown av LDH-A hemmet veksten av GC cellelinjer MGC-803
For å vurdere tumorcellevekst, brukte vi MTT og kolonidannelse analyser. I MTT-assayet, tie ekspresjonen av LDH-A inhiberte proliferasjonen av MGC-803-celler (fig. 5a, b). Veksten av MGC-803 celler som uttrykker LDH-A siRNA redusert med 64%, etter 168 timers inkubering sammenlignet med den for kontrollcellene (P 0,05). Konsekvent, tie ekspresjonen av LDH-A svekkede den forankrings-uavhengig vekst av MGC-803 celler (fig. 5c, d). LDH-A knockdown i disse cellene forhindret kolonidannelse, hvilket indikerer at forankringsavhengig vekst ble gjenopprettet. Disse resultatene videre foreslått onkogene rollen til LDH-A i GC kreft.
veksten av celler som uttrykker siRNA ble redusert med 64%, etter 168 timers inkubering sammenlignet med den for kontrollcellene i MTT-analysen (en og b, P 0,05). Dempe ekspresjonen av LDH-A svekkede den kolonidannelse av MGC-803-celler (C og D). In vivo tumorigent kapasitet på MGC-803 cellelinjen var signifikant redusert med siRNA knockdown av LDH-A (e og f, p 0,05).
Knockdown av LDHA hemmet tumorgenisiteten i Xenotransplantat musemodeller
i denne studien undersøkte vi tumorigent kapasitet på LDH-A in vivo. Den tumorgenisitet in vivo av MGC-803 siLDH-A-celler og kontrollceller ble undersøkt ved sc injeksjon av celler i atymiske nakne mus. I samsvar med in vitro-studier, silencing uttrykk for LDH-A dramatisk svekket den tumorigenitet av LDH-A celler i tumor størrelse. For alle samsvar xenotransplantater, siLDH-A tumorer var betydelig mindre enn de av kontrollene (fig. 5e, f).
knockdown av LDH-A ved siRNA Reduserer Laktat og ATP-produksjon i human GC Cellelinjer MGC- 803
Fordi LDH-A er nøkkelen enzym for å transformere pyruvat til laktat, bør endring i sitt uttrykk i GC celler påvirker laktatproduksjon og energiomsetning. For å teste denne hypotesen, sammenlignet vi laktat og ATP produksjon mellom LDH-A siRNA knockdown celler og kontrollceller etter en 48-timers inkubasjon. Når LDH-A ble slått ned ved siRNA, til evnen til cellen produsere laktat og ATP ble dramatisk redusert med 61,5% og 63,3% ved 48 timer, henholdsvis (fig. 6a, b).
Etter 48 timers inkubasjon, LDH-A knockdown ført til betydelig redusert laktat (a) og ATP produksjon (b) i MGC-803 celler (p 0,05).
Diskusjoner
i 1920, Warburg første vist at kreftceller ta opp glukose høyere priser enn normale celler og produsere energi nesten ved aerob glykolyse for sin energibehovet for å tilpasse miljømessige begrensninger, slik som periodisk hypoksi [10], [11]. Imidlertid er denne metabolske endringen ikke bare en tilpasning til et hypoksisk miljø, men er en aktiv cellulær strategi som overfører en betydelig fordel for spredning og malignitet. Nå Vegran
et al
. [12] har rapportert at laktat kan direkte modulere fenotype av endotelceller, potensielt representerer en viktig mekanisme som svulster kontrollere sin egen blodtilførsel via vaskulær morphogenesis. Fordi reaktive oksygenarter (ROS) er naturlige biprodukter av mitokondriell respirasjon, er det blitt foreslått at omdannelsen av glukose til laktat kunne beskytte cancerceller fra oksidativt stress [13]. Nylig har funn tyder på at gjeninnføre normal oksidativ fosforylering i kreftceller kan ikke bare inhibere cellevekst og proliferasjon, men også svekke den metastatiske kapasitet av maligne celler [14]. Derfor har betydningen av konstitutivt up-regulert aerob glykolyse nylig blitt anerkjent i tumorprogresjon, men de molekylære mekanismene som fører til denne fenotype og deres bidrag til kreftutvikling er ikke godt forstått.
LDH-A, enzymet ansvarlig for å transformere pyruvat til laktat, spiller en viktig rolle i prosessen med glykolyse. Flere studier har rapportert at uttrykket av LDH-A kan være forårsaket av en rekke onkogener [15]. Disse rapportene støtter ideen om at LDH-A-induksjon er kritisk for den onkogene aktiviteten til disse onkogener i kreftceller.
onkogene aktiviteten av LDH-A er blitt rapportert i spiserørskreft, kreft i bukspyttkjertelen og magekreftceller [ ,,,0],8], [9], [16]. Yongjie Zhang
et al
. rapportert at LDH-En reduksjon kan undertrykke tumorigenitet av magekreft (ITGC) celler intestinal-type ved downregulating Oct4 [17]. Og Zhiyu Wang
et al
. rapportert at LDH-A stanse undertrykker brystkreft tumorigenicity gjennom induksjon av oksidativt stress-mediert mitokondrie vei apoptose [18]. Her, undersøkte vi formalinfiksert, parafin-innleiret svulstvev fra 264 pasienter for ekspresjon av LDH-A og rapporteres karakterisering av LDH-A-ekspresjon i humane GC, og presentere dens korrelasjon med clinicopathological parametere og pasientenes prognose. Først fant vi at uttrykket av LDH-A ble forhøyet i GC prøvene sammenlignet med matchede normalt vev. Dette resultatet kan være forenlig med tidligere undersøkelse som i ulike typer av kreft hos mennesker, ble ekspresjonen av LDH-A oppregulert [4], [5]. I svulstvev, vår studie viste at LDH-A uttrykk var sterkt korrelert med GC clinicopathologic kjennetegn: alder, lymfeknutemetastase og histologisk klassifikasjon. Derfor foreslår vi at oppregulert LDH-A uttrykk kan bidra til proliferasjon og utvikling av GCer. For det andre, analyserte vi videre den prognostiske rollen til LDH-A på total overlevelse av pasienter med GC. Kaplan-Meier analyse viste en signifikant sammenheng mellom LDH-A uttrykk og total overlevelse av pasienter, og pasienter med sterkere LDH-A farging hadde lavere overlevelse. Når statistisk analyse ble utført stratifisert av Lauren klasse og histologisk klassifisering, betydning dukket opp i diffuse typen GC og udifferensiert typen GC, men ikke i tarm eller differensierte seg. Spesifikk siRNA mot LDH-A ble utført i MGC803 celler og retardert cellevekst både in vitro og i musemodeller. LDH-A knockdown også redusert laktat og ATP produksjon i GC-celler. Derfor våre resultater tyder på at ekspresjon av LDH-A var et uavhengig prognostisk faktor på OS, og indikerte at LDH-A kan ha en onkogen rolle i tumorutvikling, særlig i diffust Type GC eller udifferensierte Type GC-pasienter. I samsvar med vår studie er det blitt rapportert at slå ned ekspresjonen av LDH-A i humane hepatocellulære karsinomceller kunne indusere apoptose [8], og nedregulering av LDH-A kunne øke produksjonen av ROS og cytosolisk Ca2 + signalering, noe som reduserte indre mitokondriemembranen potensial og førte til utgivelsen av cytokrom C i leverkreft celler.
til sammen vår studie viser at oppregulert uttrykk for LDH-A gir magekreftceller med vekst fordeler. På samme tid, vår studie antyder LDH-A som et potensielt terapeutisk mål.
