Abstract
Bakgrunn
Cancer stamceller (cscs) er antatt å være ansvarlig for svulst regenerering etter kjemoterapi, selv om direkte bekreftelse på dette er fortsatt forestående. Vi har derfor undersøkt om medikamentell behandling kan berike og vedlikeholde cscs og om de høye tumorogene og metastatiske evner cscs var basert på deres markert evne til å produsere vekst og angiogene faktorer og uttrykke sine beslektede reseptorer for å stimulere tumor celleproliferasjon og stroma formasjon.
metodikk /Funn
Behandling av lunge kreftceller med doksorubicin, cisplatin, eller etoposid resulterte i valg av narkotika overlevende celler (DSCs). Disse cellene uttrykte CD133, CD117, SSEA-3, TRA1-81, Oct-4, og kjernefysisk β-catenin og mistet uttrykk for differensiering markører cytokeratins 8/18 (CK 8/18). DSCs var i stand til å vokse som tumor kuler, opprettholde selvfornyelse kapasitet, og differensiere. Differensierte stamfedre mistet uttrykk for CD133, fikk CK 8/18 og kjøpte narkotika følsomhet. I nærvær av stoffer, ble differensiering av DSCs opphevet slik at formering av celler med CSC-lignende egenskaper. Lung DSCs demonstrert høy tumorogene og metastatisk potensial følgende inokulasjon i SCID-mus, som støttet deres klassifisering som cscs. Luminex analyse av humane og murine cytokiner i sonikerte lysater av parental- og CSC-avledede tumorer viste at CSC-avledede tumorer inneholdt to til tre ganger høyere nivåer av humane angiogeniske og vekstfaktorer (VEGF, bFGF, IL-6, IL- 8, HGF, PDGF-BB, G-CSF, og SCGF-β). Cscs viser også forhøyede nivåer av ekspresjon av humant VEGFR2, FGFR2, CXCR1, 2 og 4 reseptorer. Videre menneskelige cscs vokser i SCID-mus stimulert muse stroma å produsere forhøyede nivåer av angiogene og vekstfaktorer.
Konklusjon /Betydning
Disse funnene tyder på at kjemoterapi kan føre til spredning av cscs og forebygging av deres differensiering. De høye tumorigen og metastatiske potensialer av cscs er forbundet med effektiv cytokine nettverk produksjon som kan representere et mål for økt effekt av kreftbehandling
Citation. Levina V, Marrangoni AM, DeMarco R, Gorelik E, Lokshin AE ( 2008) Legemiddel Valgt Menneskelig Lung Cancer Stem Cells: cytokinnettverket, Svulst og metastatisk Egenskaper. PLoS ONE 3 (8): e3077. doi: 10,1371 /journal.pone.0003077
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: Mai 25, 2008; Godkjent: 08.08.2008; Publisert: 27 august 2008
Copyright: © 2008 Levina et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse studiene ble støttet med tilskudd fra RO1 CA098642, R01 CA108990, Avon (NIH /NCI), Susan Komen Foundation (AEL), og DOD BC051720 stipend, tilskudd fra Harry Lloyd Charitable Trust, Hillman Foundation og Pennsylvania Department of Health (EG).
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i de senere årene har betydelig eksperimentelle bevis er generert til støtte for rollen som en liten bestand av selvfornyende celler som kunne opprettholde ondartet vekst [1], [2]. Denne befolkningen ble kalt kreft initiere celler eller kreftstamceller (cscs) for sin høye kapasitet for selvfornyelse, multilineage differensiering, og overlegne nivåer av malignitet. Cscs har blitt identifisert og isolert i forskjellige maligniteter, inkludert bryst, hjerne, prostata, bukspyttkjertel, lunge, og tykktarmskreft [3] – [11]
cscs ble identifisert anvendelse av flow-cytometri-baserte cellesortering og NOD. /SCID mus xenografting. Cscs uttrykke vev-spesifikk celleoverflatemarkører: f.eks bryst cscs uttrykke CD44 + /CD24
lav [3], og hjernen, prostata, lunge og bukspyttkjertelen cscs uttrykke CD133 + [2], [4], [7], [8 ], [10].
Flow-cytometri-baserte cellesortering som muliggjør isolering av en «side populasjon» (SP) med anriket kreft stamcelle-aktivitet ble beskrevet av Goodell et al [12]. SP-celler er karakterisert ved tydelig lav Hoechst 33342 fargestoff flekker, tilbakeføres til ekspresjon av ABCG2, en ATF-bindende kassett (ABC) transportør [13]. SP celler også demonstrere en større tumorigent kapasitet enn ikke-SP celler [13] – [15]. Flow-cytometri-baserte metoder for sortering cscs, ved hjelp av bestemte vev CSC markører, så vel som dannelsen av kuleformede klaser av selv-replikerende celler [16] – [18], tillater isolering av en cellepopulasjon anriket i begynnelsen av progenitor /stamceller .
på grunn av sin høye legemiddelresistens og tumorigenicity er cscs antatt å være ansvarlig for svulst regenerering etter kjemoterapi [19], [20], selv om direkte bekreftelse på dette er fortsatt forestående. Vi hypotese derfor at cscs kan bli beriket og senere isolert fra tumorcellepopulasjoner etter behandling.
I denne studien stoffet overlevende celler (DSCs) ble isolert fra humane kreftcellelinjer behandlet med cisplatin, doksorubicin eller etoposid . Isolerte DSCs utstilt høye klonogene kapasiteter, anrikning med SP celler, uttrykk for CSC celleoverflaten og embryonale stamcellemarkører, en evne til selvfornyelse, generering av differensiert avkom, og høy tumorigent potensial som følge SCID mus transplantasjon. Vi konkluderte med at disse DSCs var cscs.
Det har også blitt foreslått at cscs har høy metastatisk potensial [21]. Nylig ble forholdet mellom bukspyttkjertelen cscs og tumormetastase demonstrert [8]. Vi viste at stoffet isolert lunge cscs har høy metastatisk potensial.
Det fortsetter å være uklart hva egenskapene cscs konferere økt tumorigenicity og metastatisk potensial. Vi har antatt at disse tumorigen og metastatiske evner av cscs var basert på deres markert evne til å produsere vekst og angiogene faktorer, som stimulerer tumorcelleproliferasjon samt fremme dannelsen av tumor-karsystemet, for å tilveiebringe oksygen og næringsstoffer for lokal tumorvekst eller fjernt vekst etter spredning av kreftceller i ulike anatomiske steder. Dermed blir svært effektiv produksjon av vekst og angiogene faktorer er en fundamental egenskap av tumorceller initiering. VEGF er en potent angiogen faktor [22], mens vekstfaktorer så som bFGF, EGF, og HGF kan stimulere proliferasjon av ikke bare tumorceller, men også endotelceller og således manifeste proangiogenic og antiapoptotic effekter [23]. Noen data indikerer at kjemokiner, så som IL-8 (CXCL8), MCP-1 (CCL2), og RANTES (CCL5), ikke bare stimulerer migrering, men også proliferasjon av tumor og stromale celler, inkludert endotelceller [24]. Nylig ble det vist at IL-8 utstillinger sterk angiogen aktivitet via trans av VEGF reseptor 2 (VEGFR2) [25]. Således forskjellige typer av tumor fremstilling faktorer (cytokiner, kjemokiner, og angiogene vekstfaktorer) har overlappende funksjon for å fremme tumorvekst. Tallrike eksperimentelle og kliniske data viser at nøytralisering av vekst eller angiogene faktorer, eller blokkere deres reseptorsignalisering, kan hemme tumorvekst, noe som bekrefter viktigheten av disse faktorene i tumorcelle-proliferasjon [26]. Dermed ser produksjon av vekst og angiogene faktorer ved cscs avgjørende for deres tumorigene og metastatiske potensialer. Men dette CSC cytokin og vekst /angiogen faktor nettverk ikke tidligere hadde vært undersøkt.
Derfor, i den foreliggende undersøkelse har vi foretatt en omfattende analyse av forskjellige cytokiner, kjemokiner, og vekstfaktorer produsert ved paren H460-tumorceller og isolerte cscs bruker multiplex Xmap teknologi (Luminex Corp., Austin, TX), som tillater samtidig analyse av mange løselige faktorer. Denne analysen ble utført
in vitro
på dyrkede celler og
in vivo
utnytte den menneskelige svulst xenopodet modell i SCID-mus. Humane tumorer som vokser i SCID-mus bestå av humane tumorceller og murin stroma. Sonikerte ekstrakter av xenopodet humane tumorer inneholdt cytokiner produsert av humane tumorceller så vel som av murine stromale celler. Konsentrasjoner av hver type cytokiner kan analyseres ved hjelp av multiplex sett spesielt utviklet for påvisning av menneskelige eller murine cytokiner. Dette kan gi informasjon om cytokinnettverket produsert av cscs og deres evne til å stimulere stroma formasjon.
Våre studier viser at narkotika overlevende lunge kreftceller har karakteristikkene av cscs, og produsere forhøyede nivåer av flere cytokiner, kjemokiner, vekst og angiogene faktorer og deres reseptorer. Disse funnene bringe ny innsikt i vår forståelse av mekanismene som er ansvarlige for høy tumorigent og metastatisk potensial av lunge cscs og deres evne til å overleve kjemoterapi.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Menneskelige dyrkede cancercellelinjer, OVCAR-3 (ovarie), MCF-7 (bryst), og H460 (lunge), ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Cellene ble dyrket i kultur media, som anbefalt av ATCC, supplert med 20% FBS (Millipore Inc., Billerica, MA).
Reagenser
Cisplatin, doxorubicin, etoposid, og Hoechst 33342 var fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer mot humant CD24, CD34, CD44, CD24, CD117, CD90, VLA-4, og VLA-5 var fra Beckman Coulter (Fullerton, California). Antistoffer mot FGFR2, VEGFR1, VEGFR2, og CXCR1, to, fire var fra R . D Systems Inc. (Minneapolis, MN). Det antistoff mot VLA-6 ble oppnådd fra ABD Serotec (Raleigh, New York). Antistoffer mot CD 133 og cytokeratins 8/18 var fra Abcam Inc. (Abcam, Cambridge, MA). Alexa Fluor®-488 konjugert mus antihuman TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-1-4, og antistoff mot humant β-catenin ble kjøpt fra BD Biosciences Inc. (San Diego, California). Antistoffet mot fosfor-β-catenin var fra Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA). En embryonale stamceller (ES) markør prøvesett, som er utformet for deteksjon av SSEA-1, 3, 4, TRA-1-60, TRA-1-81, og Oct-4, ble oppnådd fra Chemicon International (Tamecula, Ca). Alexa Fluor®-488 phalloidin og videregående Abs konjugert med Alexa 488, 546, og 680 var fra Molecular Probes (Invitrogen, Carlsbad, California).
klonogene analyser
Celler ble belagt med en tetthet 10-50 celler /cm
2 i 100 mm
2 Petri-skåler eller ved en tetthet på 0,5 celler /brønn i 96-brønners plater, og dyrket i 14 dager. For kolonitelling ble cellene fiksert og farget med Coomassie brilliant blå.
Flowcytometri analyse
For side befolkningen (SP) analyse av celler vi brukte standard protokoll [12]. For å hindre ABCG2 transporter, ble 10 mm fumitremorgin C (Calbiochem /EMD Biosciences, Inc., San Diego, California) tilsettes 10 min før Hoechst tillegg. I noen eksperimenter, ble verapamil (50 umol /L) tilsatt fargestoff for å bekrefte SP (data ikke vist). Celler ble analysert ved hjelp av en MoFlo cytometer (Cytomation, Fort Collins, CO). Eksitasjon av Hoechst fargestoff ble utført ved anvendelse av en UV-laser ved 351-364 nm; fluorescensen ble målt med et 515 nm filter side populasjonen (Hoechst blå) og en 608 EFLP optisk filter (Hoechst rødt). Instrument gevinster ble justert for å sette hovedcellen kohort, som omfatter de fleste av cellene som inneholder ett kopi av DNA i midten av flatene. CD133 + celler ble sortert fra foreldre lungekreft H460 befolkningen bruker MoFlo cytometer og standard protokoll for immunfluorescens farging.
Cell farging prosedyre for Cellomics ArrayScan automatisert bildebehandling
Celler ble fluorescens-farget som beskrevet [27]. I korthet ble cellene dyrket i 96-brønners plater, vasket med FACS-buffer, inkubert med antistoffer mot CD24, CD34, VLA-4, VLA-5, VLA-6, CD44, CD87, CD90, CD117, FGFR2, VEGFR1 og VEGFR2 konjugert med FITC, PE, eller PC5, i 1 time, fiksert i 2% PFA i 20 min, vasket i PBS og farget med Hoechst 33342. for å teste CD133, CXCR1, CXCR2 og CXCR4 ekspresjon, ble celler inkubert med de respektive primære antistoffer og deretter med sekundære antistoffer konjugert med Alexa 488, 546, 680 eller fluorokromer (Molecular Probes /Invitrogen) i 1 time. Cellene ble deretter farget med Hoechst 33342.
For å oppdage intracellulære proteiner, ble cellene fiksert, permeabilazed, og inkubert med primære antistoffer mot embryonale stamceller markører, β-catenin, og cytokeratins 8/18 for en time og med sekundære antistoffer konjugert med Alexa 488, 546, 680 eller fluorokromer (Molecular Probes /Invitrogen) i 1 time. For aktin cytoskjelett-farging, ble celler inkubert med Alexa Fluor 488 Phalloidin i 1 time. Cellekjerner ble deretter farget med Hoechst 33342 på 2 mikrogram /ml i 20 min for å identifisere individuelle celler og for å optimalisere fokus
For å flekke kreftkuler, alle manipulasjoner ble gjort under den mikroskopiske kontroll. Svulst kuler ble forsiktig plassert inn i individuelle brønner i ultralavt heft 96 brønners plater, og inkubasjon med primære og sekundære antistoff var den samme som beskrevet ovenfor for de adherente kulturer.
Alle ruge og fikseringsfremgangsmåter ble utført ved romtemperatur.
Cellomics ArrayScan automatisert bildebehandling
Cellomics ArrayScan HCS Reader (Cellomics /ThermoFisher, Pittsburgh, PA) ble brukt til å samle inn informasjon om distribusjon av fluorescensmerkede komponenter i fargede celler. Den ArrayScan HCS system skanner flere felt i individuelle brønner, anskaffe og analysere hver av celle bildene i henhold til definerte algoritmer. Skanneren er utstyrt med utslipps og eksitasjon filtre (XF93, Omega Optiske, Brattleboro, VT, USA) for selektivt å avbilde fluorescerende signaler. Data ble fanget, pakket ut, og analysert med ArrayScan II datainnsamling og data Viewer versjon 3.0 (Cellomics), Quattro Pro versjon 10.0.0 (Corel, Ottawa, Ontario, Canada), og MS Excel 2002 (Microsoft, Redmond, Washington).
Kultur av lungekreft kuler
Suspension vekst ble vurdert i methyl cellulose-basert (MC-basert) medium som beskrevet [16], [17]. Kort fortalt ble H460-celler og narkotika valgte cellene resuspendert i 0,8% MC-basert serumfritt medium (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) supplert med 20 ng /ml EGF (BD Biosciences), bFGF, og 4 mikrogram /ml insulin (Sigma ) og belagt på 500-10000 celler /ml i ultra lave heft 24-96 brønners plater (Corning, Corning, New York). EGF, bFGF (20 ng /ml), og insulin (4 ug /ml) ble tilsatt hver annen dag i to uker. Mediet ble erstattet eller supplert med nye vekstfaktorer to ganger i uken. For å kunne vurdere den selv-fornyende potensial av cellene, ble kulene oppsamlet ved mild sentrifugering, dissosiert til en enkelt cellesuspensjon, filtrert og dyrket under betingelser som er beskrevet ovenfor.
Differensiering
Celler fra dissosierte kuler~~POS=HEADCOMP (tredje generasjon) ble sådd ut i 1 x 10
4 celler /ml i 96-brønn plater forhåndsbelagt med kollagen IV (BD Biosciences) i kulturmedium supplert med 10% FBS uten vekstfaktorer og overføres til nye plater når kulturene nådde samløpet. For å teste den selv-fornyende potensialet i differensierte celler, ble cellene overført til halvfast serumfritt medium supplert med EGF, FGF, og insulin og deres evne til å danne tumor sfærer ble evaluert som beskrevet ovenfor. For å utføre fenotypiske karakteriseringen av celler fra sfærer og celler etter differensiering, ble cellene sådd ut i 96-brønners plater (5 x 10
3 celler /brønn) og farget med forskjellige antistoffer som beskrevet ovenfor.
Chemotherapy motstands studier
H460 foreldreceller, celler oppnådd fra lungekreft kuler, og tre uker etter cscs differensierings celler ble sådd ut i 96-brønn plater forhåndsbelagt med kollagen IV (BD Biosciences) og dyrket i RPMI 1640 medium supplementert med 10% FBS. Etter 24 timer doxorubicin og cisplatin ble tilsatt ved sluttkonsentrasjonene (0,016 til 025 pg /ml og 0.165-3.30 ug /ml, henholdsvis). Etter 72 timers behandling, ble cellene farget med Hoechst 33342 og antall celler pr brønn ble telt med Cellomics Array Scan VTI (Cellomics /ThermoFisher, Pittsburgh, PA), som beskrevet [27].
Migration og invasjon assay
migrering og invasjon aktivitet av tumorceller i respons til humant rekombinant IL-8 (100 ng /ml) ble målt i BD BioCoat Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences, San Jose, CA) ifølge produsenten protokollen.
Analyse av tumorigen og metastatiske egenskaper DSCs og H460 tumorceller
Forsøk ble utført i samsvar med retningslinjer gitt av Pittsburgh Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) og National Institute of Health guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. SCID-mus, 7-8 uker gamle (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), ble opprettholdt i Dyreavdelingen ved Universitetet i Pittsburgh Cancer Institute (UPCI).
Å sammenligne tumorigene egenskaper, H460 celler og DSCs ble høstet og injisert (i 200 ul PBS) subkutant (SC) i SCID-mus ved konsentrasjoner på 5 x 10
3-5 x 10
5 celler per mus (5 mus pr gruppe) uten Matrigel. Tumorer ble målt to ganger i uken. Mus ble avlivet da deres tumorer målt tilnærmet 2 cm i diameter.
For å analysere evnen til H460-celler og cscs til å danne metastaser, 5 x 10
4-celler ble inokulert intravenøst (iv) i halevenen av SCID-mus. SCID mus var T, B, og NKT celle-mangelfull, men hadde aktive NK-celler som kan eliminere humane tumorceller som sirkulerer i blodet. Å utarme NK-celler, ble SCID-mus inokulert intraperitonealt (i.p.) med 0,2 ml av anti-asialo GM1 IgG (fortynnet 1:20) i 24 timer før i.v. inokulering av tumorceller [28]. Etter 60 dager ble musene avlivet; lunger, lever og nyrer ble fjernet og fiksert i Bouins løsning; og metastatiske knuter ble talt under et dissekere mikroskop.
Utarbeidelse av tumorekstrakter
Svulster vokst subkutant i SCID-mus ble fjernet og hurtigfrosset i flytende nitrogen. Frosne tumorvev ble kuttet, sonikert i 20 s, og sentrifugert ved 15.000 g i 10 min for å fjerne celleavfall. Tumor ekstrakter ble lagret ved -80 ° C.
Multipleks analyse av cytokiner
Analyse av humane cytokiner og vekstfaktorer i cellekulturmedium og i sonikerte tumorlysatene ble utført ved anvendelse av multiplexing Xmap teknologi (Luminex Corp., Austin, TX). Multiplex kits for påvisning av 49 humane cytokiner: IL-1a, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL -13, IL-15, IL-17, GM-CSF, IFN-α, TNFa, MCP-1, MCP-2, MCP-3, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, VEGF, bFGF G-CSF, eotaxin, HGF, MIG, GROα, sIL-2R, sVCAM-en, CTACK, LIF, M-CSF, NGF, PDGF-BB SCF, SCGF-β, SDF-1α, TNF-β, TRAIL IFN γ, ble EGF, TNFRI, TNFRII, DR5, IL-1Rα, og sIL-6R har kjøpt fra BIO-RAD Laboratories (Hercules, CA). Multiplex kit for deteksjon av SFAS, sFasL, TGFa, Fractalkine, sCD40L, felle, CS154, MIF, sVCAM-en, Sicam-en, MPO, Adiponectin, MMP-9, og tPAI-en ble kjøpt fra Linco /Millipore (St. Louise, MO). Den kit for deteksjon av MMP-2 og MMP-3 ble innkjøpt fra R 0,05
Resultater
Isolering av cscs basert på deres motstand mot cellegifter
Ovarian OVCAR -3, bryst MCF-7, og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) H460-celler ble behandlet med cisplatin (1-5 uM), etoposid (1-5 uM), eller doksorubicin (0,067 til 0,125 ug /ml) i 3 dager. Et stort flertall av cellene døde. I løpet av de neste 7 dagene noen overlevende celler lignet senescent celler med forstørret og flatet morfologi [30]. Disse «senescent» celler ble større i størrelse og døde i løpet av ukene 2-4. I løpet av den første uken etter behandling, små, runde, eller spindelformede celler med lavere etterlevelse ble oppdaget, og deres voksende kolonier gradvis erstattet de «senescent» celler i medikamentbehandlede kreftcellepopulasjoner (Figur 1a). Vi antok at narkotika overlevende små celler var cscs. For å bekrefte dette, ble de utvidede narkotika overlevende celler (DSCs) analysert for deres klonogene kapasitet, SP fenotype, CSC markører, selvfornyelse kapasitet, evne til å skille, og tumorigent og metastatisk potensial.
A , Morfologi av foreldre MCF7, OVCAR3 og H460-celler og medikamentoverlevde celler (DSCs)
MCF-7 og H460-celler ble behandlet med doksorubicin (0,125 ug /ml).; OVCAR-3-celler ble behandlet med cisplatin (3,3 ug /ml). Etter 48 h legemidler ble fjernet og narkotika overlevende celler (DSCs) ble dyrket i 3-4 uker.
B, Økt kolonidannelse ved DSCs isolert fra foreldre MCF7 (bryst), H460 (lunge) og OVCAR-3 (ovarie) cancercellelinjer.
Celler ble sådd 0,5 celle /per brønn i 96-brønners plater med kulturmedium supplert med 10% FBS og cellene ble dyrket i to uker. Prosentandelen av kolonidannelse ble beregnet. *** – P 0,001.
C, Analyse av side befolkningen (SP) i DSCs og foreldre MCF7-, OVCAR-3 og H460 cellelinjer
. Tumorceller ble farget med 5 ug /ml Hoechst33342 (HO). Noen celler ble forbehandlet med 10 pM fumitremorgin C (FTC) i 10 minutter før tilsetning Hoechst (HO + FTC). Celler ble resuspendert i RPMI med 20% FBS og 2 ug /ml propidiumjodid og sortert ved hjelp av MoFlo cytometer. Data for levedyktige celler ble analysert for para sammenhenger og kommentert ved hjelp av FCS Express.
Clonogenicity av DSCs
klonogene kapasitet på foreldre H460, OVCAR3, og MCF7- celler og DSC populasjoner ble testet som beskrevet i Materialer og Metoder. Mindre enn 40% av parentale celler var i stand til å danne kloner, mens klon dannende kapasitet på DSCs var mer enn dobbelt høyere (figur 1B).
Analyse av SP fenotype
Analyse av SP fraksjoner viste at testede foreldrecellelinjer var forskjellig i andelen av SP fraksjon, som strekker seg fra 0,6% i OVCAR3, 0,5% i MCF7, til 5,2% i H460-celler (figur 1C). SP cellefraksjoner var betydelig høyere i DSC populasjoner varierer fra 10,7% i MCF7-, 15,6% i OVCAR3 til 35,3% i H460. En distinkt lav Hoechst 33342 farging av SP-celler har blitt tilskrevet til uttrykk av ABCG2, en ATF-bindende kassett (ABC) transportør [13]. For å evaluere ABCG2 transportøraktivitet, fumitremorgin C (FTC), ble en ABCG2 spesifikk hemmer brukt. SP brøkdel av DSC celler sunket betraktelig i nærvær av FTC (figur 1C), noe som bekrefter oppregulering av ABCG2 transporter i DSCs.
Analyse av cscs og embryonale stamceller (ESC) markører
den Cellomics Array Scan HCS Reader (Cellomics /ThermoFisher) ble brukt for bildebehandling og analyse av uttrykk for cscs og embryonale stamcellemarkører i DSCs. Denne fremgangsmåten er basert på en kombinasjon av mikroskopi og flowcytometri metoder i et 96-brønners format. Fordelene med den metode omfatter: 10 ganger mindre celler er nødvendig enn for strømningscytometri-analyse, multispektral fluorescens mikro avbildning er automatisert, og bildene lagres, visualisert og analysert ved hjelp av kraftige programmer
analyse. avslørte at DSC populasjonen fra MCF-7-celler ble CD44 positive med lave nivåer av CD24 ekspresjon (data ikke vist), som tilsvarer den tidligere identifiserte fenotypen av bryst cscs [3]. De DSCs fra eggstokkene OVCAR-tre linje uttrykt CD44 + og ES markør oktober-4 (data ikke vist).
Til dags dato, er menneskelige lunge cscs dårlig beskrevet [10], [15]. Vi fokuserte derfor neste på karakterisering av CSC eiendommer i DSCs fra lunge H460 tumorcellelinje. Analyse av CD34, CD24 /CD44, CD87, og CD90 celleoverflatemarkører viste ingen differensial uttrykk mellom H460 foreldre og DSC populasjoner (data ikke vist), mens isolerte humane lunge DSCs ble beriket for CD133 + befolkningen (figur A, B). Vi neste analysert uttrykket av embryonale stamcelle (ESC) markører, podocalyxin antigener, TRA-1-60, TRA-1-81, glykolipidlagringsforstyrrelser antigener, scenen spesifikke antigener SSEA-3, 4 og transkripsjonsfaktorer oktober-4, i H460 foreldre celler og isolerte DSCs. Høyere uttrykk for TRA-1-81, SSEA-3, og oktober-4 ble funnet i isolerte DSCs i forhold til foreldre H460 celler (figur 2C, D), som støtter vår antagelse om at DSCs manifest markører assosiert med SC’er.
H460-celler og DSCs, økende i 96-brønners plater, ble fiksert og inkubert med primært Abs mot CD133, TRA-1-81, SSEA-3, Oct-4, eller cytokeratins8 /18 og deretter med sekundær Abs. Cellekjerner ble farget med Hoechst 33342. Cell bildene ble anskaffet ved hjelp av Cellomics ArrayScan HCS Reader (20X, 40X mål) og analysert ved hjelp av Target Activation BioApplication programvare modul.
A, Immunofluorescent bilder av kreftceller. B, fluorescens intensitet (pix) av CD133 plottet mot objektområdet.
Hvert punkt representerer en enkelt celle. Celler til høyre for den røde linje er CD133 + (ovenfor IgG kontroll farging).
C, Bilder av kreftceller immunofluorescently farget kreftceller for TRA-1-81, SSEA-3 og oktober-4
ES cellemarkører. D. fluorescensintensitet av TRA-1-81, SSEA-3 og Oct-4, plottet mot objektområdet. Hvert punkt representerer en enkelt celle. Celler til høyre for den røde linje er positive (ovenfor IgG kontroll farging). E,
Bilder av immunofluorescently fargede tumorceller for cytokeratins8 /18.
F,
fluorescens intensitet cytokeratins8 /18 i H460-celler (svarte prikker) og DSCs (grå prikker) plottet mot objektområdet
.
Lave nivåer av differensiering markør cytokeratins (CK) uttrykk i DSCs
lungekreft celler er kjent for å uttrykke type i CK18 og type II CK8 cytokeratins, kjente differensiering markører i disse cellene [31]. Vi sammenlignet uttrykk for CK8 /18 i H460 celler og DSCs. I forhold til foreldre H460 cellelinje, DSCs uttrykte meget lave nivåer av CK8 /CK18 (figur 3D, E), noe som indikerer en lav status differensiering av de isolerte DSCs.
Celler ble fiksert og inkubert med Alexa 488 Fluor® phalloidin eller med primær Abs mot β-catenin og med videregående Alexa Fluor 488 konjugert Abs. Neste celler ble farget med Hoechst33342. Celle bildene ble anskaffet ved hjelp av Cellomics ArrayScan HCS Reader (20X objektiv) og analysert ved hjelp av Kammer Analysis BioApplication Software Module og Target Activation BioApplication programvare modul.
A, Bilder av H460 celler og DSCs immunofluorescently farget for β-catenin (A).
B,
En gjennomsnittlig fluorescens intensitet av kjernefysisk β-catenin i H460 (svart linje) og DSCs (grå linje)
.C,
En gjennomsnittlig fluorescens intensitet av mobilnettet fos β-catenin i H460 (svart linje) og DSCs (grå linje). D, cytoskjelettet bilder av H460 celler og DSCs immunofluorescently farget for phalloidin og Hoechst33342.
β-catenin uttrykk
Wnt signalproteiner har vist seg å spille en rolle i å kontrollere stamcelleselvfornyelse. β-catenin er en sentral aktør i Wnt veien, overføre Wnt signaler til kjernen og spiller en avgjørende rolle i tumorigenesis [32] – [34]. Her analyserte vi den intracellulære fordeling av β-catenin i H460 celler og DSCs. DSCs viste betydelig høyere nivåer av total og kjernefysisk β-catenin enn foreldre H460 celler (figur 3A, B), mens fosforylert β-catenin var til stede på et lavt nivå i DSCs i forhold til foreldre H460 celler (Figur 3C). Det er kjent at i differensierte celler, hvor Wnt signalering er fraværende, er nivået av β-catenin regulert av en multiprotein «ødeleggelse kompleks» som binder og fosforylerer β-catenin, således rettet mot det for ubiquitinering og proteolytisk nedbrytning [32]. I stamceller hvor Wnt ligander presenteres, er denne «ødeleggelsen kompleks» hemmet, hindrer β-catenin fosforylering og nedbrytning, som fører til stabilisering og kjernefysisk translokasjon av β-catenin [32] – [34]. Således høye nivåer av kjerne opphopning av β-catenin, og lave nivåer av fosforylert β-catenin antyder den aktive Wnt signalisering i DSCs.
Analyse av cellemigrering og ekspresjon av VLA adhesjonsmolekyler
Vårt morfologisk analyse av DSCs og foreldre H460-celler viste forskjeller i cellen form og vedheft egenskaper, noe som tyder på mulige forskjeller i deres cytoskeletal organisasjon. For å teste denne hypotesen, brukte vi Alexa 488 phalloidin å visualisere F-aktin. Som vist i figur 3D, paren H460-celler har en rund form og jevn fordeling av F-aktin i cytoplasma, mens noen DSCs har lamellipodial forlengelse og aktin pigger i forkant av cellene. Disse resultatene antyder at DSCs har en større «vandrende fenotype» enn foreldre H460-celler. Vi undersøkte den vandrende kapasitet på H460 celler og DSCs å bruke en
in vitro
migrasjon og invasjon analysen bruker IL-8 som kjemotiltrekkende. Mens bare 13,7% av foreldre H460 celler invadert gjennom Matrigel, 87,5% av DSCs var invasiv.
adhesjonsmolekyler, inkludert inte, lette celleoverlevelse alarm og er involvert i motilitet, intercellulær adhesjon, chemotaxis, og metastase [35]. Vi sammenlignet ekspresjonen av integriner VLA-4, VLA-5, VLA-6 og i H460-celler og DSCs. Vi fant at DSCs hadde signifikant høyere nivåer av VLA-5 og lavere nivåer av VLA-6 sammenlignet med foreldreceller, mens VLA-4-nivåer var tilsvarende i begge subpopulasjoner (Figur 4D). Berøvelse av svulst celle adhesjon kan utløse apoptose. Denne formen for apoptose fremkalt som et resultat av tap av celle adhesjon til et substrat, ble betegnet anoikis. Den lave adhesjon av DSCs kan redusere deres avhengighet av enkelte overlevende signaler og føre til resistens mot anoikis. Anoikis-resistente celler viste høyere metastatisk evne [36].
