Abstract
Oncocytic celle svulster er preget av opphopning av morfologisk unormal mitokondriene i cellene, noe som tyder på en rolle for unormal mitokondrie biogenesis i oncocytic celle transformasjon. Lite er kjent om årsaken til dysmorphology av akkumulert mitokondriene. Proteinene som regulerer morfologi av mitokondriene, de «mitokondriene-forme» proteiner, kan modulere deres størrelse og antall; imidlertid ingenting kjent hittil om en mulig involvering av mitokondrie dynamikk i oncocytic celle transformasjon i svulster. Vårt mål var å vurdere status for mitokondrier morfologi og dens rolle i oncocytic celle transformasjon. Vi evaluerte derfor uttrykket mønster av hoved mitokondrie-fusjonsproteiner og fisjons i en serie av skjoldbruskcelletumorprøver, samt i skjoldbruskkjertelen tumorcellelinjer, med og uten oncocytic cellefunksjoner. Ekspresjonen av mitokondriell fusion (Opa1, Mfn1 og Mfn2) og fisjons (Drp1 og Fis1) proteiner ble evaluert ved immunhistokjemi (IHC) i en serie av 88 human thyroid tumorer.
In vitro
studier, for sammenligningsformål og for å utdype studiet, som ble utført med TPC1 – en papillær thyroideakarsinom avledet cellelinje-og XTC.UC1, en oncocytic follikulær skjoldbruskkjertelen carcinoma-avledet cellelinje. Både IHC og
in vitro
protein analyser viste en generell økning i nivåene av «mitokondrie-forme» proteiner i oncocytic skjoldbrusk svulster. Videre er overekspresjon av pro-fisjons protein Drp1 ble funnet å være assosiert med maligne tumorer oncocytic skjoldbruskkjertelen. Interessant, genetiske og farmakologiske blokkering av Drp1 aktiviteten var i stand til å påvirke skjoldbruskkjertelen kreftceller «migrasjon /invasjon evne, en funksjon av tumor malignitet. I denne studien viser vi at ubalanserte mitokondrielle dynamikk preger de ondartede funksjonene i skjoldbruskkjertelen oncocytic celle svulster, og delta i anskaffelsen av migrerende fenotype
Citation. Ferreira-da-Silva A, Valacca C, Rios E, Pópulo H, Soares P, Sobrinho-Simões M, et al. (2015) MITOKONDRIELLE Dynamics Protein Drp1 Er overexpressed i Oncocytic Thyroid Svulster og Regulerer Cancer Cell migrasjon. PLoS ONE 10 (3): e0122308. doi: 10,1371 /journal.pone.0122308
Academic Redaktør: Marc Liesa, Boston University School of Medicine, USA
mottatt: 01.10.2014; Godkjent: 19 februar 2015; Publisert: 30 mars 2015
Copyright: © 2015 Ferreira-da-Silva et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av prosjektet PIC /IC /83037/2007 (til VM), prosjektet MFAG-12120 fra AIRC og GR-2011- 02351643 fra det italienske helsedepartementet (til SC). Videre finansiering ble hentet fra prosjektet «mikromiljøet, metabolisme og kreft» basert på IPATIMUP og støttes delvis av Programa Operacional Regional do Norte (ON.2-O Novo Norte), under Quadro de referencia Estratégico Nacional (QREN), og gjennom Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER). IPATIMUP er en Associate Laboratory av den portugisiske departementet for vitenskap, teknologi og høyere utdanning og er delvis støttet av den portugisiske Foundation for Science and Technology (FCT). Studien var også FCT gjennom en PhD stipend til AFS (Ref .: SFRH /BD /39104/2007)
Konkurrerende interesser:. Den medforfatter Luca Scorrano er ikke lenger en PLoS ONE Editorial Styremedlem siden han har trukket seg før datoen for forfatternes underkastelse. Dermed ingenting endrer forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Kreftceller er kjent for å gjennomgå et skifte i sine basale metabolske veier, en prosess som ofte beskrives som «
Warburg effekt
«, hvorved selv under høye oksygentensjon de produserer mesteparten av sin ATP ved glykolyse [1]. Dette skiftet i metabolismen har blitt rapportert å være ledsaget av en endring i mitokondriell morfologi og størrelse, selv om de molekylære detaljene som følger de morfologiske endringer knyttet til Warburg effekten er blitt forklart, også siden vi vet lite om hvordan mitokondriell morfologi er regulert [2,3 ]. Siste årene har sett identifisering av de viktigste komponentene i mitokondrie dynamikk maskiner, en voksende gruppe av proteiner som blant annet cellefunksjoner, regulerer mitokondrie fusjon og fisjon. Mitokondrie dynamikk dysfunksjon har blitt gradvis avduket i en lang rekke sykdommer, spesielt nevrodegenerative sykdommer og kreft [4].
En spesiell gruppe av uvanlige svulster har blitt rapportert i praktisk talt alle organ, med en høyere frekvens i skjoldbruskkjertelen og nyre [5,6]. Slike svulster har celler med en tydelig svært eosinofil, kornete og hoven cytoplasma, med store kjerner og fremtredende nukleoli [7,8,9,10]. Elektronmikroskopi har vist at denne hovne utseende skyldes en unormal opphopning av mitokondrier som viser unormal morfologi [11,12,13]. Disse svulstene er beskrevet som oncocytic-, oxyphilic-, eosinofil, «Hürthle-celle (når det refereres til skjoldbruskkjertelen) svulster» eller som «oncocytomas». For enkelhets skyld, vil vi utpeke dem som «oncocytomas» eller «oncocytic celle svulster» [10]. I klinisk praksis, kriterier for diagnostisering av oncocytic celle varianter av papillær skjoldbruskkjertelen carcinoma (PTC) og follikulær skjoldbruskkjertelen karsinom (FTC) har kjernefysiske egenskaper, tegn på kapsel og /eller vaskulær invasjon som er delt med de ikke-oncocytic celle svulster av samme type, så vel som den mitokondrielle spredning typisk for oncocytic celle svulster [5,6,7]. Faktisk, denne ideen om at oncocytic forvandlingen skjer på toppen av «vanlige» svulster er støttet opp av tilsvarende genetiske forandringer av oncocytic karsinomer og deres ikke-oncocytic kolleger, som viser en tilsvarende forekomst av de ulike genetiske avvik, for eksempel RET /PTC rearrangements og BRAFV600E mutasjoner [6,14,15,16,17,18]. Selv om de første anbefalingene vurdert alle oncocytic skjoldbrusk svulster ondartet, senere studier har vist at så lenge sakene ble riktig stratifisert i henhold til deres klinisk-patologiske funksjoner, for eksempel pasientens alder, iscenesettelse av svulstene og kirurgisk procedure- prognosen for pasienter med oncocytic celle PTC og FTC varianter er lik som pasienter med respektive konvensjonelle, ikke-oncocytic karsinom [3,5,17,19].
de viktigste forskjellene mellom oncocytic og ikke-oncocytic svulster bor i hyppigheten av variasjoner som finnes i mitokondrie-DNA (mtDNA) og kjernefysiske DNA gener som koder mitokondrielle proteiner [2,5,20,21]. Av disse er en stor 5kb delesjon, ofte referert til som «felles delesjon» som eliminerer en rekke mtDNA gener og forstyrrer mtDNA replikasjon og transkripsjon, finnes ofte i oncocytic tyroid tumor og er assosiert med en økning i mitokondriell masse [20, 22,23,24].
dataene på posten antyder at mutasjoner i oksidativ fosforylering (OXPHOS) gener, nemlig i komplekse i gener, kan resultere i OXPHOS system funksjon og kan føre til opphopning av unormale mitokondriene [ ,,,0],20,25]. Ved hjelp av bioinformatiske verktøy, har vi nylig vist at høy patogenitet mtDNA mutasjoner, nemlig i genene for Complex jeg, føre til oncocytic fenotype [21].
Varianter av translokase Indre mitokondriemembranen 44 homolog (TIMM44) som er en del av mitokondrie protein import system er også blitt beskrevet i familiære former av oncocytic thyreoideatumorer; Dette tyder på at deregulering av mitokondrie import maskiner og følgelig av mitokondriefunksjon er forbundet med unormal mitokondrie biogenesis [26].
Et slående trekk ved de akkumulerte mitokondriene i oncocytic celle svulster er deres unormal ultrastructure og morfologi. Dette indikerer en deregulering også i de proteinene som styrer mitokondrielle dynamikk, de «mitokondriene-shaping» proteiner, en prosess avhengig mitokondrie fusjon og fisjon og uløselig knyttet til mitokondrie biogenesis, distribusjon, alarm og apoptose [27,28,29]. Interessant, ubalanse i mitokondriene fenotype mot fragmentering orchestrates trekkevne i celler hvor migrasjon representerer en viktig fysiologisk funksjon, for eksempel T-celle-lymfocytter og tumormetastatiske celler [30,31]. Faktisk, for å foreta bevegelse mulig, mitokondrier trenger å bli fragmentert å favorisere deres relocalization og rekruttering til spesifikke subcellulære regioner. I tilfelle av tumorceller, har en direkte sammenheng påvist mellom metastatisk grad og den Drp1 avhengige fragmentering av mitokondrier i brystkreft [31]. Mitokondrie fisjon krever cytosoliske dynamin relatert protein 1 (Drp1) og dets mitokondrie reseptorer fisjon 1 (Fis1), mitokondrie fisjon faktor (MFF) og mitokondrielle Division (midten) 49 og 51. Motsatt, den ytre membran mitofusin (MFN) 1 og 2 og den indre membran dynamin-lignende protein optisk atrofi 1 (Opa1), medierer fusjons mitokondrielle [32,33]. Til tross for de kjente mitokondrie morfologiske endringer observert i oncocytic celle svulster, kunnskap om nivåene og rollen disse mitokondriene-forme proteiner er sparsom. Vi har derfor satt ut for å undersøke om mitokondrie dynamikken endres i oncocytic skjoldbruskcellesvulster. Våre data tyder på at mitokondriefisjons proteiner Drp1 og Fis1 er overexpressed i oncocytic celle svulster, og at Drp1 uttrykk nivåer korrelerer med oncocytic celle tumor malignitet
ex vivo Hotell og med migrasjon muligheten for en oncocytic thyroid tumor cellelinje
in vitro
. Interessant, genetiske og farmakologiske blokkering av Drp1 reduserer overføringen av oncocytic tumor cellelinje, og tilbyr en roman terapeutisk tilnærming til å takle metastatiske oncocytic celle svulster.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført under den nasjonale etiske og regulerende lov for bruk av biologiske prøver. Materialet som brukes i denne studien kommer fra «Banco de Tecidos e Tumores» (Svulster og vev Bank) av Hospital de São João, Porto, som samler alle prøvene ved skriftlig informert samtykke fra pasientene eller deres foresatte i tilfelle av mindreårige. Å ha tilgang til disse prøvene, må forskerne sende et prosjekt til etikkomiteen av Hospital de São João for godkjenning. Vårt prosjekt har blitt godkjent.
Pasient utvalg
En serie av 88 skjoldbruskkjertelen svulster ble hentet fra filer av Avdeling for patologi Hospital S. João (HSJ), Porto. Thyroid prøver ble innhentet fra pasienter med alder fra 15 til 83 år. Den histologi av alle kreftprøver ble revidert uavhengig av to patologer (ER og MSS) og den endelige klassifiseringen ble gjort i henhold til WHOs kriterier [34]. Diagnosen av skjoldbrusk svulster var følgende: follikulær skjoldbruskkjertelen adenom (FA, n = 19; 12 oncocytic og 7 ikke-oncocytic), follikulær skjoldbruskkjertelen carcinoma (FTC, n = 7, en oncocytic og seks ikke-oncocytic), follikulær variant av papillær thyroideakarsinom (FVPTC, n = 30; 8 oncocytic og 22 ikke-oncocytic), konvensjonelle papillær thyroideakarsinom (cPTC, n = 32; 9 oncocytic og 23 ikke-oncocytic).
på grunn av den korte oppfølging av sakene som inngår i denne serien og påfølgende begrenset antall dødsfall, var total overlevelse ikke analysert. Denne studien ble utført under den nasjonale etiske og regulerende lov for bruk av biologiske prøver.
Tissue microarray (TMA)
Representative områder av ulike lesjoner ble nøye utvalgt på haematoxylin og eosin-farget seksjoner og ble markert på enkelte parafinblokker. To vev kjerner (3 mm i diameter hver) ble innhentet fra alle de utvalgte eksemplarer og ble nettopp satt inn like TMA mottaker parafinblokker med en vev-matrise instrument (Beecher Instruments, Silver Spring, MD) som beskrevet andre steder [35]. I hvert vev microarray blokk, ble deler av ikke-neoplastisk tyroideavev også inkludert som kontroller. Flere 3 mikrometer seksjoner ble kuttet fra TMA blokker og overført til ultrafrost lysbilder.
Immunhistokjemisk analyse
ble utført Immunhistokjemisk analyse (IHC) i 3 um formalinfiksert, parafininnstøpte seksjoner. Snittene ble deparaffinized og rehydrert i en serie med avtagende konsentrasjon av etanolløsninger. Deparaffinized enkle prøver, så vel som TMA deler var utsatt for varme-induserte antigen gjenfinning enten i 10 mM pH 6 citrat-buffer (natriumcitrat), eller i 1 mM pH 8 etylendiamintetraeddiksyre-buffer (EDTA) (LabVision Corporation, Fremont, CA, USA), i en mikrobølgeovn satt til 300watts i 10 minutter.
etter gjenfinningsløsninger hadde avkjølt, vev var gjenstand for 10 minutter til blokkering av endogen peroksidase aktivitet og av ikke-spesifikk binding med 3% av H
2o
2 og med det store volumet Ultra V Block reagens (Thermo Scientific /Lab Vision, Fremont, USA), avhengig av deteksjonssystemet som brukes.
seksjonene ble deretter inkubert i en fuktet kammer med følgende primære antistoffer og følgelig med produsentens spesifikasjoner: kanin polyklonale antistoff spesifikt for Fis1 (1: 100) ref. ALX-210-907 fra Alexis Biochemicals, nå Enzo biovitenskap (Farmingdale, New York, USA), monoklonalt antistoff spesifikt for Drp1 (1: 100) ref. 611112 og mus monoklonalt antistoff som er spesifikt for Opa1 (1: 100) ref. 612 607, begge fra BD Biosciences (Franklin Lakes, New Jersey, USA), kanin polyklonale spesifikt for Mfn1 (1: 250) ref. sc-50330 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA), muse-monoklonalt antistoff som er spesifikt for Mfn2 (1: 400) ref. 9927-M03 fra Abnova, (Jhongli City, Taiwan). Som en kontroll for mitokondriell innhold mus polyklonalt antistoff spesifikt for SDHA (1: 2000) ref. MS203, fra Mitosciences, nå Abcam (Cambridge, UK) ble brukt. Tidligere testet positive kontroller fra skjoldbruskkjertel, bryst og muskel ble inkludert for alle antistoffene i serien. Negative kontroller ble utført ved å erstatte den primære antistoffet med ikke-immune museserum.
immunhistokjemi teknikken ble utført ved hjelp av en merket streptavidin-biotin immunoperoxidase deteksjonssystem (Thermo Scientific /Lab Vision, Fremont, USA) eller Envision G /2 System /AP (K5355, Dako, Danmark) i henhold til produsentens instruksjoner.
for MFN1 og SDHA immunhistokjemisk farging ble utviklet med DAB (3,3′-diaminobenzidin) substrat. For de resterende antistoffer til farging ble utført med eller Envision G /2 System /AP (K5355, Dako, Danmark), og prøvene ble utviklet med en permanent rød kromogen.
Farging var blindt semi-kvantitativt evaluert av to observatører (VM og AFS) uten kjennskap til kliniske opplysninger av tilfellene; en IHC resultatet ble oppnådd ved summen av intensiteten av farging (0- fraværende; 1- svak, moderat 2-, 3- sterk) ved forlengelse av farget tumorceller (1-0 til 25%, 2 til 25 til 50% ; 3-50 til 75%, 4- 75%). Evaluering av prosentandelen av immunreaktive celler for alle antistoffer ble gjort ved å telle 300 tumorceller i tilfeldige områder. I alle avvikende tilfeller en enighet ble nådd. Som mitokondrie markør, og som et middel for å vurdere mengden av mitokondriene, SDHA ekspresjonsnivåer ble aksessert og brukt til å normalisere resultatene. I hver prøve, sammenlignet vi ekspresjonen av proteinene av interesse, både i normale og tumorvev, mot SDHA farging. Derfor, for hvert tilfelle, var vi i stand til å vurdere i en individuell og presis måte endringer i uttrykk av proteinet i studien uavhengig av mengden av mitokondriene, vist ved den SDHA uttrykk.
Cellelinjer
Thyroid kreft cellelinjer: TPC1 (vennlig levert av Dumont JE og Mareel M-National Cancer Center Research Institute, Tokyo, Japan), en PTC-avledet cellelinje, og XTC.UC1 (fra Wong MG og Savagner F- kirurgi service, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, California), en cellelinje hentet fra en oncocytic variant av follikulær karsinom, ble brukt i denne studien. Begge cellelinjer tidligere er blitt karakterisert på molekylært nivå og genotypisk [36,37]. TPC1 celler ble dyrket med RPMI-medium med Glutamax supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS), 1% (v /v) Pen Strep og 0,5% (v /v) Fungizone (alt fra GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, USA); XTC.UC1 ble opprettholdt med DMEM /F12 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, USA) supplementert med 10% (v /v) FBS, insulin ved 10 ug /ml, TSH ved 10mU /ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA ), 1% Pen Strep (v /v) og 0,5% (v /v) Fungizone. Begge cellelinjer ble autentisert ved hjelp av DNA-profil analyser, oppnådd med PowerPlex 16 system (Promega, Madison, USA), i henhold til de DNA-profiler som er tilgjengelige i American Type Culture Collection og helsefaglig forskning Resource Bank.
konstruksjoner og transfections
Cytoplasmatic GFP (ctGFP), mitochondrially målrettet DsRed (mtRFP), mitochondrially målrettet YFP (mtYFP) og pcDNA3.1-HA-K38A-DRP1 plasmider ble beskrevet tidligere og var en gave fra T. Pozzan (Venetian Institute of Molecular Medicine, Padua) [33]. Den tomme pcDNA3.1 ble oppnådd fra BD-Clontech og pcDNA3.1-HA-K38A-DRP1 plasmid generasjonen ble tidligere beskrevet [33]. XTC.UC1 cellelinjer ble transient transfektert ved elektroporering ved å bruke Neon Transfeksjon System (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). I co-transfections eksperimenter ble 1.5μg av skiltholder (ctGFP i Transwell eksperimenter) pluss 3μg av pcDNA 3.1 eller pcDNA3.1-HA-K38A-DRP1 brukt per 2.0×10
6 celler. Den spesifikke kombinasjon av plasmider transfekterte i hvert eksperiment, er angitt i figuren sagn. Etter 24 timer ble transfekterte celler sortert etter FACS og brukes til eksperimenter 24 timer senere.
Kvantitativ PCR
For cDNA forberedelse, 1NG av total RNA ble revers transkribert ved hjelp av RevertAid første tråd cDNA syntese kit ( Fermentas, Burlington, ON, Canada). Revers transkripsjon produkter ble forsterket for alle de nevnte gener ved qPCR bruker TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). For dataanalyse
Actin Hotell og
hCyclophilin
ble brukt som endogene kontroller (data vises bare for aktin). Data er uttrykt som relative uttrykk for hver enkelt gen normalisert til de tilsvarende kontroller.
ABI PRISM 7500 Fast Sequence Detection System (Applied Biosystems) ble benyttet for å detektere forsterkingsnivået og ble programmert til et første trinn med 2- min ved 50 ° C, 10 min ved 95 ° C, etterfulgt av 45 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min. 50 ng av cDNA for hver prøve ble anvendt, og alle amplifikasjoner ble utført i tre eksemplarer. Den relative kvantifisering av målgener ble bestemt ved hjelp av ΔΔCT metoden, som tidligere ble validert ved Livak s Lineær regresjon Method (slope¼0.0696) (Sekvens Detector User Bulletin 2, Applied Biosystems).
subcellular fraksjonering og immunoblotting
subcellulære fraksjonering ble utført som beskrevet i Frezza
et al
. [38]. Mitokondrielle og cytosoliske fraksjoner ble oppnådd og ble utslettet med et monoklonalt antistoff anti-TOM20 (1: 5000) ref. FL-145 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA) og en geitepolyklonalt antistoff anti-Actin (1: 2000) ref sc1616 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA). Celler ble lysert i RIPA-buffer, i nærvær av fosfatase og proteaseinhibitorer. Lignende mengder av totalt protein ble oppløst ved SDS-PAGE og overført på en nitrocellulosemembran (GE Healthcare, Little Chalfont, England). Vi har benyttet som primære antistoffer, de som allerede er nevnt i immunhistokjemi seksjon (alle ved en fortynning på 1: 1000). For protein deteksjon, ble en pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) og en luminescence system (Perkin-Elmer, Foster City, USA) benyttet. Membranene ble på nytt undersøkt med et mus monoklonalt antistoff anti-TOM20 (1: 5000) ref. FL-145 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA) for kontroll av protein lasting. Protein uttrykket ble kvantifisert ved hjelp av Bio-Rad Antall One 1-D Analyse programvare.
Elektronmikros
Celler ble utarbeidet med en konvensjonell elektronmikroskopi fiksering prosedyre og bildene ble tatt ved hjelp av en Technai 20 ( FEI, Eindhoven, Nederland). Forskjeller i mitokondrie størrelse mellom cellelinjer ble beregnet ved hjelp av hele mitokondrier areal. Et minimum på 15 mitokondrier ble målt per celle og minst 5 forskjellige celler pr prøvestykket ble tilfeldig anvendt for størrelsen måling. Alle forsøk ble gjort i tre eksemplarer.
Mitokondrie nettverk bildebehandling
For å kvantifisere strukturelle mitokondrie nettverk fragmentering ble cellene dyrket i glassbunn retter, transfektert med mitokondrie målrettet gul og rød fluorescerende protein, mtYFP og henholdsvis mtRFP, og etter 24 timer ble fiksert med iskald 3,7% formaldehyd i 30 minutter. Celler som uttrykker mtRFP ble fotografert med Zeiss 510 META confocal laser scanning mikroskop ved hjelp av en Plan-Apochromat 100 /1.46NA objektiv med en 2x digital zoom (eksitasjon ved 561 nm, emisjon registrert over 575nm. For hver cellelinje eller tilstand minst 25 tilfeldig valgte cellene ble fotografert og kvantifisert i henhold til sin mitokondrie nettverket. En 100x Plan-Apochromat (1.46NA) objektiv og 2x zoom ble brukt til bildeenkeltceller. Digitale bilder ble behandlet ved hjelp ImageJ 1,47 (amerikanske National Institutes of Health-NIH, Bethesda, MD, USA).
Ripe sår analysen
Celler ble dyrket til nær 90% samløpet i 6 brønners plater. Under aseptisk forhold en tynn «sår» ble introdusert ved å skrape med en 10 ul pipette tips og frittliggende celler ble skylt med PBS. ved hjelp av en fasekontrast satt opp og en 40x total forstørrelse bildene ble tatt hvert 5. minutt for totalt 15 timer. Fem forskjellige målinger per feltet ble gjort ved hjelp av bilder tatt på 0, 3, 6 , 9, 12 og 15 timer ved bruk av ImageJ programvare. Mer detaljert informasjon om denne metodikken har tidligere blitt publisert [39]. Bilder ble behandlet med ImageJ programvare.
migrering /invasjons assays
transient transfektert TPC-1 og XTC.UC1 celler ble resuspendert i serumfritt RPMI og med DMEM /F12, henholdsvis med 0,1 % FBS og sådd i det øvre kammer av et transwell 12-brønners plate (Corning Costar). Transwell Platene ble forbelagt med 5 ng /ml fibronektin (F2006-1MG, Sigma Aldrich) og inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 i 4 timer. Platene ble deretter skylt med PBS1x ved pH 7,4 før du legger de 100.000 celler per brønn. De nedre kamre ble fylt med det respektive medium supplert med 10% FBS. Etter 12 timers analyse, ble transwell membranene skåret ut, snudd og farget med DAPI på en glass-slide. Kjernene er synlige ved den foran-ned siden av membranen ble tellet. Et minimum av 5 ulike felt ble telt for hvert lysbilde og en tre eksemplarer ble laget for hver eksperimentell innstilling. Mdivi1 inhibitor ble brukt på 50 uM basert på tidligere publiserte data og i fravær av observerbare giftige eller belastningscelleforandringer [40]. Ingen forskjeller ble funnet mellom celler behandlet med Mdivi1 fra tid null eller forbehandlet 1 time før begynnelsen av analysen.
Statistisk analyse
Den statistiske analysen av IHC resultater ble utført med STAT VIEW -J 5.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). Forholdet mellom gjennomsnittlig uttrykk nivå (score) av immunhistokjemiske markører og histopatologi av de ulike sakene ble evaluert av ANOVA; Resultatene ble ansett som statistisk signifikant når p-verdien 0,05. Når det er hensiktsmessig, flere sammenligning korreksjoner ble utført ved hjelp av Bonferroni /Dunn test post hoc, og ved program indikasjon ble sammenligninger bare betraktet som signifikant når p-verdien 0,0018.
Hver
in vitro
analyse ble utført i det minste i tre eksemplarer, og den således oppnådde midlere ble brukt for uavhengig t-test. Alle dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE, som indikert i legender av tallene.
Resultater
Mfn2, Opa1, Drp1 og Fis1 er overexpressed i oncocytic celle svulster og Drp1 overekspresjon er assosiert med maligne oncocytic celle svulster
de såkalte «mitokondrier-forme» proteiner er viktige regulatorer av mitokondrier form og av deres dynamikk. Mitokondrie-nettverk, ja, er definert ved strengt regulerte balansen mellom fusjons og fisjonsprosessene, avhengig av cellens fysiologiske behov. Blant flere cellulære prosesser og patofysiologiske tilstander, mitokondrienes-forme proteiner også fungere på homeostase av organstørrelse og antall [4,28,29,32]. Når oncocytic celletumorer skiller seg fra de ikke-ococytic seg ved en unormal akkumulering av mitokondrier med en endret morfologi i cellecytoplasmaet, hypotese vi at mitokondrielle dynamikk kan ha en rolle i den fenotypiske og fysiologiske oncocytic definisjon [11,12,13] . Derfor har vi foretatt en histologisk analyse av de viktigste «mitokondriene skapende» protein nivåer på flere histologiske menneskelige skjoldbrusktumorprøver. Figur 1 viser representative farging mikrografer av «mitokondriene skapende» proteiner observert i ulike histologiske typer skjoldbrusk svulster, inkludert en oncocytic follikulær skjoldbruskkjertelen carcinoma (FTC), 6 ikke-oncocytic FTC, 8 oncocytic follikulær variant av papillær thyroideakarsinom (FVPTC) 22 ikke-oncocytic FVPTC, 9 oncocytic konvensjonell papillær thyroideakarsinom (cPTC), 23 ikke-oncocytic cPTC, 12 oncocytic follikulær skjoldbruskkjertelen adenom (FA) og 7 ikke-oncocytic FA. IHC mikrografer representant for en godartet oncocytic lesjon (OFA), en ondartet oncocytic lesjon (oPTC) og en ikke oncocytic lesjon (den noFVPTC), de histotypes hovedinteresse i dette arbeidet, er presentert i figur 1A, 1B og 1C. Siden uttrykket av «mitokondriene skapende» proteiner i normal tilstøtende parenchyma var null, eller bare påvises under poengsum to, vi utelatt i histogrammer uttrykket nivåer av slike proteiner i normalt vev. Med unntak av Mfn1, identifiserte vi en økning i uttrykket nivåer av de andre proteiner som er undersøkt, i oncocytic celletumorer
vs
. de ikke-oncocytic seg og i alle fire Histo-typer analysert (FVPTC, FTC, cPTC og FA) (figur 1 og 2A).
Representative mikrografer som viser farging av Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1 og Fis1 antistoffer i normal tyroideavev (NT) og tumorvevet av en oncocytic follikulær adenom-OFA) (A), en oncocytic papillær thyroid karsinom-oPTC (B) og en ikke-oncocytic follikulær variant av papillær thyroid karsinom-noFVPTV (C) ved en totalt forstørrelse på 300x. Illustrer svart pilspisser betegnes som stained målt tumor områder med økt gradering fra noFVPTV, til OFA og endelig OFTC. «# Mfn1-Mitofusin 1, Mfn2-Mitofusin 2, Opa1-Optic atrofi 1, Drp1-dynamin relatert protein 1, Fis1-mitokondrie fisjon 1 protein.
farging av Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1 og Fis1 ble evaluert, tar hensyn til alle skjoldbrusk svulster (A og B), den oncocytic skjoldbrusk svulster alene (C) eller ikke -oncocytic skjoldbrusk svulster alene (D). Den midlere antigen ekspresjon ble beregnet som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene er vist som midlere poengsum ± SEM. * P 0,05 (uparet t-test). # Mfn1-Mitofusin 1, Mfn2-Mitofusin 2, Opa1-Optic atrofi 1, Drp1-dynamin relatert protein 1, Fis1-mitokondrie fisjon ett protein.
Mfn2 og pro-fisjon Drp1 er betydelig overexpressed i maligne oncocytomas
i en dypere analyse av de histologiske prøver fra humane tumorer tyroid, Mfn1 var den eneste mitokondriene-shaping protein ikke vise noen signifikant forskjell i ekspresjonsnivåene, uavhengig av fenotype eller tumortyper, sammenlignet (fig 2A-2D). En generell økning av nivåene av andre proteiner ble analysert, uavhengig av deres pro-fusjon eller pro-fisjon rolle, var alle signifikant høyere i oncocytic svulster i forhold til i de ikke-oncocytic de (4,2 ± 0,2
vs
2,9 ± 0,2, p 0,0001 for Mfn2, 3,3 ± 0,3
vs
2,3 ± 0,2, p = 0,01 for Opa1;. 4.7 ± 0.2
vs
3,0 ± 0,2, p 0,0001 for Drp1; 4,9 ± 0,1
vs
3,5 ± 0,2, p. 0,0001 for Fis1), som vist i IHC kvantifisering av figur 2A (figur 2A). I motsetning til dette var det ingen merkbar forskjell på noen av disse proteiner, når vi sammenlignet ondartet
vs
. godartede svulster, uten å skille og gruppere prøvene i oncocytic eller ikke-oncocytic (3,5 ± 0,2
vs
3,0 ± 0,3, p = 0,31 for Mfn2;.. 2.8 ± 0.2
vs
2.3 ± 0,4, p = 0,28 for Opa1, 3,8 ± 0,2
vs
3,5 ± 0,4, p = 0,48 for Drp1,.. 4.1 ± 0.1
vs
3,9 ± 0,34, p = 0,71 for Fis1) (fig 2B). Derfor synes det som om endring av maskineriet er ansvarlig for mitokondrielle morfologi er strengt relatert til oncocytic fenotype, snarere enn til den totale tumor aggressivitet. Videre innenfor de ikke-oncocytic svulster ingen forskjeller i uttrykket nivåer av mitokondrie dynamikk proteinene ble funnet mellom godartede og ondartede svulster (Fig 2D). Men hvis vi vurdere alvorlighetsgraden av svulsten, bare innenfor oncocytic fenotype, interessant vi observere at Mfn2 og Drp1 er betydelig mer rikelig i karsinom i forhold til de godartede kolleger «adenomer (4,5 ± 0,2
vs
. 3,4 ± 0,4, p = 0,012 for Mfn2 og 5,1 ± 0,2
vs
. 4,0 ± 0,5, p = 0,038 for Drp1 (fig 2C). av notatet, disse forskjellene er ikke relatert til forskjeller i mitokondrie-nummer ( S1 figur). Dette tyder på at innen oncocytic celle svulster, mitokondrie dynamikk innta en rolle i definisjonen av tumor malignitet og aggressivitet.
Drp1 akkumulerer aktivt i mitokondriene og ubalanse mitokondrie nettverk mot fisjon
for å klargjøre og undersøke i dybden rollen mitokondrie dynamikk endring på oncocytic celle svulster, vi byttet til
in vitro
eksperimenter på to skjoldbrusk kreft cellelinjer: XTC.UC1, som er den eneste oncocytic cellelinje tilgjengelig, med karsinom derivasjon, og TPC1, et ikke-oncocytic skjoldbruskcellelinje anvendt for sammenligningsformål. Først må vi evaluert i de to cellelinjene uttrykket nivået av de samme fusion /fisjons proteiner studert i humane tumorprøver.
Etter western blot analyse, vi har oppdaget, i oncocytic cellelinje, den samme trenden med * P
