Abstract
Utviklingen av genetisk merkede dyr tumorxenotransplantater er et område av pågående forskning for å muliggjøre enklere og mer pålitelig testing av kreftbehandlingen. Genetisk merkede tumormodeller har en rekke fordeler i forhold til konvensjonelle tumormodeller, herunder enkel langsgående overvåking av behandling og den reduserte antall dyr er nødvendig for forsøkene. Flere forskjellige fremgangsmåter er blitt anvendt i tidligere studier for å markere tumorer genetisk, men alle har begrensninger, slik som genotoksistet og andre gjenstander i forbindelse med bruken av integrering av virale vektorer. Nylig har vi generert en episomally opprettholdt plasmid DNA (pDNA) uttrykk system basert på Stillas /Matrix Attachment Region (S /MAR), som tillater langsiktig luciferase transgene uttrykk i mus leveren. Her beskriver vi et ytterligere bruk av denne pDNA vektor med den humane Ubiquitin C promoter for å skape stabilt transfekterte humane hepatom (Huh7) og human bukspyttkjertel karsinom (MIA-PaCa2) cellelinjer, som ble levert inn i «immunmangelfull» mus og overvåket i lengderetningen over tid ved hjelp av en bioluminometer. Begge cellelinjer avdekket vedvarende episomal langvarig luciferase ekspresjon og dannelse av en tumor som viser de patologiske egenskapene av hepatocellulært karsinom (HCC) og pankreatisk karsinom (PACA), respektivt. Dette er den første demonstrasjon på at en pDNA vektor kan gi vedvarende episomal luciferase transgen ekspresjon i forskjellige musetumormodeller og kan således lett benyttes til å følge tumordannelse uten å forstyrre den cellulære genomet
relasjon:. Argyros O, Wong SP, Gowers K, Harbottle RP (2012) genmodifisering av kreftceller ved hjelp av ikke-Viral, episomale S /MAR Vektorer for
In Vivo
Tumor Modellering. PLoS ONE 7 (10): e47920. doi: 10,1371 /journal.pone.0047920
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 17 juni 2011; Godkjent: 20 september 2012; Publisert: 26 oktober 2012
Copyright: © 2012 Argyros et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert av Myrovlytis Trust. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft representerer en av de største helserisikoene på verdensbasis. Det er derfor et økende behov for å utvikle nye behandlingsformer og nye fremskritt i dyr tumor modellering. Men til tross for mye fremgang på dette feltet, utvikling av klinisk relevante dyremodeller som tillater rask og sensitiv overvåking av tidlig tumorvekst og påfølgende metastase fortsatt en pågående utfordring [1].
Mange konvensjonelle dyr tumormodeller brukes i utviklingen av kreft behandlinger innebærer injeksjon av humane tumorceller inn i immunkompromitterte mus [2], [3], etterfulgt av standard kaliper-målinger for å vurdere tumorstørrelse, vanligvis som et sluttpunkt måling, etter at dyret er avlivet. Disse modellene er ganske begrenset og forskning har pågått for å utvikle en genetisk merket svulst som vil gi ikke-invasiv monitorering av tumor parametere av
in vivo
avbildning basert på lys utslipp fra luciferase-uttrykke celler eller fluorescens fra GFP-uttrykkende celler [1]. Anvendelse av genetisk merkede tumorceller i en dyremodell kreft har en rekke fordeler. Først og fremst lar en å overvåke effekten av terapeutiske intervensjoner som for eksempel narkotika, gen eller cellen terapi lettere enn med konvensjonelle modeller. Den letter sporing av tumor parametere, slik som størrelse og utvikling, så vel som muliggjør svært sensitive visualisering av tidlig metastasering og evalueringen av minimal restsykdom etter behandling [4]. Det tillater også bruk av sekvensielle målinger for å følge tumorstørrelse under behandlingen, slik at langsgående studier kan utføres for å analysere effektene av behandling over tid gi mer pålitelig informasjon og redusere antall forsøksdyr [5].
i tidligere studier har en rekke forskjellige metoder blitt ansatt for å gi gave til kreftceller med påvisbare markører [1], [4], [6], [7], [8], [9]. Den mest effektive metode for levering av gener til celler er bruken av vektorer avledet fra modifiserte virus [10]. Imidlertid, til tross for fordelene ved dette genet avleveringssystemet er det også betydelige begrensninger, først og fremst knyttet til integrering av vektoren inn i cellegenomet, potensialet immunogenisitet av virale kodende genene, så vel som tap av langsiktig ekspresjon av reportergenet. Det ville være av stor interesse, og derfor å utvikle en ikke-virale gen avgivelsessystem som kan mediere forlenget reportergenekspresjon i en dyretumormodell. En effektiv måte å oppnå dette mål er å anvende et plasmid DNA (pDNA) ekspresjonssystem som kan bli opprettholdt som et funksjonelt, episomal enhet når den har blitt levert til celler av tumormodell og gi dem gode påvisbare nivåer av markør genekspresjon i hele sin levetid [11].
Forrige
in vivo
studier med pDNA vektorer har vist at viruspromotere, slik som cytomegalovirus (CMV) promoter er i stand til å gi de høyeste nivåene av transgene uttrykk innledning [12], [13], men etterfølges med en påfølgende nedgang i ekspresjon i løpet av to måneder [14]. Denne nedgang i ekspresjon er promoter-avhengig og vil trolig være et resultat av transkripsjonen stanse av promotoren [15]. Faktisk har CpG metylering av CMV-promoteren i forskjellige plasmidvektorer er funnet å ha en negativ effekt på transgene uttrykk både
in vitro
og
in vivo product: [11], [16], [ ,,,0],17].
Nylig har vi og andre har vist at en pDNA vektor som omfatter en kombinasjon av et pattedyr, vevsspesifikk promotor med et atomstillas /matrise feste region (S /MAR) element kan fremme langvarig episomal uttrykk
in vitro Hotell og
in vivo product: [11], [18], [19], [20], [21]. S /MAR-elementet gir en spesifikk assosiasjon av vektoren med atommassen via stillas feste faktor-A (SAF-A) under forankring av vektoren i kromosomet stillaset under mitose og bringe plasmidet i nær kontakt med cellens replikasjonsmaskiner, derfor skape mitotisk stabilitet og opprettholde plasmidet som et epigenetisk enhet gjennom hundrevis av celledel [22], [23], [24], [25], [26]. S /MAR element har vist seg å ha en beskyttende effekt på metylering-sensitive områder i α1-antitrypsin (AAT) lever-spesifikk promoter [11], men har ingen slik virkning på CMV-promoteren, fremhever at et pattedyr i stedet for en viral promoter er mer egnet for langvarig transgen ekspresjon med denne vektoren.
en S /MAR-inneholdende plasmid er blitt utviklet for anvendelse til leveren ved anvendelse av en leverspesifikk promotor, AAT, og har vist seg å vedvare og uttrykke den luciferase-transgenet episomally over 6 måneder i hepatocytter [11]. Gitt den langsiktige ekspresjon av disse episomally opprettholdt plasmider, ville en S /MAR basert vektor i kombinasjon med en pattedyr promoter synes å være ideell for bruk som en genetisk markør for tumorceller.
Plasmider inneholdende en S /MAR-sekvens og en CMV-promoter er tidligere blitt transfektert inn i CHO [18], [23], [25], HaCaT [23], HeLa [27], K562-leukemiceller, U251 glioma [20] og primær fibroblast [28] og har vist seg å replikere og bli opprettholdt som i ekstra-kromosomalt episomer.
arbeidet som er beskrevet her viser, for første gang, ved bruk av en episomally opprettholdes, pUbC-S /MAR plasmid, mediere vedvarende luciferase transgene uttrykk for å generere genetisk merkede tumorcellelinjer som gir opphav til ulike kreftformer når den brukes
in vivo
. Cellelinjene som benyttes er en human leverkreft cellelinje Huh7, som er avledet fra en pasient med leverkreft og en human pankreatisk carcinoma cellelinje, MIA-PaCa2.
Resultater
Generation av stabilt transfekterte Tumorcellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP som bruker pUbC-S /MAR Plasmid
Basert på tidligere
in vitro
studier med S /MAR vektorer, rettet vi å bruke denne erfaringen til å etablere en rekke forskjellige stabilt transfekterte tumorcellelinjer for generering av forskjellige tumormodeller, som kan overvåkes ved
in vivo
bioluminescens avbildningsteknikker. Et plasmid inneholdende en S /MAR element i kombinasjon med pattedyr UBC-promoteren (pUbC-S /MAR), kjøre en luciferase transgen ble anvendt i denne studien (figur 1A). Den allestedsnærværende UBC-promoteren ble påført, slik at den samme vektoren kan brukes til å styre luciferase transgenet i forskjellige cellelinjer.
A) pUbC-S /MAR plasmid brukt i denne studien, hvori luciferase-ekspresjon drives av det menneskelige UBC-promoteren. B) Huh7, og MIA-PaCa2 celler ble transfektert med pUbC-S /MAR og dyrket under valget med G418 for ca to uker. Tre enkle kolonier ble isolert og utvidet ut av valget med vanlig bildediagnostikk ved hjelp av en Xenogen bioimager. C) Southern blot av total DNA isolert fra tre individuelle kolonier for hver cellelinje ved 45 dager etter transfeksjon. Lanes 1-3: Huh7 isolerte kolonier; Lanes 4-6 MIA-PaCa2 isolerte kolonier; (+): Positiv kontroll, 10 ng bakterielt pUbC-S /MAR-plasmidet. D) luciferase bioluminesens analyse (i to eksemplarer) på økende mengder av Huh7 og MIA-PaCa2 celler, som viser grensene for signal (luciferase) deteksjon,
in vitro
. E-F) Plasmid redningsforsøk av tre
E. Coli
kolonier for Huh7 (baner 1-3) og fire kolonier for MIA-PaCa2 cellelinjer (baner 4-7), viser identisk restriksjonsmønster med ren pUbC -S /MAR plasmid (+), følgende begrensning fordøye med
Spe
I enzym. (-) Negativ kontroll (uten DNA); M: 1 kbp stige (Hyperladder jeg, Bioline)
MIA-PaCa2 og Huh7 celler ble transfektert med pUbC-S /MAR vektor og dyrket i to uker i nærvær av G418 (. 1 mg /ml). Etter denne tid celler dannet distinkte kolonier og luciferaseekspresjon ble bekreftet ved hjelp av en selvlysende imager (figur 1B, topp panel). Tre individuelle transgenet som uttrykker kolonier for hver av de cellelinjer (Huh7 og MIA-PaCa2) ble isolert og deretter dyrket uten antibiotisk seleksjon (figur 1B, midtre panel). Ekspresjon av luciferase-transgenet ble demonstrert i begge cellelinjene som indikerer vellykket stabil transfeksjon med den pUbC-S /MAR-plasmidet. Cellene ble videre dyrket i fravær av seleksjonstrykk for en annen måned (figur 1B nedre panel). 45 dager etter transfeksjon genomisk DNA ble ekstrahert fra alle de tre kolonier av hver cellelinje for å bekrefte episomalt vedlikehold av pDNA. Et Southern blot ble utført (figur 1C), som i hvert tilfelle viste et enkelt bånd av den eksakte størrelsen på pUbC-S /MAR (8198 bps) for hver av de kolonier av begge cellelinjer. Til slutt utførte vi luciferase Bioluminescens analyser på økende mengder av celler, for å gi direkte kvantitative resultater av genekspresjon for sammenligning. Resultatene er vist i figur 1D, hvor grensen for signaldeteksjon var mellom 500-5000 celler for Huh7-celler og mellom 250-2500 celler for MIA-PaCa2.
Ytterligere bevis for episomalt vedlikehold ble gitt ved plasmid redning av pUbC-S /MAR fra kanamycinresistente
E. coli-bakterier
etter transformasjon med total-DNA fra hver av koloniene på de to cellelinjene. I dette tilfelle bare intakt fritt plasmid DNA ville produsere bakterielle kolonier på plater inneholdende kanamycin som er resistent markør tilstede på pUbC-S /MAR-plasmidet. Restriksjons mønstre av pDNA av utvalgte kolonier var i samsvar med umodifiserte ikke-integrerte plasmidkonstruksjoner for både Huh7 og MIA-PaCa2 cellelinjer (figur 1E og 1F).
stabilt transfekterte Huh7 og MIA-PaCa2 Cell Lines danne svulster
in vivo
samtidig opprettholde høye nivåer av transgene uttrykk 35 dager etter injeksjon
Celler fra hver av de to som genereres stabilt transfekterte cellelinjer (MIA-PaCa2 og Huh7) ble separat administreres av intraperitoneal injeksjon til grupper av mus (n = 4). Mus ble fotografert 24 timer etter injeksjonen og luciferase-ekspresjon ble observert i begge grupper av mus injisert (figur 2A). Vi la merke til at alle fire mus injisert med MIA-PaCa2 celler uttrykte luciferase i løpet av overvåkningsperioden og dannet tumorer, mens tre av fire mus injisert med Huh7-celler uttrykte luciferase og en mus ikke hadde noen innledende luciferase uttrykk, sannsynligvis på grunn av manglende evne av celler til å etablere seg i det nye miljøet, men dette er fortsatt uklar. Ikke desto mindre, ble luciferase-ekspresjon overvåket i begge grupper av mus i en total periode på 35 dager med ukentlig Bioimaging. Bioluminescerende avbildnings bilder av en representativ mus over tid for hver cellelinje er vist i Figur 2A. Nivået av uttrykket økt kraftig 21 dager etter celle levering (Figur 2C). Ingen luciferase-ekspresjon ble påvist i kontroll-ubehandlede dyr (data ikke vist), hvor bakgrunnsnivået av lysemisjon var 5 x 10
5 fotoner /sekund /cm
2 /sr.
A) en gruppe på fire mus for hver cellelinje ble injisert intraperitonealt med 3 x 10
6 Huh7 eller MIA-PaCa2 celler som er stabilt transfektert med pUbC-S /MAR og visualiseres over tid (fra dag en etter injeksjon) for bioluminescens ved hjelp av en Xenogen bioimager, etter intraperitoneale injeksjoner av 15 mg /ml D-luciferin, med ett minutt fangsten. En representant mus for hver cellelinje er vist på dager 7, 21 og 35. B) 35 dager etter injeksjon av Huh7 og MIA-PaCa2 injisert mus ble drept og dissekert for å se etter tegn på tumorvekst. Ingen vekst var åpenbar fra ytre undersøkelse av dyret, men på åpne det opp en masse ble observert i det peritoneale hulrom (Huh7 behandlede mus er vist som et eksempel). Dyret ble fotografert for bioluminescens før og etter fjerning av svulster. Intensiteten av luciferase uttrykk vises på musen: rød representerer høy uttrykk, fiolett representerer lav uttrykk. Fargen bar illustrerer relativ signalintensitet. (C) Grafisk illustrasjon av den langsiktige luciferase-ekspresjon fra NOD-SCID-mus injisert med enten Huh7 eller MIA-PaCa2 stabile cellelinjer (n = 3 for Huh7 og n = 4 til MIA-PaCa2). Luciferase kvantifisering uttrykkes, som fotoner /sek /cm
2 /sr og plottet (+/- SD). Bakgrunnsnivået av lys utslipp på ikke-behandlede dyr er 5 × 10
5 fotoner /sek /cm
2 /sr.
Gitt økningen i luciferase transgene uttrykk 35 dager etter -administration av cellene, var vi sikre at en tumor avledet fra de injiserte celler som hadde dannet seg. Musene ble derfor avlivet 35 dager, og dissekert for å se etter tegn på tumordannelse. Mens eksternt var det ingen merkbar vekst, ble en stor masse observert i det peritoneale hulrom når dyret ble dissekert. Et representativt bilde av tumormassen fra et dyr som ble behandlet med Huh7-celler er vist i figur 2B. Avbildning av musene før og etter fjerning av tumoren bekreftet at luciferase transgen ekspresjon ble lokalisert til tumormasse (figur 2B).
Histologisk analyse av de dannede Tumorer
hematoksylin og eosin farget vevssnitt ble utført for å identifisere tumorhistologi avledet fra hver cellelinje. Figur 3 viser histologiske deler av svulster dannes fra Huh7 celler. Histologi bekrefter at tumoren er en hepatocellulært karsinom (HCC) med varierende grad av differensiering (3A-D). Svulsten består av polygonale celler fordelt i løse ark og pseudoglandular mønstre. Kjernen var moderat pleomorphic, vesikulært og inneholder en kjerne. Noen få isolerte mitotiske figurer ble også notert. Cytoplasma var eosinofil og cellegrensene var godt definert, mens stroma var sparsom. Intracellulære og ekstracellulære galledråper ble ikke sett i svulsten og heller ikke var tumor nekrose. Funksjonene i svulsten ble bekreftet av en uavhengig histopathologist å være i samsvar med en verne HCC (modifisert Edmonson og Steiners karaktersystem).
Seksjoner fra ulike deler av de to svulster ble kuttet og farget med hematoksylin og eosin for histologisk analyse av tumorene. A-D) Deler fra Huh7 injisert mus. Delene har en amorf struktur, og ble identifisert som hepatocellulært karsinom (HCC) av varierende grad av differensiering: (A) Moderat differensiert HCC, forstørrelse x 10 (B-C) Snittene ble analysert ved hjelp av immunhistokjemi for å vise fordelingen av luciferase-ekspresjon. Brune flekker indikerer luciferasepreparater positive celler. (B) Positively farget, Forstørrelse x 40 (C) Positively farget, Forstørrelse x 10 (D) Negativ kontroll: ingen primær antistoff tilsatt, forstørrelse × 10 E-H) Deler fra MIA-PaCa2 injisert mus. Delene har en amorf struktur, og ble identifisert som bukspyttkjertelkreft (PACA) av varierende grad av differensiering. (E) Moderat differensiert Paca, forstørrelse × 10 (F-G) §§ ble analysert ved immunhistokjemi for å vise fordelingen av luciferase uttrykk. Brune flekker indikerer luciferasepreparater positive celler. (F) Positively farget, Forstørrelse × 40 (G) Positively farget, Forstørrelse x 10 (H) Negativ kontroll. Ingen primær antistoff tilsatt, forstørrelse × 10
I tillegg luciferase immunhistokjemisk analyse av tumorsnitt (figur 3B og 3C) viste alle hepatocytter-liknende celler avledet fra de injiserte celler til å uttrykke luciferase. Ufargede områder antas å være enten nekrotisk vev eller celler som rekrutteres til tumoren, som ennå ikke er bekreftet eksperimentelt og er for tiden under undersøkelse.
Tilsvarende, haemotoxylin og eosin farget vevssnitt ble oppnådd for de tumorer dannet i mus etter injeksjon av MIA-PaCa2 celler (figur 3E-H). I dette tilfellet er de histologiske snitt viste at de dannede tumorcellene hadde gjennomtrengt mellom normal pankreatisk acini ved periferien av tumoren. Tumorcellene ble beskrevet å bli distribuert i faste ark uten tegn på kjertel-differensiering og har en moderat mengde av cytoplasma med veldefinerte cellerammer. Kjernene var atypisk og hyperchromatic mens nucleoli var iøynefallende. Mitotiske tallene var sjeldne. Majoriteten av tumorceller inneholdt en blek intracytoplasmatisk vesikkel skyve kjernen til periferien bibringe et signet ring utseende. Ekstracellulære slim og stromal fibrose ble ikke sett. En uavhengig histopathologist bekreftet alle funksjonene i svulsten var i samsvar med en signetring karsinom i bukspyttkjertelen.
De pUbC-S /MAR Plasmid er Episomally vedlikeholdt og Uttrykt i den resulterende Tumor Vev
Å gi fysisk bevis på den molekylære natur av pUbC-S /MAR plasmid i HCC og pankreatiske tumorer, utførte vi Southern blot-analyse av totalt DNA isolert fra to forskjellige områder av den samme tumor 35 dager etter levering av enten Huh7 eller MIA-PaCa2 cellelinje.
en representativ blot er vist i figur 4A, hvor et individ bånd av den forventede størrelse blir detektert i alle baner. Dette indikerer at pUbC-S /MAR pDNA forbli episomal 35 dager etter levering. Ytterligere bevis for episomal vedlikehold ble også levert av plasmid redning av pUbC-S /MAR plasmid isolert fra kanamycin-resistente
E. coli
etter transformasjon med total DNA fra svulsten avledet fra Huh7 eller MIA-PaCa2 behandlede mus. I dette tilfelle ville bare intakt fri pDNA fra den isolerte tumorprøve fremstille bakterielle kolonier på plater inneholdende kanamycin, motstanden markør tilstede på plasmidet. Restriksjons mønstre av pUbC-S /MAR plasmid var i samsvar med umodifiserte ikke-integrerte plasmidkonstruksjoner (vist i figur 4E).
(A) Southern blot-analyse av pDNA isolert fra to forskjellige regioner i tumorvev fra NOD /SCID-mus, 35days etter levering av Huh7 og MIA-PaCa2 stabile cellelinjer, utført som beskrevet i materialer og metoder. En representativ hybridisering mønster av pDNA isolert fra ett dyr av hver tumor er vist. Påvisning av indikator plasmid av M: 1 kbp stige (Hyperladder jeg, Bioline); lane 1: pUbC-S /MAR isolert fra svulstvev dannet etter Huh7 injeksjon av NOD /SCID mus i 35 dager etter injeksjon; lane 2: pUbC-S /MAR isolert fra en annen region av svulstvevet dannet etter Huh7 levering i NOD /SCID mus i 35 dager etter injeksjon; kjørefelt 3 pUbC-S /MAR isolert fra svulstvev dannet etter MIA-PaCa2 injeksjon av NOD /SCID mus i 35 dager etter injeksjon; lane 4: pUbC-S /MAR isolert fra en annen region av svulstvevet dannet etter MIA-PaCa2 levering i NOD /SCID mus i 35 dager etter injeksjon; (+) Positiv kontroll: 25 ng linearisert pUbC-S /MAR plasmid. (B) Replication avhengig analyse av pUbC-S /MAR plasmid DNA isolert fra svulster hos mus 35 dager etter administrasjon. baner 1-3: Southern blot av total svulst DNA isolert fra NOD /SCID mus i 35 dager etter levering med Huh7 stabil cellelinje og dobbeltkuttet med
Spe
I-
Mbo
jeg ( lane 1),
Spe
I-
DPN
jeg (spor 2) eller
Spe
I-
BFU
KI (kolonne 3) enzymer; baner 7-9: Southern av total svulst DNA isolert fra NOD /SCID mus i 35 dager etter levering med MIA-PaCa2 stabil cellelinje og dobbeltkuttet med
Spe
I-
Mbo
jeg (spor 4),
Spe
I-
DPN
jeg (spor 5) eller
Spe
I-
BFU
KI (kolonne 6) enzymer; M: 1 kbp stige (Hyperladder jeg, Bioline UK Ltd., London, UK). (C) Kvantitativ PCR utført på tumor DNA oppnådd på dag 35 etter injeksjon av Huh7 og MIA-PaCa2 cellelinjer. DNA ble ekstrahert fra to forskjellige steder av hver tumor ved slutten av forsøket, og antall pUbC-S /MAR vektorgenomer pr diploid genom er vist, etter normalisering med GAPDH-genet, som beskrevet i materialer og metoder. (D) PCR-analyse av DNA isolert
in vitro
fra Huh7 (kolonne 1) og MIA-PaCa2 (kolonne 4) celler før injeksjon i NOD /SCID mus, og
in vivo
fra to forskjellige regioner av tumor for hver cellelinje (kolonnene 2,3 for Huh7 og kolonnene 5,6 for MIA-PaCa2 cellelinjer). Forventet PCR produkt størrelse: 1091 bp. 100 bp DNA ladder (kjørefelt M), (+) positiv kontroll: pUbC-S /MAR; (-) Negativ kontroll: PCR mix uten DNA. (E) Plasmid redningsforsøk av fire
E. Coli
kolonier for Huh7 (baner 1-4) og tre kolonier for MIA-PaCa2 cellelinjer (baner 5-7), viser identisk restriksjonsmønster med ren pUbC- S /MAR plasmid (+), følgende begrensning fordøye med
Spe
I enzym. M:. 1 kbp stige (Hyperladder jeg, Bioline)
I tillegg har vi utført en replikering avhengig begrensning analyse for å vise pDNA replikering. Total tumor-DNA fra to forskjellige områder av enten HCC eller PACA-tumor, ble isolert fra dyregruppene som ble behandlet med pUbC-S /MAR-plasmidet ved slutten av 35 dagers eksperiment, og ble spaltet med
Spe
I, en enkelt kutter, for å linearisere plasmidet, før videre fordøyelse over natten med metylering sensitive enzymer
DPN
jeg,
Mbo
jeg eller
BFU
CI. Alle tre enzymene gjenkjenne den samme sekvens (GATC).
DPN
jeg krever metylering av målet DNA ved bakterielle celler for fordøyelsen, mens
Mbo
jeg begrensningen er avhengig av pattedyrs DNA metylering og
BFU
Cl kutt uavhengig av metylering status og skiller ikke kilden for metylering.
restriksjonsspalting fragmentene ble separert på en 0,8% agarose-gel, deretter blottet og undersøkt med et 408-bp fragment fra det kanamycin-resistensgenet. The Southern blot analyse (figur 4B) tjener til å sammenligne fordøyelsen mønster av pUbC-S /MAR i svulst DNA isolert fra Huh7 behandlet dyregruppen (figur 4B baner 1-3) med at fra MIA-PaCa2 gruppe (Figur 4B baner 4-6).
Et tap av bakteriell metylering av pUbC-S /MAR plasmid er funnet i DNA isolert fra både svulster når disse er fordøyd med
Spe
i /
Mbo
jeg eller
Spe
I /
DPN
I, henholdsvis (sporene 1,2,4,5). Vellykket fordøyelsen av
Mbo
jeg indikeres ved konvertering av den lineære
Spe
jeg bandet til fordøyelsen fragmenter (spor 1 for Huh7 og spor 4 for MIA-PaCa2), og mangel på fordøyelsen ved
DPN
jeg forlater singel
Spe
jeg linearisert bandet intakt (spor 2 for Huh7 og spor 5 for MIA-PaCa2). Som
Mbo
jeg bare kutter pattedyr-avledet DNA, mens
DPN
jeg krever bakteriell metylering for fordøyelsen, indikerer dette at pUbC-S /MAR plasmid har replikert i tumorceller til både HCC og Paca. Til slutt, fordøyelse med
Spe
I-
BFU
CI ikke er blokkert av noen form for metylering og fungerer som en positiv kontroll for plasmid fordøyelsen (søyle 3 og 6). Disse data indikerer at S /MAR-plasmid pUbC-S /MAR er i stand til å replikere
in vivo
etter levering av stabilt transfekterte cellelinjer, på samme måte studier
in vitro
hvori S /MAR-utrustet pDNA er i stand til å oppnå mitotisk stabilitet og replikasjon [26]. Riktig størrelse begrensning fordøyelsen band antyder mitotisk stabilitet uten brutto rearrangements av reproduserende plasmid.
Kvantitativ PCR ble utført ved avslutningen av forsøket (35 dager etter levering) for å sammenligne den relative kopiantall av plasmid molekyler i Huh7 og MIA-PaCa2 behandlet grupper. Resultatene er vist i figur 4C, hvor i begge tilfeller plasmid kopitall er beregnet til å være omtrent en til tre vektor kopier /celle, i samsvar med tidligere rapporter som viser et forholdsvis lavt kopiantallet av S /MAR-vektoren på mindre enn 10 kopier /celle [18], [25], [29].
i tillegg vedlikehold av den transgene markør-genet ble også vist ved hjelp av PCR-analyse av DNA isolert fra dyrkede «» MIA-PaCa2 og Huh7-celler (Figur 4D , baner 1 og 4) og fra to forskjellige områder av svulstvev 35 dager etter levering (figur 4D, baner 2,3 for Huh7 og baner 5,6 for MIA-PaCa2). Et PCR-produkt med forventet størrelse, 1091 bps, ble generert fra DNA fra alle kilder indikerer at pUbC-S /MAR plasmid ble opprettholdt i både Huh7 og MIA-PaCa2 celler, og i løpet av tumor avledet fra disse cellene etter injeksjon i NOD -SCID mus. Dette bekrefter tilstedeværelsen av pUbC-S /MAR plasmid både
in vitro Hotell og
in vivo.
Diskusjoner
Dette arbeidet representerer utviklingen av murine tumormodeller er avledet fra to forskjellige cellelinjer. Betydelig, viser denne studien for første gang etablering av genetisk merkede murine modeller av pankreas og hepatocellulært karsinom ved hjelp av en ikke-viral episomale plasmid vektor. Både HCC og Paca har høye forekomster; HCC er den femte vanligste kreftformen i verden og står for 80-90% av primær leverkreft [30], mens det er rundt 42 470 personer diagnostisert med kreft i bukspyttkjertelen hvert år i USA med mindre enn 20% en- års overlevelse [31].
Gitt utbredelsen av disse sykdommene, er det viktig at en effektiv metode bli utviklet for å forbedre sykdoms deteksjon og prognose. Generering av en effektiv genetisk merket murine tumormodell for HCC og Paca er et viktig skritt i denne prosessen som det vil gjøre effekten av potensielle legemiddel å være lettere og mer presist overvåkes og vil derfor gi mer pålitelige data når du utvikler nye kreftmedisiner.
Forsøk på å generere genetisk merkede tumorer tidligere har hatt begrensninger, for eksempel risiko for integrasjon med virale vektorer og potensiell insertional mutagenese. Videre er det genotoksistet av virale vektorer kan betraktelig endre egenskapene til sin mottakercellen og etterfølgende datterceller. Ved opprettelse av tumorxenografter, jo færre endringer gjort til de opprinnelige tumorcellene den bedre representasjon av kreft modell. Derfor er utvikling av ikke-virale vektorer i kreftforskning for å minimalisere disse negative effektene er avgjørende. Vårt tidligere arbeid har vist sterk vedvarende episomal luciferase-ekspresjon
in vivo
, fra et pDNA ekspresjonssystem som omfatter en S /MAR element og et pattedyr promoter i den murine leveren [11], [20], [21]. Sporing av luciferase-transgenet over tid i en enkelt dyr uten behov for avliving av dyrene viser nytten av denne vektor i genetisk merkede tumorceller for å følge utviklingen av en tumormodell simpelthen ved
in vivo
avbildning. Som vist her, gjør at S /MAR vektor stabil transfeksjon av kreftceller og påfølgende utvikling av HCC og Paca tumorxenotransplantater. Dette notatet beskriver den første demonstrasjonen av funksjonell bruk av en S /MAR vektor for å stabilt transfektere kreftceller til genetisk merke svulster
in vivo
.
Tidligere studier
in vitro
har vist at S /MAR vektorer kan gjenskape episomally uavhengig av arrangøren brukt. Vi bekrefte og utvide denne observasjonen med pUbC-S /MAR vektor i Huh7 og MIA-PaCa2 cellelinjer. Vi har oppnådd lignende resultater ved å bruke Pepi-Luc vektor – en S /MAR-plasmid hvor luciferase-ekspresjon drives av den humane CMV-promoter (data ikke vist). Men en tidligere studie for å markere tumorceller genetisk med en luciferase transgen drevet av CMV-promoteren [4] har vist begrensninger av denne promoter for langtids transgen ekspresjon ettersom CMV-promoteren lett inaktivert av flere verts mekanismer som for eksempel CpG metylering [11], [14], [15], [16], [17]. Denne begrensningen har blitt overvunnet ved vår undersøkelse, som viser en vedvarende ekspresjon fra pattedyr UBC-promotoren i kombinasjon med et S /MAR element. Differensiell etablering av celler kan ta hensyn til forskjeller i luciferase-ekspresjon sett mellom dyrene i hver gruppe etter administrasjon.
Histopatologi analyse av tumorene viste den typiske morfologi vev forventes av PACA og HCC (figur 3) og immunhistokjemisk analyse viste alle tumorceller avledet fra de injisert i mus for å være luciferase positive (figur 3). På bakgrunn av dette og den langsiktige transgen ekspresjon oppnådd i 35 dager etter injeksjon, hvor en kraftig økning av ekspresjon observeres etter 21 dager (Figur 2C), S dette /MAR vektoren synes å være ideelt egnet for bruk i kreftcellelinjer for å generere en genetisk merket murin modell av denne sykdommen.
