Abstract
Bakgrunn
Løselig guanylylcyklase (SGC) spiller en sentral rolle i nitrogenoksid (NO) -mediert signaltransduksjon i hjerte, nervesystemet og det gastrointestinale systemet. Alternativ RNA spleising har dukket opp som en mulig mekanisme for å modulere SGC uttrykk og aktivitet. C-α1 SGC er et alternativ skjøte form som er motstandsdyktig mot oksidasjon-indusert protein degradering og demonstrerer fortrinnsrett subcellular distribusjon til oksidert miljø av endoplasmatisk retikulum (ER).
Metodikk /hovedfunnene
her kan vi rapportere at skjøting av C-α1 SGC kan moduleres ved H
2o
2 behandling i BE2 neuroblastom og MDA-MD-468 adenokarsinom menneskeceller. I tillegg, viser vi at H
2o
2 behandling av MDA-MD-468-celler selektivt reduserer proteinnivåer PTBP1 og hnRNP A2 /B1 spleise faktorer som er identifisert som potensielt α1 genespleis regulatorer av
in silico
analyse. Vi viser videre at nedregulering av PTBP1 av H
2o
2 skjer på proteinnivå med variabel regulering observert i forskjellige brystkreftceller.
Konklusjoner /Betydningen
Vårt data viser at H
2o
2 regulerer RNA spleising å indusere ekspresjon av oksidasjonsbestandig C-α1 SGC subenheten. Vi rapporterer også at H
2o
2 behandling selektivt forandrer uttrykk for viktige spleise regulatorer. Denne prosessen kan spille en viktig rolle i reguleringen av mobilnettet tilpasning til forholdene for oksidativt stress
Citation. Cote GJ, Zhu W, Thomas A, Martin E, Murad F, Sharina IG (2012) Hydrogenperoksid Endrer Skjøting av Løselig guanylylcyklase og selektivt modulerer Expression of Skjøte regulatorer i humane kreftceller. PLoS ONE syv (7): e41099. doi: 10,1371 /journal.pone.0041099
Redaktør: Marcelo G. Bonini, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 16 november 2011; Godkjent: 21 juni 2012; Publisert: 20.07.2012
Copyright: © 2012 Cote et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd RO1 HL088128 og 3R01HL088128 og AHA South Central Affiliate Grant-in-Aid 09GRNT2060182 til EM og avdelings oppstart midler til IS Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Alternativ spleising ekspanderer transkriptomet mangfold [1], [2] og gjør det mulig for cellene å oppfylle kravene til et stadig skiftende ekstracellulære miljø. Vanlige belastninger som varmesjokk, aminosyre sult eller etanol toksisitet har blitt vist å regulere alternativ spleising [3], [4]. Oksidativt stress vedvarer ofte i cellulære mikromiljø når det er en ubalanse i produksjon og eliminering av reaktive oksygenarter (ROS). Denne ubalansen er forbundet med en mengde av patologiske tilstander, inkludert carcinogenesis, kardiovaskulære lidelser og nevrodegenerasjon [5], [6], [7], [8], [9]. Nyere bevis indikerer at alternativ spleising kan påvirkes av endringer i oksydativ balanse. Hypoksiske og hypoksi /reoksygenering forhold, som endrer ROS homeostase, har vist seg å modifisere skjøting av et antall gener i normale vev og kreft-cellelinjer [10], [11], [12], [13], [14]. Videre nye data viser at ROS kan også endre overflod av spleise faktorer eller endre sin aktivitet. Lave konsentrasjoner av hydrogenperoksyd (H
2o
2), et allestedsnærværende ROS molekyl, har blitt vist å indusere fosforylering av spleise faktor hnRNP C fører til modulasjon av dets RNA-bindende affinitet [15]. Økt hnRNP-C uttrykk er også funnet i intima hyperplasi og aterosklerose, som er foreslått til å bli assosiert med økning i H
2o
2 nivåer produsert av aktivert vaskulærendotelet [16].
Løselig guanylyl cyclase (SGC) er et nøkkelenzym av nitrogenoksid (NO) signalveien og spiller en viktig rolle i hjerte, neuronal og gastrointestinale funksjoner [17]. Aktiv Sgc protein er et jernholdig heme-inneholdende heterodimer bestående av a og p-subenheter, som aktiveres som reaksjon på bindingen av NO til sin heme-del. Heme oksidasjon er foreslått å være en av de mekanismene som er ansvarlige for dempning av NO /cGMP-signalering under forhold med oksidativt stress [18]. SGC-spesifikk hemmer 1H [1], [2], [4] oxadiazolo [4,3, a] kinoksalin-1-on (ODQ) oksyderer SGC jern heme til det treverdige formen for å undertrykke bindingen av NO. Eksponering av celler og vev til ODQ utløser SGC degradering på grunn av destabilisering av SGC heterodimer gjennom ubiquitinering og målrettet proteasomal degradering [18]. Vi har tidligere funnet en ny alternativt spleiset isoform av SGC, C-α1, noe som er fullt ut funksjonell til tross for en omfattende delesjon i N-terminus [19]. Overraskende, C-α1 skjøt formen var betydelig mer resistent overfor protein degradering indusert ved behandling med ODQ [19] og hadde en annen cellulær lokalisering i differensierende stamceller enn den kanoniske α1 SGC [20]. Nyere studier av Kraehling et al. viste at, i motsetning til den kanoniske α1 SGC isoform, tenderer den C-α1 isoform for å lokalisere til den mer oksydert miljøet i det endoplasmatiske retikulum (ER) er inne i cellen [21]. Disse observasjonene har ført oss til å foreslå at uttrykket av den alternative C-α1 protein isoform kan være forårsaket av oksidativt stress som en del av tilpasningen mekanisme for å bevare SGC aktivitet i oksidative betingelser.
I denne studien har vi undersøkt hvis spleising av α1 SGC-genet kan moduleres ved ROS, spesielt, ved behandling med H
2o
2. Vi fant ut at H
2o
2 induserer ekspresjon av C-α1 transkripsjon og C-α1 protein i humane kreftceller uttrykker α1 /β1 SGC. I et forsøk på å få innsikt i reguleringsmekanisme, vi undersøkte uttrykk nivåer av flere RNA-bindende proteiner potensielt involvert i spleising av C-α1 spleise variant. Våre studier viser at H
2o
2 behandling selektivt reduserer uttrykk for antatte α1 SGC spleise regulatorer PTBP1 og hnRNP A2 /B1. Videre viser vi at H
2o
2-indusert nedbrytning av PTBP1 forskjellig i ulike brystkreftcellelinjer. Så vidt vi vet, er dette en første rapport som viser at H
2o
2-indusert oksidativt stress påvirker alternativ spleising av SGC og selektivt modulerer protein nivå av store spleise faktorer.
Resultater
H
2o
2 induserer ekspresjon av C-α1 SGC spleisevariant
for å undersøke om alternativ spleising av GUCY1A3 (α1 SGC subenhetgen) er regulert som svar på oksidativt stress, behandlet vi menneske brystkreft MDA468 og menneske neuroblastom be2 cellelinjer med en mM H
2o
2. MDA468 og be2 celler endogent uttrykker α1 og β1 SGC. «H
2o
2-konsentrasjonen ble valgt basert på tidligere observasjoner som viser at interaksjonen med serum-proteiner i cellekulturmedier, absorpsjon av cellulære membraner og nøytralisering av enzymatiske komponenter av celle anti-oksidativ forsvar konsumere en betydelig del av eksogent tilsatte H
2o
2 [22], [23]. MDA468 og be2 celler viser en signifikant økning i C-α1 SGC alternativ transkripsjon uttrykk ved H
2o
2 behandling (Fig. 1 A, B). Den relative økningen av C-α1 isoform i forhold til α1 transkripsjon var større hos be2 celler, i tråd med våre tidligere studier [19]. Resultatene indikerte at GUCY1A3 spleising forandres til å tillate gjenkjennelse av C-α1 spesifikk 3 «spleisesete innenfor ekson 4 som reaksjon på H
2o
2 eksponering. Selv om det i noen eksperimenter nivået av C-α1 ble økt med ODQ, hverken cellelinjen viste statistisk signifikante forandringer i C-α1 transkripsjon nivå som tyder på at ODQ behandling alene er ikke tilstrekkelig til å påvirke skjøting regulering
:. RT- PCR-påvisning av α1 (øverst) og C-α1 (nederste band) SGC transkripter etter behandling med H
2o
2 (1 mM) eller ODQ (20 uM), som angitt. RT-PCR-produktene ble separert på 3% agarosegel og farget med etidiumbromid. Øvre bandet representerer meldingen koder kanoniske α1 protein (transkripsjoner 1-4, 270 bp); midten bandet er et ikke-spesifikt produkt; bunn båndet viser C-α1 SGC transkripsjon (Avskrift av 5, 94 bp). Biologiske triplikater representative for tre uavhengige eksperimenter er vist. B: Ratio (gjennomsnitt ± SD) på den relative overflod av C-a1 og a1 transkripsjoner kvantifisert ved densitometri. * P 0,05 ved t-test. C: Western blot-påvisning av α1 (øverst) og C-α1 (nederst) proteiner. MDA468 celler ble behandlet med 1 mM H
2o
2 som indikert i nærvær eller fravær av MG132 (10 uM). Vist blot er representative for fire uavhengige forsøk med lignende resultater. D: Forholdet mellom den relative overflod av C-a1 og a1 proteiner kvantifisert ved densitometri. Data er vist som gjennomsnitt ± SD fra fire uavhengige forsøk.
Neste, vi evaluert tidsforløpet av endringene i overflod av α1 og C-a1 SGC proteiner som svar på H
2o
2. Faller sammen med økninger i GUCY1A3 spleising vi har observert en tidsavhengig modulering av α1 og C-a1 SGC proteinnivåer. Som vist på fig. 1C og D, H
2o
2 økes den relative innholdet av C-α1 protein i MDA468 celler. For å vurdere bidraget fra proteasome avhengig nedbrytning i regulering av a1 SGC spleise former, utførte vi eksperimentet i nærvær av MG132, en potent celle-gjennomtrengelig proteasominhibitor. Vi fant at forhåndsbehandling med MG132 ikke påvirke hastigheten av akkumulering av C-α1 spleisevariant, eller nivået av den kanoniske α1 SGC-subenheten. Disse dataene tyder på at den observerte økning i C-α1 protein overflod (Fig. 1D) er trolig på grunn av en utvidet C-α1 uttrykk, og ikke til en selektiv nedbrytning av kanonisk α1 SGC. Av notatet er at MG132 behandling også forhøyede nivåer av en ukjent polypeptid gjenkjent av anti-a1 antistoffer med molekylvekt lavere enn C-α1 SGC (Fig. 1 D). Som identiteten av dette protein gjenstår å bli bestemt, var dens intensitet ikke tatt med i analysen densitometri.
Sammen våre resultater antydet at H
2o
2 induserer preferensiell spleising og ekspresjon av C-α1 SGC spleise form i våre cellemodeller.
i silico
analyse identifiserer potensielle a1 SGC (GUCY1A3) spleise regulatorer
for å få den første innsikten i mulige mekanismer for α1 SGC skjøting regulering, vi utførte
i silico
analyse ved hjelp av flere bioinformatikk [24]. Den C-α1 spleisevariant blir generert ved bruk av en alternativ 3 «spleisesete 179 basepar nedstrøms for den konstitutive området (Fig. 2A, fig. S1). Konstitutive og alternative spleiseseter for exon 4 av α1 SGC ble definert med UCSC Genome Bioinformatikk verktøy og deres relative enighet verdi undersøkt ved hjelp av menneskelig skjøting Finder [25], [26]. Alternativ spleising av ekson 4 spiller en sentral rolle i GUCY1A3 transkripsjon mangfold; i tillegg til den konstitutive området, inneholder ekson 2 alternative donorsteder og 2 alternative akseptorseter (se fig. 2A og S1 fig.). Med unntak av den konstitutive 5 «spleisesete donor, den relative konsensus styrken av alle områder viste seg å være lav (Fig. S1). Dette er et felles trekk ved alternativt behandlet eksoner som er tenkt å lette regulering av serin-arginin rik (SR) og heterogene kjerne ribonucleoprotein (hnRNP) proteiner [2]. ASD, alternativ spleising /skjøting Rainbow verktøyet fra European Molecular Biology Laboratory [27], ble brukt til å analysere relevante ekson og proksimale intronsekvenser for potensielle SR og hnRNP regulatorer av exon 4 spleising. Vi ga en kompositt oversikt over regulator bindingssteder ved hjelp av de utledede verdier for enkelt SR og hnRNP proteiner (Tabell S1). Denne analysen identifiserte en relativt jevn fordeling av SR bindingsseter i hele exon 4 og de flankerende regioner. På samme tid, den konstitutive 3 «spleisesete intron området viste en tett topp på hnRNP bindingsseter (fig. 2A). En nærmere undersøkelse identifisert i denne sekvensen flere overlappende bindingssteder for hnRNP 2A /B1, polypyrimidine-skrift-bindende protein 1 (hnRNP I, PTBP1), SRp20, SRp40 og Hu antigen R (Hur, ELAVL1) skjøte regulatorer (Fig. S1) . Plasseringen av disse områdene foreslått at tilsvarende spleise faktorene er sannsynlig å påvirke bruken av både kanoniske og alternative spleiseseter, fremme generasjon av C-α1 SGC transkripsjon
A:. Skjematisk fremstilling av GUCY1A3 alternativ spleising til generere C-α1. Den relative fordeling av forutsagte SR og hnRNP-bindingsseter er vist. B: Western analyse av PTBP1, hnRNP2A /1B, Hur og SR proteiner uttrykk i kontroll og H
2o
2-behandlet (1 mM, 24 timer) MDA468 celler. C: H
2o
2 doseavhengig vurdering av PTBP1 og hnRNP A2 /B1 proteinnivået i MDA468 celler. Vist Western blot er representative for minst tre uavhengige forsøk med lignende resultater. D, F: Densitometry analyse av PTBP1 og hnRNP A2 /B1 protein nivåer normalisert på β-aktin. Data er vist som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.
H
2o
2 selektivt endrer ekspresjonen av spleise faktorer
Det er vel etablert at uttrykket nivåer og den relative støkiometri av spleise faktorer modulere alternativ spleising [28]. Derfor undersøkte vi effekten av H
2o
2 eksponering på proteinnivå spleise faktorene er identifisert av vår
i silico
analyse som potensielle SGC regulatorer. Som vist på fig. 2B, eksponering av MDA468 celle til H
2o
2 selektivt redusert proteinnivå PTBP1 og hnRNP A2 /B1 spleise repressors. H
2o
2 ikke påvirke nivået av Hur regulator og bare ubetydelig endrede nivåer av SRp40 protein fra SR familie på spleise enhancers. Både PTBP1 og hnRNP A2 /B1-proteiner er redusert på en doseavhengig måte i MDA468 celler (fig. 2 C, D og F). Våre data indikerer at den observerte H
2o
2-avhengige bryter i spleising av GUCY1A3 gen faller sammen med endringer i nivået av regulatoriske skjøte faktorer. Imidlertid gjenstår det eksakte mekanismen og bidraget av spesifikke spleise faktorer i reguleringen av SGC spleising skal fastsettes.
Innsikt i mekanismen av H
2o
2-indusert PTBP1 protein degradering
Neste vi utforsket mulige mekanismer hnRNP regulering av H
2o
2. Vi valgte å fokusere på PTBP1 siden dette grundig studert RNA-bindende protein spiller en viktig rolle i forskjellige trinn av cellulær mRNA prosessering, inkludert spleising, regulering av stabilitet, lokalisering og oversettelse [29]. Videre PTBP1 har vist seg å være viktig for reguleringen av cellevekst og kreft celler overlevelse [30], [31], [32]. Evnen til H
2o
2 for å redusere PTBP1 nivåer antydet at, i tillegg, kan den spille en rolle i reguleringen av cellulær tilpasning til oksidative betingelser. Imidlertid har effekten av forhøyede ROS-nivåer på PTBP1 uttrykk aldri blitt undersøkt tidligere.
Vi først undersøkt om H
2o
2 Endrer PTBP1 mRNA likevektsnivåer. RT-qPCR analyse utført med RNA prøver isolert fra MDA468 celler behandlet med ulike H
2o
2 konsentrasjoner ingen endringer i PTBP1 mRNA nivåer (Fig. 3C) indikerer at PTBP1 er sannsynlig å bli kontrollert på proteinnivå. For å undersøke rollen til proteasomal degradering, overvåket vi dynamikken i endringer i PTBP1 protein som reaksjon på H
2o
2 behandling i løpet av en 16 timers periode i nærvær eller fravær av proteasominhibitor MG132. Vi fant at PTBP1 protein ble redusert i en tidsavhengig måte som starter på 8 timer etter eksponering (fig. 3 A, B). Det er interessant at proteinnedbrytingen ikke ble forhindret, men snarere forsterket, med MG132 behandling. Dette var spesielt tydelig ved 16-timers og senere tidspunkter (fig. 3A og data ikke vist). Således, mens MG132 behandling viste at proteosomet hadde ingen direkte effekt på PTBP1 degradering, er det faktum at dens inhibering akselererer nedbrytning innebærer en indirekte rolle i reguleringen, mest sannsynlig ved stabilisering av en ukjent protease eller protein kofaktor. Forbehandling av MDA468 celler med cycloheximide (CHX, den hemmer av
de novo
proteinsyntesen) også ikke hindre PTBP1 nedgang, noe som indikerer at H
2o
2 ble indusere en pre-eksisterende proteindegradering pathway (fig. 3D). Det har tidligere blitt vist at cellulær apoptose fører til degradering PTBP1 gjennom Capase-3-aktivering [33]. Således vi utforsket muligheten for at Caspase-3 kan spille en rolle i H
2o
2-indusert PTBP1 avtar. Men vi fant at tilsetning av caspase-3 hemmer IV (Ac-DMQD-CHO, Calbiochem) ikke hindre H
2o
2-indusert PTBP1 nedbrytning (resultater er ikke vist), noe som indikerer at caspase-3 er ikke involvert i denne prosessen. For å finne ut om andre eksogene kilder, foruten direkte tilsetning av H
2o
2-løsning, kan påvirke stabiliteten i PTB1, søkte vi glukose oksidase (GO) til cellekulturmedier. I samsvar med den direkte rollen H
2o
2 i induksjon av PTBP1 degradering, steady-state produksjon av H
2o
2 av GO behandling reproduseres effekten.
En : PTBP1 degradering oppstår i tidsavhengig måte og er ikke forhindres ved proteasominhibitor MG132. MDA468 celler ble behandlet som i fig. 1C med 1 mM H
2o
2 i nærvær eller fravær av MG132 (10 uM). Western blot-analyse ble utført for å visualisere ekspresjon av PTBP1. β-actin fungert som en lasting kontroll. Biologiske duplikater av hver behandling er vist; blot er representative for tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater. B: Densitometry analyse av PTBP1 proteinnivåer normalisert på β-aktin. Gjennomsnitt for representative biologiske duplikater for hver behandling blir vist. C: H
2o
2 eksponering påvirker ikke PTBP1 mRNA nivåer. MDA468 celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av H
2o
2 til 24 timer. Relative overflod av PTBP1 mRNA i prøvene ble analysert ved RT-qPCR-analyse. Gjennomsnittlig ΔCt ± SD for biologiske triplicates vises. D: PTBP1 nedbrytning er avhengig av tiol oksydasjon og er ikke reddet ved inhibering av
de novo
proteinsyntesen. Western blot-analyse utført på MDA468 cellelysater ble behandlet i 24 timer med inhibitor for proteinsyntese cycloxemide (2 ug /ml) og forskjellige faktorer som induserer oksidativt stress: 1 mM BSO (GSH uttømming inducer); 1 mM HEDS (tiol oksidasjon induser) og 0,01 enheter /ml glukose oksidase (øker produksjonen av ROS). Vist Western blot er representative for tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
H
2o
2 induserer posttranslasjonelle protein modifikasjoner som oksydasjon av intracellulære tioler og tiolat anioner. Disse modifikasjonene er en integrert del av H
2o
2 signale påvirker en rekke cellulære prosesser [34]. Det har tidligere vært vist at i oksidative betingelser PTBP1 kan danne dimerer på grunn av dannelse av intermolekylære disulfidbroer [35]. Faktisk, i våre eksperimenter også oppdaget vi at dannelsen av en høy molekylvekt proteinbånd gjenkjent av antistoffer PTB1 etter behandling av celler med MDA468 H
2o
2 (resultatene er ikke vist).
for å vurdere bidraget av tiol oksidasjon til PTBP1 degradering, utsettes vi MDA468 celler til to forskjellige forbindelser forandre celle tiol metabolisme. Behandling med 2-hydroksyetyl-disulfid (HEDS), et middel som virker som tiol-spesifikk oksidasjonsmiddel, betydelig redusert PTBP1 nivåer (Fig. 3D), noe som indikerer at direkte tiol oksydasjon kan spille en viktig rolle i PTBP1 degradering respons. For ytterligere å teste om PTBP1 nedbrytning er forårsaket av redusert cellulær tiol reduserende aktivitetsnivået til H
2o
2, vi behandlet også cellene med L-buthionine-S, R-sulfoksiminforbindelser (BSO). BSO er en irreversibel inhibitor av glutation biosyntese, mink intracellulær glutation bassenget. Vi observerte ingen vesentlig degradering av PTBP1 i respons til BSO, noe som tyder på at et redusert nivå av GSH er ikke tilstrekkelig til å indusere PTBP1 (Fig. 3D) degradering. Disse resultater kan også være knyttet til den iboende evne til MDA468 celler for å kompensere for den GSH tapet indusert av BSO, som tidligere har vært rapportert for cellelinjer med høy SOD-ekspresjon [36]. Således oksydasjon av Cys-tioler av H
2o
2 kan initiere dannelsen av PTBP1 dimerer og bidra til påfølgende proteindegradering.
H
2o
2 effekt på PTBP1 protein nivåene varierer i ulike brystkreft cellelinjer
for å bestemme det generelle H
2o
2-indusert PTBP1 degradering, vi testet flere brystkreftlinjer, inkludert: MDA-MD-453, MDA- MD-231 og MCF7-. Western blot-analyse av H
2o
2-behandlede celler viste forskjellige grader av PTBP1 reduksjon i MDA468, MCF7 og MDA231 celler, men ingen endring i MDA453 celler (Fig. 4A). Den manglende evne til å indusere PTBP1 degradering i MDA453-celler ble observert ved H
2o
2 konsentrasjoner som lett kan fremkalles betydelig nedgang i MDA468 celler (se fig. 4B Fig. 2B og C). Disse data antydet at omfanget av H
2o
2-indusert nedbrytning av PTBP1, tenkte utbredt, er fortsatt ganske cellelinje bestemt. For å undersøke om motstanden mot PTBP1 protein degradering er assosiert med økt evne til cellene til å overleve oksidativt stress, vi sammenlignet H
2o
2-indusert cytotoksisitet i MDA468 og MDA453 celler. MDA468 celler var mindre motstandsdyktig mot H
2o
2-indusert cytotoksisitet (IC
50 = 450 ± 60 uM) sammenlignet med MDA453 celler (IC
50 = 660 ± 2 uM) (Fig. 5 ). I et forsøk på å direkte koble en reduksjon i PTBP1 nivåer for å H
2o
2-indusert cytotoksisitet vi utførte siRNA-mediert PTBP1 knockdown i MDA453 celler. Til tross for en større enn 50% reduksjon i PTBP1 mRNA (som påvist ved RT-qPCR), celle-levedyktighet målinger viste bare en liten ubetydelig nedgang i motstand til H
2o
2-behandling (fig. S2). Disse dataene tyder på at nivået av ekspresjon PTBP1 alene er ikke av kritisk betydning for å støtte oksidativ motstand i MDA435 celler
A.: Western blot-analyse undersøker PTBP1 ekspresjon i MDA231, MDA453, MDA468 og MCF7 celler behandlet med 1 mM H-
2o
2 i 18 timer. Representative biologiske duplikater vises. B: MDA453 cellene er resistente mot H
2o
2-indusert PTBP1 degradering.
Topplate
: MDA453 celle ble behandlet med forskjellig konsentrasjon av H
2o
2 og cellelysatene ble utsatt for Western blot analyse med antistoffer mot PTBP1 og β-aktin. Vist blot er representative for fire uavhengige forsøk med lignende resultater.
Nedre panel
: densitometry analyse av PTBP1 proteinnivåer normalisert på p-aktin nivåer. Gjennomsnitt for representative biologiske duplikater for hver behandling blir vist.
Survival kurve ble generert i respons til H
2o
2 dosering hjelp trypan utelukkelse metode og uttrykt som% av overlevelse til ubehandlede kontroller . Mean ± SD av tre uavhengige passasjer utført i tre paralleller vises, * – p. 0,05 ved t-test i forhold til å kontrollere
Diskusjoner
I denne rapporten viser vi at oxidative stress indusert av H
2o
2 påvirkninger skjøting av α1 SGC genet (GUCY1A3) og selektivt reduserer proteinnivå PTBP1 og hnRNP A2 /B1 spleise faktorer. Vi har tidligere fastslått at GUCY1A3 transkripter undergå alternativ spleising, og at den C-α1 SGC skjøt isoform koder for et protein som er motstandsdyktig mot ODQ-indusert degradering [19], [37]. ODQ induserer nedbrytning ved oksydasjon av den protetiske SGC heme-gruppen, som destabiliserer protein. En lignende fremgangsmåte er foreslått for å forekomme under forhold med oksidativt stress og å være ansvarlig for redusert nivå av SGC protein i vaskulær inflammasjon [23]. I denne studien undersøkte vi om SGC spleising kan moduleres ved ROS som en potensiell mekanisme for å favorisere av ekspresjonen av oksidasjonsresistent C-α1 skjøt form.
H
2o
2 er et allestedsnærværende ROS molekyl som produseres i celler av superoksid dismutaser som en metabolitt av superoksid anion (O
2-). H
2o
2 er en relativt stabil og nøytralt ladet som gjør det mulig å lett krysse cellemembraner. Disse egenskapene har ført til forslaget om at H
2o
2 kan være involvert i parakrint oksidativt stress signaliserer [38], [39]. Derfor valgte vi å undersøke H
2o
2 som en formidler av oksidativt stress i våre studier utført på menneskelig BE2 neuroblastom og MDA468 bryst adenokarsinom cellelinjer. Våre data viser for første gang at en eksponering i H
2o
2, øker den relative mengde av C-α1 mRNA og protein i disse cellelinjer (Fig. 1). Dette resultat fastslår at C-α1 spleising kan moduleres ved fysiologisk relevant ROS forbindelse, og antyder at spleising kan spille en viktig rolle i modulering av SGC enzymatiske egenskaper som reaksjon på endringer i oksydativ balansen i mikromiljøet. En annen studie som støtter denne ideen har nylig blitt rapportert av Kraehling et al. [21]. Denne rapporten uavhengig bekreftet våre tidligere funn om at C-a1 SGC danner svært stabile og fullt aktive heterodimerer med β1 SGC. Videre er forskjellen i subcellulære fordeling av C-a1 og kanoniske a1 SGC subenheter blitt demonstrert ved hjelp av fluorescens-merket protein; C-α1 isoform ble lokalisert til mer oksyderte miljøet i endoplasmatisk retikulum. Sammen tyder disse data på at alternativ spleising av GUCY1A3 gen kan delta i adaptiv cellerespons for å bevare SGC funksjon i oksidativt stress. Videre studier for å evaluere den fysiologiske betydningen av en slik tilpasning er nødvendig.
For å få et innblikk i mulige mekanismer som er involvert i alternativ spleising av α1 SGC, vi utført en
i silico
analyse av relevante GUCY1A3 intronic og exonic sekvenser for å identifisere potensielle regulatoriske elementer [40], [41]. Fordelingen av forventet
cis
regulatoriske sekvenser var forenlig med en modell der SR proteiner ville favorisere kanoniske spleisesete bruk, mens binding av hnRNPs, spesielt PTBP1 og hnRNP A2 /B1, ville blokkere anerkjennelse av exon 4 konstituerende 3 «spleisesete for å fremme C-α1 isoform produksjon (fig. 2A og S1 fig.). For å teste vår modell vi undersøkte uttrykk for spleise faktorer før og etter eksponering for H
2o
2. Mens skjøting regulering er ofte oppnås ved å modulere ekspresjonsnivået av regulatoriske faktorer [28], har virkningen av oksidativt stress på denne fremgangsmåten ikke vært karakterisert tidligere. I motsetning til våre forventninger, dataene viste at H
2o
2 eksponering indusert en selektiv reduksjon av PTBP1 og hnRNP A2 /B1, og hadde ingen effekt på Hur og SR protein uttrykk (Fig. 2). Våre eksperimentelle resultater indikerer en mer kompleks regulering av SGC spleising enn spådd av
i silico
modell. Ytterligere undersøkelser er nødvendig for å forklare denne forskjellen. På en annen side er den spesifikke og dramatisk reduksjon av to viktige faktorer RNA spleise antydet at selektiv nedregulering av skjøte regulatorer kan være en av de mekanismer som ligger til grunn for endringene i alternativ spleising som reaksjon på oksidativt stress.
PTBP1 spiller en viktig rolle i en rekke post-transkripsjonelle regulatoriske prosesser, og dens aktivitet har vært knyttet til cellulær proliferasjon, apoptose, tumorigenese og respons på hypoksi [30], [42], [43], [44]. Derfor valgte vi å utforske videre effekten av H
2o
2 behandling på PTBP1 uttrykk. Våre resultater viste at H
2o
2 avtar PTBP1 ekspresjon i en dose- og tidsavhengig måte (fig. 2C, F og fig. 3A, B). Ingen endring i PTBP1 mRNA nivået ble observert, noe som indikerer at nedreguleringen forekommer post-transkripsjonelt (Fig. 3C). Videre er det flere timer forsinkelse i respons til H
2o
2 behandling antyder en indirekte mekanisme for PTBP1 nedregulering. Denne konklusjonen understøttes av den observasjon at proteasominhibitor MG132 lettes, og ikke hemmet, H
2o
2-indusert nedgang i PTBP1 protein (Fig. 3A, B). Fordi PTBP1 degradering ikke krever ny proteinsyntese (det ble ikke blokkert av cycloheximide behandling) våre funn tyder på at H
2o
2 kan potensielt forbedre proteasomal degradering av en eller annen ukjent faktor som er ansvarlig for PTBP1 stabilisering. Gitt at H
2o
2 eksponering er kjent for å indusere apoptose [45], vi betraktet som en caspase-mediert degradering av PTBP1. Tidligere studier har vist at PTBP1 er målrettet av Capase-3 under apoptotisk respons [33]. Imidlertid Inhibitor IV mislyktes i å forhindre H
2o
2-formidlet reduksjon i PTBP1 proteinnivåer (data ikke vist). Dermed konkluderer vi med at H
2o
2 sannsynligvis induserer PTBP1 degradering av en annen fra tidligere beskrevet mekanismer.
Det er også viktig å påpeke at PTBP1 degradering ikke var begrenset til direkte tilsetning av H
2o
2-løsning til cellene. Anvendelse av ekstracellulær glukoseoksidase (GO), som katalyserer omdannelsen av glukose til H
2o
2 og D-glucono-δ-lakton, også induserte en betydelig nedgang av PTBP1 protein i MDA468 celler (fig. 3D) .
reaksjonen av H
2o
2 med protein tiol (R-SH) og tiolat anioner (RS
-) er kjent for å generere sulfensyre syrer (RSOH) modifikasjoner og fremme disulfid bindingsdannelse. Disse proteiner ble innblandet i en rekke biokjemiske virkninger som medierer ROS signale [34], [46]. Interessant, dimerisering av PTBP1 molekyler via inter Cys bro dannelse ble observert tidligere i oksidative forhold [35]. Vi har utforsket muligheten for at nedregulering av PTBP1 protein av H
2o
2 er mediert av tiol oksydasjon. Faktisk, uspesifikk tiol oksiderende sammensatte HEDS fremkalte en betydelig nedgang på PTBP1 nivåer, ligner en direkte H
2o
2 eksponering (Fig. 3D). Dermed kan dimerization gjennom cystein oksidasjon målrette PTBP1 protein til påfølgende degradering. Avgrensning av en nøyaktig mekanisme ansvarlig for selektiv ROS-indusert nedbrytning av dette viktig regulator kan tilby flere viktige innsikt i cellulære oksidative respons
Tidligere har PTBP1 uttrykk vært korrelert med økning i spredning og metastatisk potensial av kreftceller.;
