Abstract
Bakgrunn
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis, med en fem-års overlevelse rente på bare 15%. Kreft hemmer av PP2A (CIP2A) er en menneskelig oncoprotein hemmende PP2A i mange menneskelige kreftformer. Men om CIP2A kan være et nytt legemiddel mål for lungekreft er i stor grad uklart.
Metodikk /hovedfunnene
Normal og ondartede lunge vev ble avledet fra 60 lungekreftpasienter fra det sørlige Kina. RT-PCR, Western blotting og immunhistokjemi ble brukt for å vurdere ekspresjonen av CIP2A. Vi fant at blant 60 pasienter, CIP2A var umulig å oppdage eller svært lav i paratumor normalt vev, men ble dramatisk forhøyet i tumorprøver i 38 (63,3%) pasienter. CIP2A overekspresjon var assosiert med sigarettrøyking. Dempe CIP2A av siRNA hemmet spredning og klonogene aktivitet av lungekreft celler. Forbløffende nok fant vi en naturlig forbindelse, rabdocoetsin B som er hentet fra en tradisjonell kinesisk medisinsk urt Rabdosia coetsa, kan indusere nedregulering av CIP2A og inaktivering av Akt vei, og hemme spredning og indusere apoptose i en rekke av lungekreftceller.
Konklusjon /Betydning
Våre funn indikerer sterkt at CIP2A kunne være en effektiv mål for lungekreft narkotika utvikling, og de terapeutiske potensialer for CIP2A-målsøkende midler garanterer videre etterforskning.
Citation: Ma L, Wen ZS, Liu Z, Hu Z, Ma J, Chen XQ, et al. (2011) Overuttrykte og lite molekyl utløste nedregulering av CIP2A i lungekreft. PLoS ONE 6 (5): e20159. doi: 10,1371 /journal.pone.0020159
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 31 januar 2011; Godkjent: 12 april 2011; Publisert: 31. mai 2011
Copyright: © 2011 Ma et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Key Program for Basic forskning (973, 2010CB529201), nøkkelen Prosjekt of Knowledge Innovation Program av den kinesiske Academy of Sciences (KSCX1-YW-R-26 og KSCX2-YW-R-235), den Foundation National Natural Science of China (81071930, 30871110), National store vitenskapelige og tekniske Program for Drug Discovery (2009ZX09103-101), og Science and Technology Planning Project Guangzhou (2009Y-C011-2). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nesten 1,5 millioner mennesker ble diagnostisert med lungekreft og 1,4 millioner mennesker ble anslått til å dø av det i 2007 [1]. De to store former for lungekreft er ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og småcellet lungekreft (SCLC). Omtrent 85% av lungekreft er NSCLC, som kan deles inn i tre hoved histologiske undertyper: skvamøs karsinom, adenokarsinom, og storcelle karsinom. SCLC utgjør ca 15% av lungekrefttilfellene [2]. Røyking fører alle typer lungekreft, men er sterkest knyttet til SCLC og plateepitelkreft; adenokarsinom er den vanligste typen hos pasienter som aldri har røykt [2]. Nåværende behandling bestemmes av den histologiske type lungekreft og stadium ved diagnose, inkludert kirurgi, platina dublett terapi, stråleterapi og målrettet terapi. Dessverre er prognosen for lungekreft er dårlig med bare 15% av fem års total overlevelsesrate for alle faser kombinert [1]. Derfor er det et presserende behov for å identifisere mer effektive molekylære mål og nye målrettet terapi for lungekreft.
Cancerous hemmer av PP2A (CIP2A) er en menneskelig oncoprotein som stabiliserer c-myc ved å hemme protein fosfatase 2A (PP2A ) -mediert defosforylering av MYC ved serin 62 [3]. I tillegg til å hemme nedbrytning av c-Myc, synes CIP2A å bli regulert i en positiv tilbakekoplingssløyfe med c-Myc ved å fremme hverandres uttrykk [4]. CIP2A er over-uttrykt i humane hals og hode karsinomer, tykktarm, bryst, og magekreft, og er omvendt korrelert med sykdomsforløp i magekreft [3] – [7]. Men om CIP2A kan være et nytt legemiddel mål for kreft er ikke ferdig etterforsket, og anti-tumor aktivitet av CIP2A-målsøkende midler fortsatt i stor grad ukjent. Vi studerte uttrykk for CIP2A i lungekreft og skjermet for blyforbindelser som kan målrette CIP2A [8]. Her viser vi at CIP2A er markert oppregulert i lungekreftsvulster i forhold til pasient matchet tilstøtende normale lungevev, og rapporterer at en naturlig forbindelse som utløser nedregulering av CIP2A viser signifikant antitumoraktivitet i NSCLC cellelinjer.
Resultater
CIP2A er over-uttrykt i lungekreft og er assosiert med sigarettrøyking
Vi testet uttrykk for CIP2A på proteinnivået i ikke-ondartede og ondartede celler, og funnet ut at CIP2A ble sterkt uttrykt i lungekreft cellelinjer (A549, H1975, 95D og L78) sammenlignet med normale menneskelige embryonale lunge fibroblaster (HLF og MRC5) og normale menneskelige bronkiale epitelceller (HBEpiC) (Figur 1a). Vi deretter analysert CIP2A i 60 lungecancerprøver fra pasienter som kom fra sørlige Kina hvis grunnlinje karakteristika var oppført i tabell 1. Vi viste at CIP2A ble overuttrykt i 38 (63,3%) tumorprøver analysert ved western blotting (figur 1B). Imidlertid, i 60 pasienttilpassede tilstøtende normalt lungevev, CIP2A var ikke påvises i 57 (95%) prøver, og er svakt uttrykt i 3 (5%) eksemplarer hvor dets ekspresjon var mye lavere enn det i tumorprøver med de samme pasientene . I prøver fra 2 pasienter med inflammatorisk pseudo ble CIP2A ikke påvist i både pseudo og tilstøtende lunge vev (figur 1C). Immunhistokjemi analyse bekreftet at CIP2A ble dramatisk forhøyet med en høyere immunoreaktivitets score i tumorprøver i 26 av 39 pasienter (66,7%) som ble testet (figur 1D). På mRNA nivå,
CIP2A
var også over-uttrykt i lunge tumorvev i forhold til normal lunge vev i 39 av 58 (67,2%) av pasientene som ble testet (figur 1E). Til sammen er CIP2A dramatisk forhøyet hos lungekrefttumorprøver sammenlignet med sammenkoblede normale lungevev
(A). Western blot analyse av CIP2A i humane lungekreftceller (A549, H1975, 95D og L78), embryonale lunge fibroblast-celler (HLF og MRC-5), og normale humane bronkiale epitelceller (HBEpiC). (B): Western blot analyser av CIP2A protein i primærlungesvulster (T) og tilstøtende normale lungevev (N). β-Actin anvendes som en lastekontroll. Representative resultater er vist og tall er referert til den enkelte pasient. (C): Western blot analyser av CIP2A protein i betennelsespseudo (P) og tilstøtende normalt lungevev (N). β-Actin anvendes som en lastekontroll. (D): Representative bilder (venstre panel) og resultatet (høyre panel) av immunhistokjemi farging for CIP2A uttrykk i primære lungesvulster (T) og tilstøtende normale lungevev (N). (E): RT-PCR-analyser av
CIP2A
mRNA i primær lungesvulster (T) og tilstøtende normalt lungevev (N).
GAPDH
er ansatt som en lasting kontroll. Representative Resultatene er vist og tallene er henvist til den enkelte pasient.
CIP2A overekspresjon er assosiert med sigarettrøyking
Vi har analysert sammenhengen mellom CIP2A overekspresjon og noen clinicopathologic variabler. Dataene viste at CIP2A overekspresjon i lungekreft var signifikant korrelert med histologisk type plateepitelkarsinom (p = 0,003) og mannlig kjønn (p = 0,008) (tabell 1) som ble vist sterkt knytte kontakter med sigarettrøyking [2], [ ,,,0],9]. Videre våre data viste tydelig at den høye uttrykk for CIP2A var assosiert med røyker pasienter (p = 0,004). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i den CIP2A status i henhold til den patologiske trinn (p = 0,639) og alder (0,082) (tabell 1). I et forsøk på å avklare de viktigste faktorene knyttet til CIP2A overekspresjon ble multivariate analysene utføres, og multivariate logistisk regresjonsanalyse (tabell 2) viste at røyking var den eneste signifikante variable knyttet CIP2A overekspresjon i lungekreft (p = 0,008 ).
nitrosamine 4- (methylnitro-samino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon eller nikotin-avledet nitrosamine keton (NNK), er en viktig ingrediens i tobakksrøyk kreftfremkallende som systemisk induserer svulster i lungene hos rotter, mus og hamstere og også spiller en stor rolle i lunge kreftutvikling [10], [11]. Vi deretter undersøkt om NNK kan direkte forårsake oppregulering av CIP2A eller ikke. For å gjøre dette, ble HBEpiC (figur 2A) og BEAS-2B (figur 2B) bronkiale epitelceller utsatt for NNK på angitte konsentrasjon for angitte tidspunkter, lysert, og western blot ble utført for å analysere uttrykk for CIP2A. Resultatene viste at behandling med NNK på 0,1 til 10 uM for opptil 18 dager kunne ikke forstyrre CIP2A uttrykk (figur 2, A og B). I denne studien har vi ikke teste den langsiktige effekten av NNK på CIP2A uttrykk
in vitro
eller
in vivo
(A):. HBEpiC celler ble behandlet med NNK på ulike konsentrasjoner for angitte tidspunkter, og western blot ble utført for å analysere CIP2A uttrykk. (B): BEAS-2B-celler ble behandlet med NNK ved indikerte konsentrasjoner for angitte tidspunkter, og western blot ble utført for å analysere CIP2A uttrykk. 0,05% og 0,1% DMSO ble anvendt som oppløsningsmiddel kontroll tilsvarende 5 μΜ og 10 μΜ NNK, respektivt.
CIP2A er nødvendig for lungekreftceller vekst og transformasjon
CIP2A spesifikk siRNA ble anvendt for å evaluere dens roller i lungekreft patogenese, og resultatene viste at sammenlignet med negativ kontroll (NC), CIP2A stanse (figur 3A) resulterte i inhibering av klonogene aktivitet av A549-celler, påvises ved foci dannelse ( Figur 3, B og C) og bløt agar-kolonidannelse (figur 3, D og E) assays [3]. Disse fenomenene ble bekreftet av resultatene av CIP2A støydempere i L78 celler (Figur S1, A til E). Deretter ble A549-celler transfektert med NC eller CIP2A-spesifikk siRNA (figur 3F), og injisert subkutant inn i høyre og venstre flanker 8 nakne mus henholdsvis, og tumorvolumene ble beregnet hver to dager [12]. Interessant, CIP2A-spesifikk siRNA signifikant hemmet tumorvekst i forhold til NC-siRNA (figur 3, G til I). Sammen indikerer disse data at CIP2A er avgjørende for lungekreft spredning og tumorgenese, og kan være en effektiv terapeutisk mål
(A):. Western blot-analyse av CIP2A protein ekspresjon i A549-celler 72 timer etter transfeksjon med negativ kontroll (NC) eller CIP2A spesifikke siRNA. (B og C): Flat plate klon formasjon analyse for klonogene aktiviteten av A549-celler 72 timer etter transfeksjon med NC eller CIP2A-spesifikk siRNA. (B): representant lette miscroscopy bilder. (C) Kvantifisering av foci telling. Vist er middelverdi + SD av fire uavhengige eksperimenter. (D og E): Myk-agar-kolonidannelse assay for A549-celler transfektert med NC eller CIP2A-spesifikk siRNA. (D): representant lette miscroscopy bilder. (E): Kvantifisering av foci telling. (F): Western blot-analyse av CIP2A protein i A549-celler transfektert med NC eller CIP2A-spesifikk siRNA i 72 timer. (G): nakne mus injisert subkutant med A549-celler transfektert med NC eller CIP2A-spesifikk siRNA. (H): Den tumorvekstkurve for forsøket vist i (G). Vist er middelverdi + SD av de midlere tumorvolum. (I) Bilde av xenografttumorer oppnådd fra mus som er vist i (G). * P 0,01, Student t test
Rabdocoetsin B er en CIP2A målretting naturlig forbindelse
Vår sentrale mål var å identifisere nye narkotika mål og gi blyforbindelser for legemiddelutvikling.. Vi screenet for CIP2A målretting små molekyler ved å analysere deres virkninger på CIP2A uttrykk, og identifisert et naturlig stoff hentet fra en kinesisk medisinsk urte Rabdosia coetsa, rabdocoetsin B [13], [14] (figur 4A), kan nedregulere CIP2A på proteinnivå ved 5 til 20 uM i A549-celler (Figur 4B). I H1975 celler, Rabdocoetsin B også utløst nedregulering av CIP2A på 5 til 10 mikrometer (Figur 4C). Vi analyserte mekanismen for CIP2A nedregulering forårsaket av Rabdocoetsin B, og fant at rabdocoetsin B inhiberte signifikant transkripsjon av CIP2A på en doseavhengig måte (figur 4D) bedømt ved sanntids RT-PCR.
(A): Struktur av rabdocoetsin B. (B): A549 celler ble behandlet med rabdocoetsin B (RDB) i forskjellige konsentrasjoner i 48 timer. Western blot ble anvendt for å detektere ekspresjon av CIP2A protein (øvre panel) og CIP2A proteinekspresjon ble kvantifisert og normalisert mot β-aktin uttrykket (nedre panel) (C): H1975-celler ble behandlet med rabdocoetsin B ved forskjellige konsentrasjoner i 24 timer. Western blot ble anvendt for å detektere ekspresjon av CIP2A protein (øvre panel) og CIP2A proteinekspresjon ble kvantifisert og normalisert mot β-aktin uttrykket (nedre panel) (D): A549 celler ble behandlet med rabdocoetsin B ved forskjellige konsentrasjoner i 48 timer, og mRNA uttrykk for
CIP2A
ble analysert ved hjelp av real-time RT-PCR.
Rabdocoetsin B hemmer CIP2A-modulert fosforylert Akt
i leverkreft celler, CIP2A up-regulerer fosfor-Akt (Pakt) og reduserer Akt relaterte PP2A aktivitet, mens stanse CIP2A re-aktiverer PP2A [15]. Siden Akt er konstitutivt aktiv i lungekreftceller og fremmer cellulær overlevelse og motstandsdyktighet overfor kjemoterapi og stråling [16], [17], undersøkte vi effekten av CIP2A på pakt i lungekreft. Vi viste at CIP2A lyddemping av spesifikke siRNA førte til nedregulering av Pakt men ikke Perk, PCNA, β-catenin, EGFR eller Src (figur 5A). Vi deretter undersøkt om rabdocoetsin B kunne modulere ekspresjonen av pakt, og funnet at behandling med rabdocoetsin B på 5 til 10 uM også ned-regulert pakt i A549 (figur 5B) og H1975 (figur 5C) celler. Vi viste videre at i H1975 celler ved rabdocoetsin B 10 mikrometer, ble CIP2A markert nedregulert i 6 til 12 timer og ble umulig å oppdage i 48 timer (figur 5D), mens Pakt ble redusert i 18 timer (Figur 5D). Disse resultatene ble bekreftet i A549-celler behandlet med rabdocoetsin B (figur 5E), som indikerer at denne forbindelsen kan hemme CIP2A-Akt bane i lungekreft
(A). A549-celler ble transfektert med NC eller CIP2A- spesifikk siRNA i 72 timer, og ekspresjon av angitte proteiner ble påvist ved anvendelse av Western blot. (B og C): A549 (B) og H1975-celler (C) ble behandlet med rabdocoetsin B (RDB) ved indikerte konsentrasjoner i 48 og 24 timer henholdsvis, og Western blots ble utført for å analysere ekspresjon av proteiner er angitt. (D og E): H1975 (D) og A549 (E) celler ble behandlet med rabdocoetsin B (RDB) for angitte tidspunkter, og Western blot-analyse ble utført med antistoffer som er spesifikke for de angitte proteiner. β-aktin brukes som en lasting kontroll.
Effekter av Rabdocoetsin B på lungekreftceller
Vi har evaluert effekten av rabdocoetsin B på lungekreft celler uttrykker wide-type (WT ) eller mutant EGFR. Vi viste at rabdocoetsin B viste signifikante cytotoksiske effekter på A549, NCI-H1975, HCC827, SPC-A-1, GLC-82, L78 og 95D lungecancercellelinjer (figur 6, A og B). Rabdocoetsin B induserte apoptose av A549-celler (figur 6C) med aktivering av Casp-8 og Casp-9 og spaltning av PARP (figur 6D). Rabdocoetsin B også forårsaket aktivering av Casp-8 og Casp-9 og spalting av PARP i NCI-H1975 celler (Figur 6E). Disse resultatene indikerer at rabdocoetsin B hemmer proliferasjonen og induserer apoptose av lungekreftceller via aktivering av endogene og eksogene apoptose trasé
(A):. Lungekreftceller ble behandlet med økende konsentrasjoner av Rabdocoetsin B (RDB) (fra 1 uM til 10 uM) og cellenes levedyktighet ble målt 48 timer ved MTT-analyse. (B): IC50 for celler behandlet med rabdocoetsin B. (C): Rabdocoetsin B induserer apoptose av A549-celler, analysert ved flow-cytometri. (D og E): Western blot ble utført for å påvise ekspresjon av apoptose regulatorer i A549 (D) og H1975-celler (E)
diskusjon
CIP2A er en auto. antigen [7] som er over-uttrykt i humane svulster [3] – [7], [18] – [21]. Peng [22] har vist at i de amerikanske baserte pasienter, er CIP2A økt i 61 av de 72 (84,7%) lungekreft vevsprøver, noe som er betydelig høyere enn i normalt lungevev (14,3%, 9/63). Nylig, Dong et al [23] rapporterte at i 29 pasienter fra Nord-Kina,
CIP2A
er over-uttrykt i mRNA nivå i 24 tilfeller (82,7%) i tumorprøver sammenlignet med de tilsvarende normale vev; CIP2A protein (påvist ved immunhistokjemi) er funnet å være overuttrykt i 72,2% av 90 lungekreftprøver og korreleres med dårlig overlevelse. Vi tester CIP2A ekspresjon i 60 pasienter fra Southern Kina [8], og rapporterer at CIP2A er drastisk øket i 63,3% (påvist ved western blotting) eller 67,2% (på mRNA-nivå) av tumorprøvene i forhold til tilstøtende normale vev (Figur 1) .
Vi viser for første gang at CIP2A overekspresjon er assosiert med sigarettrøyking. I 60 lungekreftpasienter undersøkt i dette studiet, 28 av 36 (77,8%) røyker pasienter som viser økt ekspresjon av CIP2A i tumorprøver i forhold til deres tilstøtende normale prøver, mens 10 av 24 (41,7%) nonsmoker tilfellene oppviser oppregulert CIP2A på proteinnivå (p = 0,004) (tabell 1). Foreløpig røyking fortsetter å være mer utbredt blant menn (63%) enn kvinner (3,8%) [24]. Vi rapporterer her at CIP2A er over-uttrykt i 30/40 (75%) og 8/20 (40%) hos menn og kvinner pasienter (p = 0,008) (tabell 1), henholdsvis. Vi finner også at CIP2A er forhøyet i 17/19 (89,5%) pasienter med plateepitelkarsinom, mens 17/35 (48,6%) pasienter med adenokarsinom har over uttrykt CIP2A (p = 0,003) (tabell 1). Den multivariate logistisk regresjonsanalyse viser klart at røyking er den eneste signifikante variable forbundet med CIP2A overekspresjon i lungekreft i våre omgivelser (p = 0,008) (tabell 2). Mens den totale andelen røykere i nord- og nordøst sektorer er høyere enn i sør og øst i Kina, er utbredelsen av passiv røyking blant røykere i Nord-Kina vesentlig høyere enn i røykere i Sør-Kina [24], [ ,,,0],25]. Disse kan bidra til forskjellen i CIP2A uttrykk mellom pasienter i våre omgivelser og Dong rapport [23]. Tobakksrøyk som forårsaker ca. 5-6 millioner dødsfall per år og 31% og 6% av alle lungekreftdødsfall hos middelaldrende menn og kvinner henholdsvis [26], kan indusere genetiske og epigenetiske forandringer og reduserer DNA-reparasjon kapasitet [2]. Zhao et al [27] nylig viste at i menneskelige mage cellelinjer,
Helicobacter pylori
infeksjon kan indusere CIP2A uttrykk via bakteriell oncoprotein CagA-forårsaket aktivering av Src og MEK /ERK signalveier. Selv NNK (0,1 til 50 mikrometer) unnlater å oppregulere CIP2A i HBEpiC og BEAS-2B celler i opp til 18 dager i vår studie (figur 2), kan vi ikke utelukke at NNK kan forstyrre uttrykket av oncoproteinet i en lengre eksponeringstid kurs, og denne hypotese garanterer videre undersøkelser.
CIP2A er kritisk for lungekreft cellevekst, ettersom CIP2A knockdown etter bestemte siRNA resulterer i signifikant inhibering av celleproliferasjon og transformasjon in vitro og in vivo (figur 3 og Figur S1). Disse data indikerer at CIP2A kan være et attraktivt mål for nye anti-lunge cancer medikamenter. Interessant, identifiserer vi en naturlig forbindelse rabdocoetsin B, kan nedregulerer CIP2A protein i lungekreftceller (figur 4, A til C) ved å hemme uttrykk på mRNA nivå (figur 4D). Studier viser at CIP2A kan opp-regulere Pakt [15], og våre resultater bekrefter at CIP2A lyddemping kan redusere Pakt (figur 5A). Vi viser videre at rabdocoetsin B hemmer også Pakt (Figur 5, B til E). Rabdocoetsin B hemmer vekst og induserer apoptose av en rekke lungekreftceller (figur 6, A til E). Våre data gir dermed en ledelse sammensatt for CIP2A målretting anti-tumor terapi.
Materialer og metoder
Pasientprøver
Bruk av prøvene ble godkjent av Institutional Review Board av Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences og The Cancer Hospital, Sun Yat-Sen University. All svulst og tilstøtende prøvene normale vev ble oppnådd med skriftlig informert samtykke fra pasienter ved Cancer Hospital, Sun Yat-Sen University. For RT-PCR-analyse, ble vevsprøver malt i flytende nitrogen kjølt mørtel, RNA ble ekstrahert ved anvendelse av Trizol (Invitrogen), og RT-PCR-eksperimenter ble utført ved anvendelse av PrimeScript® entrinns RT-PCR Kit Ver.2 (Takara) ifølge til produsentens protokoll. Sekvensene av primere som brukes for
CIP2A
er som følger: fremover 5′-CCATATGCTCACTCAGATGATGT-3 «, _ reversere 5′-GTGTATCATCTCCACAGAGAGTT-3» [5]
For Western blot analyse, vev. prøvene ble malt i flytende nitrogen avkjølt mørtel, ble vev pulver suspendert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% triton X-100, 1% natriumdeoksykolat, 0,1% SDS, 1 mM na
3VO
4, 1 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, komplett proteasehemmer cocktail) og klarert av sentrifugering. Like mengder av prøvene ble separert ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose og immunoblottet med anti-CIP2A eller anti-β-aktin-antistoff.
Immunhistokjemisk analyse og scoring av immunoreaktivitet ble utført som beskrevet [28]. Formalinfikserte, parafininnstøpte lungekreft vevsprøver (5 um) ble deparaffinized og underkastet en varmeinduserte epitop gjenfinning trinn i 2 min. «H
2o
2 (3%) ble anvendt for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet i 10 min. Snittene ble deretter vasket med PBS. De polyklonale kanin anti-CIP2A antistoff ble applisert på objektglassene i en fortynning på 1:500 ved 4 ° C over natten. Deteksjon ble oppnådd med Immunohistochemistry kit (pv-6001) (Zhongshan Golden Bridge Bioteknologi Co, Ltd, Beijing, Kina) i henhold til produsentens protokoll. Seksjonene ble farget med 3, 3′-diaminobenzidin (DAB) og kontra med hematoxylin, dehydrert, behandlet med xylen, og montert. CIP2A protein nivåer ble scoret som beskrevet [29].
Agenter
Rabdocoetsin B ble hentet fra Rabdosia coetsa av professor Han-Dong Sun. 3- (4, 5) -dimethylthiahiazo (-z-y1) -3, 5-di- phenytetrazoliumromide (MTT) ble innkjøpt fra Amresco, Inc. (Solon, OH). PE Annexin V-7AAD Apoptose Detection kit ble hentet fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA)
Antistoffer
De antistoffer som brukes i denne undersøkelsen var som følger:. Anti-β-Actin (Sigma); anti-Casp-9 (C9), anti-Casp-8 (1C12); anti-PARP, anti-fosfor-P44 /42 MAPK, anti-EGFR, anti-Src og anti-β-catenin (Cell signalering), anti-CIP2A (2G10-3B5), anti-Pakt og ATK (Santa Cruz Biotechnology) ; anti-ERK2 (Abcam); anti-PCNA (Abmart); anti-kanin eller anti-muse HRP-konjugert sekundært antistoff (Pierce); Rabbit Polyklonale anti-CIP2A (Novus Biologicals, Inc). Deteksjon ble utført ved hjelp av en Chemiluminescent Western deteksjon kit (Cell Signaling).
Cell kultur
lungekreftlinjer NCI-H1975 og A549 og menneskelige embryonale nyre HEK-293 celler ble hentet fra American Tissue Culture Collection (ATCC) og humane embryonale lunge fibroblast MRC-5 celler ble kjøpt fra Cell Resource Center, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing). Normale menneskelige bronkial epitelceller (HBEpiC, katalognummer: 3210) ble kjøpt fra ScienCell (ScienCell Research Laboratories, San Diego, California). Menneskelig lunge plateepitel karsinom cellelinjer L78 og høyt metastatiske stor celle lungekreft cellelinjer 95D ble oppnådd fra Celle bank av Chinese Academy of Sciences (Shanghai), og menneskelige embryonale lunge fibroblast HLF celler ble kjøpt fra Kenqiang Instrument Co., Ltd ( Shanghai, Kina). BEAS-2B bronkiale epitelceller ble gitt av professor Hongbin Ji ved Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. A549, HLF og BEAS-2B-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, New York), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin. HBEpiC celler ble dyrket i et serumfritt Bronchial Epithelial Cell Medium (BECM, Cat. No. 3211, ScienCell Research Laboratories) inneholdende essensielle og ikke-essensielle aminosyrer, vitaminer, hormoner, vekstfaktorer og spormineraler. L78, 95d og NCI-H1975-celler ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, New York), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin. MRC-5-celler ble dyrket i MEM /EBSS medium supplementert med ikke-essensielle aminosyrer, 10% føtalt bovint serum. (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, New York), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin
Vurdering av celleproliferasjon og apoptose
Celler ble behandlet med Rabdocoetsin B for Målt konsentrasjon og tidspunkter. Celleformering ble bestemt ved å anvende MTT-assay. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved trypan blå eksklusjon fargestoff. Eksternalisering av fosfatidylserin ble testet ved hjelp av en PE Annexin V-7 AAD apoptose Detection kit (BD Biosciences, San Jose, CA) i henhold til produsentens instruksjoner.
kvantitativ real-time PCR
Kvantitativ real- time PCR ble utført i CFX
TM96 real Time System (Bio-Rad) med SYBR® Premiks Ex Taq ™ (Perfect real Time) (Takara Kode: DRR041) i henhold til produsentens anvisninger. Primere for CIP2A og Actin var som følger: CIP2A: forover-sekvens, 5′-TGCGGCACTTGGAGGTAATTTC-3 «, omvendt sekvens, 5′-AGCTCTACAAGGCAACTCAAGC-3′; Actin: forover-sekvens, 5»-ATCGTCCACCGCAAATGCTTCTA-3 «, omvendt rekkefølge, 5′-AGCCATGCCAATCTCATCTTGTT-3». Nivåer av CIP2A mRNA ble uttrykt som forholdet versus aktin basert på CT-verdier.
siRNA analyser
Ved hjelp HiPerFect Transfeksjon Reagens (Qiagen, Crawley, UK) i henhold til produsentens protokoll ble cellene transfektert med 100 nM dobbelt-trådede oligonukleotider siRNA [3]. SiRNA-sekvensene var 5′-CUGUGGUUGUGUUUGCACUTT-3 «(CIP2A siRNA1), 5′-ACCAUUGAUAUCCUUAGAATT-3′ (CIP2A siRNA2) [3] og 5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «(negativ kontroll (NC) siRNA).
klonogene analysen
For foci formasjon, A549 eller L78 celler transfektert med negativ kontroll eller CIP2A-spesifikke siRNA ble sådd i tre eksemplarer på 35 mm plater (300 celler per plate). Etter 14 dagers dyrkning ble cellene farget med Giemsa og kloner som inneholdt mer enn 50 celler ble tellet. For soft-agar-kolonidannelse analysen ble cellene suspendert i 1 ml DMEM (for A549-celler) eller RPMI 1640 (for L78-celler) inneholdende 0,3% lavt smeltepunkt agarose (Amresco, Solon, OH) og 10% FBS og belagt på et nedre lag inneholdende 0,6% agarose i 35 mm plat (1.000 celler /skål) i tre eksemplarer. Etter 2-3 uker dyrking, ble platene farget med Giemsa og kolonier ble telt ved bruk av et lysmikroskop.
Murine modeller
Alle dyrestudier ble utført i henhold til protokoller godkjent av dyreetikk komité institutt for zoologi, Chinese Academy of Sciences, med godkjenning ID AEC2010070202. Alle mus brukt i denne studien ble avlet og opprettholdes i et bestemt patogen-fri omgivelser. Nakne mus (n = 8) ble injisert subkutant med A549-celler (4 x 10
6) transfektert med NC eller CIP2A spesifikk siRNA inn i høyre og venstre flanker henholdsvis, og tumoren ble beregnet som beskrevet [12].
Statistisk analyse
Forskjeller mellom datagruppene ble evaluert for signifikans ved hjelp av Student
t
-test av uparede data, χ
2 test eller enveis variansanalyse og Bonferroni post -test. Svulsten volumet ble analysert med enveis ANOVA og uavhengig prøve
t
test ved hjelp av programvaren SPSS 12.0 for Windows (Chicago, IL). Sammenhengen mellom CIP2A høyt uttrykk og clinicopathological funksjon ble vurdert ved hjelp av enten χ
2 test eller Fisher eksakt test, og en baklengs trinnvis multivariat logistisk regresjonsanalyse ble utført for å undersøke de viktigste variablene knyttet til CIP2A over-uttrykk etter justering . P-verdiene 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle forsøkene ble gjentas minst tre ganger, og dataene ble presentert som gjennomsnitt ± SD hvis ikke annet er angitt.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Effekten av CIP2A utarming på L78 cellenes vekst og trasnsformation. (A): Western blot-analyse av CIP2A protein ekspresjon i L78-celler 72 timer etter transfeksjon med NC eller CIP2A-spesifikk siRNA. (B og C): Flat plate klon formasjon assay for klonogene aktivitet av L78-celler 72 timer etter transfeksjon med NC eller CIP2A-spesifikk siRNA. (B): Representative lysmikroskopi bilder. (C) Kvantifisering av foci telling. Vist er middelverdi + SD for tre uavhengige eksperimenter. (D og E): Soft-agar-kolonidannelse analyse av L78 celler transfektert med NC eller CIP2A spesifikke siRNA. (D): Representative lysmikroskopi bilder. (E): Kvantifisering av foci telling
doi:. 10,1371 /journal.pone.0020159.s001 plakater (TIF)
Takk
Vi takker Professorer Zhu Chen, Sai- Juan Chen og Zhen-Yi Wang ved Shanghai Institute of Hematology for deres langsiktige støtte. Forfatterne takker professor Jukka Westermarck ved Universitetet i Turku, Finland for å gi pcDNA3.1-CIP2A konstruere, og professor Hongbin Ji ved Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences for å gi Beas-2B celler.
