Abstract
Bakgrunn
utskilt protein syrlig og rik på cystein (SPARC) er et glykoprotein som fungerer for å hemme angiogenese, spredning, og invasjonen i ulike typer kreft. Evnen til SPARC- til å modulere neovaskularisering er antatt å være formidlet delvis av sin evne til å modulere ekspresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og matriksmetalloproteinaser (MMP’er). I denne studien ønsket vi å bestemme effekten av SPARC uttrykk i magekreftceller på spredning og angiogenese
in vitro Hotell og
in vivo
.
Metode
Vi evaluerte uttrykk for SPARC i syv menneskelige mage kreft cellelinjer. Da har vi etablert et stabilt transfektert SPARC overexpressed cellelinje (BGC-SP) og et stabilt transfektert SPARC knock-down cellelinje (HGC-sh). Effekten av SPARC overekspresjon og SPARC lyddemping ble studert ved å undersøke kapillær dannelsen av HUVECs
in vitro Hotell og en dorsal hud-fold kammer modell
in vivo
. Kvantitativ real-time PCR og Western blotting ble utført for å oppdage om de uttrykk for VEGF og MMP-7 ble modulert av SPARC uttrykk. For ytterligere å bestemme effekten av SPARC uttrykk på angiogenese
in vivo
, ble xenograft modeller etablert og microvessel tetthet (MVD) forskjellige kloner ble oppdaget av immunhistokjemi.
Resultater
endogen SPARC- overekspresjon hemmet ekspresjon av VEGF og MMP-7, samt angiogenese indusert av BGC-SP-celler. Tilsvarende SPARC- stanse øket ekspresjon av VEGF og MMP-7, samt angiogenese indusert av HGC-SH-celler. Forhøyet angiogenese indusert av SPARC stanse i HGC-sh celler ble redusert ved VEGF ble nøytralisert av antistoffer, og MMP-7 ble slått ned
in vitro
.
Konklusjon
SPARC undertrykker angiogenese av magekreft ved å nedregulere uttrykket av VEGF og MMP-7
Citation. Zhang JL, Chen GW, Liu YC, Wang PY, Wang X, Wan YL, et al. (2012) utskilt protein syrlig og rik i Cysteine (SPARC) Undertrykker angiogenese ved å nedregulere uttrykket av VEGF og MMP-7 i magekreft. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10,1371 /journal.pone.0044618
Redaktør: Rajesh Mohanraj, UAE University, De forente arabiske emirater
mottatt: 9. juni 2012; Godkjent: 06.08.2012; Publisert: 05.09.2012
Copyright: © Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Natural Science Foundation National of China (No. 30901417 /H1617). https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blant kreftrelaterte dødsfall, rangerer magekreft andre over hele verden etter lungekreft; nesten to tredjedeler av tilfellene forekommer i utviklingsland, inkludert 42% fra Kina [1]. Angiogenese er en viktig prosess i magekreft; derfor er regulatoriske og signalmolekyler som modulerer angiogenese blir fokus for dagens forskning. Angiogenese er ikke en aktiv prosess i seg selv; den styres av noen angiogene faktorer og noen hemmere av angiogenese.
Utskilt protein sure og rik på cystein (SPARC-), også kjent som Osteonectin eller BM-40, er en mangesidig utskilt glykoprotein som uttrykkes ved mange forskjellige typer av celler og er forbundet med bendannelse, fibrose og reparasjon av vev.
Nyere studier viser at SPARC- modulerer proliferasjon, apoptose, invasjon og angiogenese i forskjellige typer kreftceller, men rolle i SPARC- tumorgenesen er komplisert og synes å være celletype spesifikk grunn av sine forskjellige funksjoner i en gitt mikromiljø [2]. SPARC fungerer som en tumor suppressor i bryst, neuroblastom, bukspyttkjertelen, eggstokkene og lungekreft [3]. Ovarian cancer i SPARC–null-mus økte betydelig større enn det som i vill-type dyrene med forstørrede nivåer av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og matriks-metalloproteinaser (MMP) [4]. Ved å undertrykke tumor vaskularitet gjennom undertrykkelse av VEGF-ekspresjon og sekresjon, SPARC- hemmet vekst gliom [5]. SPARC- binder til VEGF, og dermed hemme VEGFR fosforylering, mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK) aktivering og VEGF-indusert DNA-syntese [6]. Imidlertid er rollen til SPARC- i angiogenese er også celletype spesifikk, noe som endrer signaloverførings hendelser som reaksjon på spesielle cellulære miljøer [7].
VEGF stimulerer angiogenese, og er den viktigste signalet protein som produseres av cellene [8]. MMP’er spiller viktige roller i tumorutvikling, ikke bare i å bryte ned den ekstracellulære matriks, men også ved regulering av angiogenese. MMP-7, som er den minste molekylvekt på alle MMP-familien, har vist seg å akselerere proliferasjon av human navlestrengvene endotelialceller (HUVECs) på en doseavhengig måte
in vitro product: [9].
Den primære funksjon av SPARC i angiogenese av magekreft cellelinjer er fortsatt uklart. Derfor, i denne studien, hypotese vi at SPARC kan modulere spredning og angiogenese ved å regulere VEGF og MMP-7 uttrykk i magekreftceller. For å teste disse hypotesene, testet vi uttrykk for SPARC i sju magekreftcellelinjer. Så, for å vurdere effekten av endret SPARC på mage kreftceller, etablerte vi et BGC-SP-klone som overexpressed SPARC og en HGC-sh-klone der den endogene SPARC ble slått ned.
Resultater
uttrykk av SPARC i Cultured Gastric cancer Celler
Vi evaluerte uttrykk for SPARC i flere menneskelige mage kreft cellelinjer. Western blotting viste at SPARC var undectable i AGS, MKN45, NCI-N87 og BGC-823 cellelinjer, uttrykte imidlertid SGC-7901 cellelinje lavt nivå av SPARC og HGC-27, MGC-803 cellelinjer uttrykte høyt nivå av SPARC ( Figur 1A).
(A) SPARC protein uttrykk i 7 typer mage kreft cellelinjer. (B) SPARC protein (øvre panel) og mRNA (nedre panel) uttrykk i foreldre celler (BGC-P og HGC-P), tomme vektor transfekterte kloner (BGC-EV og HGC-EV), SPARC cDNA-uttrykker klone (BGC -SP) og SPARC shRNA-uttrykke klone (HGC-sh). GAPDH tjente som lasting kontroll. (C) Celleformering ble bestemt ved MTT-analyse. BGC-P og HGC-P-celler og transfekterte kloner (500 celler) ble dyrket i 96-brønners plater og inkubert i 8 dager, og celleformering ble analysert ved MTT-metoden. Resultatene er vist som middel (± SD) av kvadruplikeres bestemmelser fra seks separate eksperimenter.
Overuttrykte og Hemming av endogen SPARC i magekreft cellelinjer
Western blotting viste at 43 kDa bånd som tilsvarer den SPARC protein ble signifikant økt i BGC-SP (BGC-celler som uttrykker SPARC- cDNA)-celler sammenlignet med foreldre (BGC-P) og kontrollceller transfektert med den tomme vektoren (BGC-EV) (P 0,05); SPARC ble hemmet av nesten to tredjedeler i HGC-sh celler (HGC celler som uttrykker SPARC-shRNA) sammenlignet med HGC-P og HGC-EV celler (P 0,05, figur 1B). RT-PCR indikerte at SPARC- mRNA-ekspresjon i BGC-SP-celler ble øket sammenlignet med BGC-P og BGC-EV-celler (P 0,05); SPARC mRNA uttrykk i HGC-sh redusert med nesten 80% sammenlignet med HGC-P og HGC-EV celler (P 0,05, figur 1B).
SPARC Overuttrykte Reduserer spredning av magekreft cellelinjer
for å avgjøre om endret SPARC uttrykk påvirket spredning av magekreft cellelinjer, veksten av transfekterte celler ble sammenlignet med de av foreldre og tomme vektor kontroller. Dataene viste at veksten av BGC-SP-celler ble hemmet sammenlignet med BGC-P og BGC-EV-celler etter 8 dagers dyrking (P 0,05); veksten av HGC-sh celler ble økt noe sammenlignet med HGC-P og HGC-EV celler (P 0,05, figur 1C).
SPARC Overuttrykte i Gastric Cancer Cell Lines Reduserer Angiogenese
in vitro
og
in vivo
for å forstå effekten av endret SPARC uttrykk på angiogenese i mage kreft cellelinjer, ble HUVECs inkubert i kondisjonert medium. Den BGC-SP-supernatant induserte HUVECs til å differensiere til kapillær-lignende strukturer i løpet av 36 timer (2564,5 ± 553,1 um, P 0,05) til en mindre grad enn supernatanten fra BGC-EV-celler (5002,4 ± 665,7 mikrometer) og BGC-P-celler (5417,3 ± 784,25 mikrometer, figur 2A). Den HGC-sh supernatant indusert HUVECs å differensiere i kapillær-lignende strukturer innen 36 timer (7024,9 ± 923,1 nm, P 0,05) til en sterkere grad enn supernatanten fra HGC-EV celler (4456,2 ± 554,2 mikrometer) og HGC-P-celler (4023,4 ± 665,2 nm, figur 2A). Kvantifisering av den gjennomsnittlige rørlengden indikerte at røret lengden av HUVECs i kondisjonert media fra BGC-SP ble redusert med ca. 52,7% sammenlignet med kontrollceller; rørlengde av HUVECs i kondisjonert media fra HGC-sh kloner ble øket 74,6% sammenlignet med kontrollceller (figur 2A)
(A)
In vitro
angiogenese. HUVECs ble sådd i Matrigel -belagte 96-brønners plater inkubert med supernatanten innhøstet fra BGC-P og HGC-P-celler eller transfekterte kloner. Cellene ble tillatt å kultur i 36 timer på Matrigel i betinget medium. Effektene av kondisjonert medium på kapillær dannet av HUVECs ble analysert, og den kapillære lengden ble målt. Capillary lengde data som vises er midler (± s.d.) Av kvadruplikeres bestemmelser fra tre separate forsøk. * P 0,05, signifikant forskjell fra kontrollceller. (B)
In vivo
angiogenese: BGC-P, BGC-EV, BGC-SP, HGC-P, HGC -EV, eller HGC-sh (1 × 10
6) ble implantert i diffusjon kamre og opereres inn under rygghuden av atymiske nakne mus. PV, pre-eksisterende blodkar; TN, tumorindusert blodkar. Nydannede skip ble kvantifisert og representert som per felt. Kolonner er midler (± s.d.) Av kvadruplikeres felt fra tre separate forsøk. * P. 0,05, signifikant forskjell fra kontrollceller
Rygg vindu modellen viste at BGC-SP celler hadde en 40,4% reduksjon i tumor-indusert microvessels sammenlignet med kontrollceller (P 0,05) . HGC-SH-celler i rygghuden-fold kammer resulterte i en 73,2% økning i tumor-indusert mikrokar, med et større antall små blødninger flekker, sammenlignet med kontrollceller (P 0,05 figur 2B). Resultatene viste tydelig at SPARC overekspresjon i magekreft hemmet angiogenese
in vitro Hotell og
in vivo
.
Den MAPKs Signale Pathway og ekspresjon av VEGF og MMP-7 er hemmet av SPARC overuttrykte
for å bestemme effekten av SPARC overekspresjon på MMP-7 og VEGF, kvantitativ real-time PCR og Western blotting ble utført. Resultatene viste at MMP-7 og VEGF-ekspresjon ble negativt regulert av SPARC- uttrykk. I BGC-SP-celler, ble nivåene av MMP-7 mRNA, MMP-7-protein, VEGF mRNA og VEGF protein hemmet med 87,2%, 68,9%, 48,4% og 58,6%, henholdsvis, sammenlignet med tom vektor transfekterte celler. I HGC-SH-celler økte MMP-7 mRNA nivå 11.6-ganger, økte MMP-7 proteinnivået 8,1-fold, økte VEGF mRNA nivå 8,8-fold, og VEGF-proteinnivå øket 3,2 ganger sammenlignet med tom vektor-celler (figur 3A, B). For å avgjøre om MAPK signalveien ble regulert av SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 og p-38 nivåer ble vurdert av western blotting. Resultatene viste at nivåene av p-ERK1 /2 var signifikant redusert i BGC-SP-celler og forhøyet i HGC-SH-celler i sammenligning med deres kontrollceller (figur 3C).
(A) Cellelysater ble anvendt å utføre western blotting analyse for VEGF og MMP-7 uttrykk. GAPDH tjente som lasting kontroll. Uttrykk for VEGF og MMP-7 ble avvist på proteinnivå i BGC-SP celler. Uttrykk for VEGF og MMP-7 ble økt på proteinnivå i HGC-sh celler. Kolonner er midler (± s.d.) Fra tredoble eksperimenter; * P 0,05, signifikant forskjell fra kontrollceller. (B) Real-time PCR ble utført for vurdering av VEGF og MMP-7 mRNA transkripsjonsnivåer. GAPDH fungert som en laste kalibrering. Kolonner er midler (± s.d.) Fra tredoble eksperimenter; * P 0,05, signifikant forskjell fra kontrollceller. (C) Cellelysater ble anvendt for å utføre Western blot-analyse for molekyler i MAPK-signalveien. Aktivering av ERK1 /2 ble hemmet i BGC-SP celler sammenlignet med kontrollceller, men ERK1 /2 ble aktivert i HGC-sh celler sammenlignet med kontrollceller.
Knock-down av SPARC Expression i HGC-27 Cells Fremmer Angiogenese via oppregulert VEGF og MMP-7 Expression
for å bekrefte at de pro-angiogene effektene sett med nedsatt SPARC uttrykk skyldes økt MMP-7 og VEGF uttrykk og ikke til nivåer av SPARC seg selv, ble HUVECs inkubert i kondisjonert medium høstet fra HGC-sh celler med eksogent lagt rekombinant humant SPARC (rhSPARC, 0,3 mikrogram /ml). Våre data antyder at det å tilsette eksogen SPARC- ikke inhiberer kapillær-lignende strukturer av HUVECs sammenlignet med HGC-sh (figur 4), i motsetning til den anti-angiogene responsen observert med endogen ekspresjon av SPARC- i BGC823 celler (figur 2).
(A), kondisjonert medium fra HGC-P, HGC-EV, HGC-sh med eller uten rhSPARC (0,3 mikrogram /ml) og HGC-sh + MMP7-sh cellene ble konsentrert under de samme forholdene. β-kasein zymografi ble utført for MMP-7-aktivitet. ble utført Western blot-analyse for MMP-7, SPARC- og VEGF proteinnivåer i kondisjonert medium. Cellene ble samlet opp og lysatene probet med GAPDH-antistoff for å kalibrere totale mengde av de respektive proteiner. Kolonner er midler (± s.d.) Fra tredoble eksperimenter. (B)
In vitro
angiogenese: For å bekrefte at SPARC uttrykks-mediert anti-angiogene effektene skyldes endret MMP-7 og VEGF uttrykk snarere enn til uttrykk av SPARC selv, høstet supernatant fra HGC-sh celler ble tilsatt til 0,3 ug /ml rhSPARC. Supernatanter fra begge HGC-SH og HGC-sh + MMP7-sh celler med nøytraliserende antistoff mot VEGF ble også brukt i co-kultur-analysen (anti-VEGF = nøytraliserende antistoff mot VEGF). HUVECs ble sådd i Matrigel-belagte 96-brønners plater inkubert med kondisjonert medium. Effektene av kondisjonert medium på de pre-formet rør av HUVECs ble analysert, og røret lengde ble målt. Rørlengde data som er oppgitt er de midler (± s.d.) Av kvadruplikeres bestemmelser fra tre separate forsøk. * P 0,05, signifikant forskjell fra HGC-P-celler, ** P. 0,05, signifikant forskjell fra HGC-sh celler
For å karakterisere rollen til VEGF og MMP-7 i SPARC- videre mediert angiogenese modulasjon, MMP-7-shRNA og 1 ug /ml nøytraliserende VEGF-antistoff (Chemicon, Temacula, CA, USA) ble anvendt for HGC-sh kloner for å antagonisere funksjoner av MMP-7 og VEGF.
Vi undersøkte evnen til MMP-7 uttrykk i HGC-sh celler til å modulere angiogenese
in vitro
av stabilt trans MMP-7-shRNA inn HGC-sh celler. Figur 4A viser at ekspresjonen av MMP-7 i HGC-sh + MMP7-sh-celler ble nedregulert ved stabilt uttrykker MMP-7-sh-RNA til et nivå sammenlignbart med den til HGC-P og HGC-EV-celler. Å belyse rollen som MMP-7 i knock-down SPARC-mediert fremming av tumorcelle-indusert angiogenese, utførte vi kapillær formasjon analyse med kondisjonert media av HGC-sh celler og HGC-sh + MMP7-sh celler. Som vist i figur 4B, resultater indikerer at redusert MMP-7-ekspresjon i HGC-SH + MMP7-sh-celler førte til en signifikant redusert kapillær dannelsen av HUVECs
in vitro plakater (HGC-sh + MMP7-sh
vs
HGC-sh, P . 0,05)
for å bestemme funksjonen av forhøyet VEGF uttrykk indusert av SPARC stanse, VEGF i det kondisjonerte medium av HGC-sh og HGC-sh + MMP7-sh cellene ble nøytralisert ved VEGF-antistoff (1 ug /ml). Resultatene viste at kapillær dannelsen av HUVECs ble redusert betydelig i HGC-sh supernatant som inneholder VEGF nøytraliserende antistoff sammenlignet med supernatant fra HGC-sh celler alene (HGC-sh + anti-VEGF
vs
HGC-sh, P 0,05 figur 4B). Capillary dannelsen av HUVECs var nesten fullstendig hemmet når dyrket i kondisjonert medium fra HGC-sh + MMP7-sh celler pluss lagt VEGF nøytraliserende antistoff (
vs
HGC-sh, P 0,05 4B).
Serum-fritt kondisjonert medium høstet fra HGC-P, HGC-EV, HGC-sh med eller uten rhSPARC (0,3 ug /ml) og HGC-sh + MMP7-sH-celler ble konsentrert ved ultrafiltrering rør (Millipore, Bedford, MA , USA) under de samme betingelser. Western blotting viste at konsentrasjonen av SPARC i HGC-sh celler med 0,3 mikrogram /ml rhSPARC inmedium var like bra som den HGC-P supernatant (figur 4A).
Overuttrykte SPARC i magekreft Cells Hemmer Tumourigenicity i Nude Mice
for å vurdere den terapeutiske effekten av SPARC uttrykk, BGC-P, BGC-EV, BGC-SP celler eller HGC-P, HGC-EV, HGC-sh celler ble injisert subkutant i nakne mus. Det var ingen signifikant forskjell i størrelse mellom BGC-P (n = 6; bety tumorvolumet = 2004 ± 63 mm
3), BGC-EV (n = 6; bety tumorvolumet = 1856 ± 69 mm
3 ) xenografter. En betydelig reduksjon (39,1%) i gjennomsnittlig tumorvolumet ble funnet i dyr implantert med BGC-SP xenografter (n = 6; bety tumorvolumet = 1130 ± 55 mm
3) sammenlignet med dyr implantert med BGC-EV xenografter ( P 0,05, figur 5). Det var ingen signifikant forskjell i størrelse mellom HGC-P (n = 6; bety tumorvolum = 1605 ± 63 mm
3), HGC-EV (n = 6; bety tumorvolum = 1708 ± 82 mm
3 ) xenografter. En betydelig økning (50,3%) i midlere tumorvolum ble funnet i dyr implantert med HGC-sh xenotransplantater (n = 6; bety tumorvolum = 2412 ± 75 mm
3) sammenlignet med dyr implantert med HGC-EV xenotransplantater ( P . 0.05, figur 5)
(A) parafininnstøpte deler av xenopodet svulster ble brukt til immunhistokjemisk analyse av SPARC, MMP-7, VEGF, og CD-31. (B) Snittene ble farget med et monoklonalt antistoff mot humant SPARC-, VEGF, MMP-7. Sum tettheter ble beregnet og analysert ved hjelp av IPP 6,0. Kolonnene er en anordning (± s.d.) Av kvadruplikate bestemmelser fra seks mus i hver gruppe. * P 0,05, signifikant forskjell fra kontrollceller. (C) MVD i tumorvev ble kvantifisert ved telling av CD31-positive områder i hvert mikroskopisk synsfelt. Kolonnene er en anordning (± s.d.) Av kvadruplikate bestemmelser fra seks mus i hver gruppe. * P 0,05, signifikant forskjell fra kontrollceller. Tumorvolumet ble beregnet (volum = bredde
2 × lengde x 0,52). Volumet av svulster på den 50. dag merkes med gjennomsnittsverdiene (± SD) av seks mus i hver gruppe, * P. 0,05, signifikant forskjell fra kontrollceller
For å vurdere SPARC, VEGF , MMP-7 uttrykkene
in vivo
, xenograft seksjonene ble farget med et monoklonalt antistoff mot humant SPARC-, VEGF eller MMP-7. Figur 5A viser at BGC-SP svulster uttrykke mer SPARC enn BGC-P, BGC-EV svulster, mens samtidig VEGF, er MMP-7 uttrykk redusert (P 0,05, figur 5A). Seksjoner fra HGC-sh svulster uttrykke mindre SPARC enn HGC-P, HGC-EV svulster mens samtidig VEGF, er MMP-7 uttrykk økt (P 0,05, figur 5A). CD31 blir brukt primært for å demonstrere nærværet av vaskulære endotelceller i histologiske vevssnitt, som kan bidra til å vurdere graden av tumor angiogenese. For å vurdere om endret SPARC uttrykk formidlet den microvessel tetthet (MVD), analyserte vi angiogenese i xenografter ved histologisk analyse av CD-31. Det var ingen signifikant forskjell i MVD mellom BGC-P (12,5 ± 2,3 microvessels /0,145 mm
2), BGC-EV (11,5 ± 3,4 microvessels /0,145 mm
2) xenoimplantater. MVD ble redusert 54,8% i BGC-SP (5.2 ± 2.1 microvessels per /mm
2) svulster sammenlignet med BGC-EV tumorer (P 0,05, Figur 5). Det var ingen signifikant forskjell i MVD mellom HGC-P (6,4 ± 2,1 microvessels /0,145 mm
2), HGC-EV (6,9 ± 1,8 microvessels /0,145 mm
2) xenografter. MVD ble forhøyet 51,7% i HGC-sh (10,5 ± 1,5 microvessels /0,145 mm
2) svulster sammenlignet med HGC-EV tumorer (P 0,05, figur 5)
Diskusjoner
SPARC er en vev-spesifikk protein som påvirker flere celleprosesser som proliferasjon, invasjon, og angiogenese trinnløst i forskjellige typer vev. For eksempel, tidligere undersøkelser vist at SPARC- fremmet invasjonen mens samtidig å hemme veksten av tumorer [5], [10]. I medulloblastom, kan overekspresjon av SPARC- hemme angiogenese i tumoren ved å senke ekspresjon og sekresjon av VEGF og MMP-9 [11]. I melanom imidlertid ekspresjonen av SPARC- positivt korrelert med angiogenese [12]. Funksjonen av SPARC i magekreftceller er fortsatt uklart.
For å undersøke hvilken rolle SPARC i magekreft, vi først testet uttrykk for SPARC i syv cellelinjer av magekreft. De fleste cellelinjer uttrykte ikke, eller bare uttrykt lavt nivå av SPARC. For å finne ut hvilken rolle SPARC i vekst og angiogenese av magekreft, etablerte vi BGC-SP-klone som ble stabilt transfektert med en SPARC cDNA vektor, og HGC-sh-klone som ble stabilt transfektert med en shRNA vektor rettet mot SPARC mRNA. SPARC- ekspresjon økt betydelig i BGC-SP-klonen og redusert i HGC-sh-klon i forhold til sine respektive styre kloner, som bestemt ved western blotting og RT-PCR-analyser. Celleproliferasjon var lavere i BGC-SP-klone, og var høyere i HGC-sh klone enn i sine respektive styre kloner ved MTT metoden. Vi fant også at overekspresjon av SPARC hemmet tumorcelle-indusert kapillær dannelsen av HUVECs
in vitro Hotell og angiogenese i rygg vindu analysen
in vivo
. På den annen side, nedregulering av SPARC av mRNA interferens fremmet kapillær formasjon
in vitro Hotell og angiogenese
in vivo
.
Blodårene er avgjørende for å levere næringsstoffer til vev . Derfor er neovaskularisering uunnværlig for utviklingen av fast tumor. Tidligere studier har vist at SPARC- spiller en rolle i angiogenese [7]. Våre resultater viste at overekspresjon av SPARC- inhiberte angiogenese
in vitro
og
in vivo
i forbindelse med reduksjon av MMP-7, VEGF og fosforylert ERK1 /2, mens nedregulering av SPARC- fremmes angiogenese
in vitro Hotell og
in vivo
i forbindelse med økningen av MMP-7, VEGF og fosforylert ERK1 /2.
Vi videre gjennomført studier for å undersøke hvilken rolle VEGF og MMP-7 i SPARC-mediert angiogenese modulering. Når rekombinant human SPARC protein ble lagt inn i kondisjonert medium fra HGC-sh klone å gjenopprette SPARC konsentrasjon, gjorde dette kondisjonert medium ikke endre kapillær dannelsen av HUVECs av
in vitro
analyse i forhold til kapillær dannelsen av HUVECs inkubert i tilstanden medium uten eksogene rhSPARC. Vi så brukt MMP-7-shRNA til nedregulerer MMP-7-ekspresjon i HGC-sh klon, og /eller anti-VEGF-antistoff til å nøytralisere VEGF i kondisjonert medium fra HGC-sh-klonen. Kapillar dannelse av HUVECs ble inhibert betydelig når de inkuberes i det kondisjonerte medium med lavere MMP-7 og /eller blokkerte VEGF. Disse eksperimentene tyder på at SPARC nedregulering alene ikke er tilstrekkelig for induksjon av neovaskularisering, og andre faktorer må være involvert i denne prosessen.
VEGF spiller en nøkkelrolle i angiogenese, og er nødvendig for overlevelsen av endotelceller [8]. I glioma, SPARC- hemmet tumorvekst ved å forandre dens mikromiljø og undertrykke dens angiogenese ved inhibering av VEGF-ekspresjon og sekresjon [5]. Det kan være en negativ sammenheng mellom SPARC- og VEGF uttrykk, dvs. mer SPARC, jo mindre VEGF eller
vice versa product: [13], [14].
MMP-7 er i stand nedverdigende basalmembran eller bindevev rundt skipene. Det stimulerer også DNA-syntese i dyrkede vaskulære endotelceller, og induserer angiogenese på stedet hvor tykktarmskreftceller ble implantert i en musemodell [15]. VEGF og andre angiogene faktorer virker hovedsakelig gjennom MAPK signalveier, som antas å være viktige overføringsveier som er involvert i prosessene neovaskularisasjon i tumorer [8]. Vår fersk studie viste at MMP-7 uttrykk ble modulert via aktivering av MAPK signalveier [16]. Flere studier har også vist at SPARC- negativt modulerte aktiveringen av MAPK banene [17]. Følgelig kan SPARC uttrykk endre angiogene balanse i svulster ved å nedregulere en serie av neovaskularisering fremme faktorer.
For å undersøke funksjonen av SPARC i reguleringen av magekreft vekst
in vivo
, BGC-SP og HGC-SH cellekloner ble sammenlignet med sine kontroll kloner for deres evne til å danne svulster i en subkutan modell. SPARC- overekspresjon betydelig redusert størrelse av xenopodet tumor med redusert MVD, nedregulering av SPARC- av RNA-interferens fremmet vekst av tumor xenopodet med økt MVD. Derfor, i magekreft xenografter, SPARC uttrykk er negativt korrelert med angiogenese. Tidligere studier indikerte at SPARC- bidrar til reguleringen av tumordannelse, selv om dens rolle syntes å være celletype spesifikk. I hepatocellulære kreftcellelinje xenotransplantater, SPARC- overekspresjon vesentlig forsinket tumordannelse, redusert tumor-størrelse, og redusert MVD i sammenligning med kontroll-xenografter [18]. I tykktarm kreft vev, ble SPARC uttrykk negativt korrelert med VEGF uttrykk og MVD [19]. I medulloblastoma celler, SPARC- overekspresjon inhiberte angiogenese som fører til reduksjon av tumorvekst [11]. I menneskelige mikrovaskulære endotelceller, SPARC hemmet DNA-syntese
in vitro product: [6]. I neuroblastom xenografter, SPARC peptider hemmet angiogenese og tumorvekst
in vivo product: [20]. Disse resultatene bekreftet SPARC- som en hemmer av tumor angiogenese
in vivo
.
SPARC- uttrykker i normale gastriske epitel-celler, magekreftceller, og stromale celler som omgir magekreft på et lavere nivå [21 ]. En immunhistokjemi studie viste at SPARC hovedsakelig uttrykt i stromale celler rundt svulsten [22]. Disse uoverensstemmelsene kan ikke forklares fullt ut. SPARC uttrykk kan avhenge av histologisk type svulst, eller
vice versa
. Siste immunhistokjemi studie fant at SPARC uttrykket er negativt korrelert med uttrykk for VEGF og MVD i mage kreft vev, og SPARC uttrykk gått ned i magekreft med høyere grad av malignitet [23].
I sammendraget, veksthemming av magekreft ved SPARC- synes å være formidlet via dens undertrykkelse virkninger på MMP-7 og VEGF uttrykk, noe som igjen kan hemme microvessel infiltrering inn i tumorer. Vi konkluderer med at nedregulering av SPARC kan assosiere med fremdriften av magekreft, og utforskningen forsøkte å regulere SPARC uttrykk kan bli en meningsfull tilnærming for å forbedre magekreft behandling.
Materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
Antistoffer mot SPARC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), (p-) SAPK /JNK, (p-) ERK1 /2, (p-) p-38, MMP-7 (Cell signalteknologi, Danvers, MA, USA), VEGF, og CD31 (Abcam, Cambridge, MA, USA) ble anvendt for western blotting og immunhistokjemi. Den rhSPARC ble levert av R D (Minneapolis, Minnesota, USA). Revers transkripsjon-PCR kit ble levert av Promega (Madison, WI, USA). MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp Frederick, MD, USA) ble anvendt for nedregulering av MMP-7 i cellekloner. β-kasein (C-6905, Sigma-Aldrich Corporation, Natick, MA, USA) ble anvendt i β-kasein zymografi. Alle andre reagenser var av analytisk kvalitet eller bedre.
Cell Kultur
Menneske mage kreft cellelinjer AGS, MKN-45, NCI-N87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 ble hentet fra Cancer Institute i den kinesiske Academy of Medical Science. Alle celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). BGC-EV (transfektert med tom vektor), BGC-SP (overekspresjon SPARC- cDNA), HGC-EV (uttrykk tom vektor) og HGC-sh (uttrykk SPARC- shRNA) ble dyrket i komplett RPMI 1640 med G418 (50 ug /ml) . Alle cellene ble opprettholdt i monolagkulturer ved 37 ° C i fuktet luft med 5% CO
2.
Etablering av BGC-SP, HGC-sh Clones og HGC-sh-MMP7-sh Clones
ca 150000 BGC-823-celler ble sådd ut pr brønn i en seks-brønns plate i RPMI 1640 med 10% FBS og fikk feste seg over natten. Ekvimolare mengder pcDNA3.1 med full-lengde SPARC cDNA vektor eller tom vektor (Invitrogen, San Diego, CA, USA) ble inkubert med Lipofectamine-2000 Transfeksjon Reagens (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Validert SureSilencing menneskelig SPARC shRNA og tom kontroll vektor ble oppnådd fra SuperArray Biovitenskap Corp (Frederick, MD, USA). HGC-27-celler ble transfektert som tidligere beskrevet [24]. I korthet ble cellene transfektert på en stabil måte ved å bruke lipofektamin. Transfekterte celler ble valgt ut ved hjelp av G418 (100 ug /ml for BGC-SP og HGC-SH kloner) i 14 dager før isolering av individuelle kloner. HGC-sh-MMP7-sh varianter ble etablert som beskrevet ovenfor, ble HGC-sh klone celler transfektert med MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) ved hjelp lipofektamin. Deretter ble transfekterte celler velges ut av puromycin (1 pg /ml) i 10 dager.
Cell Proliferation Assay
celle proliferasjon ble bestemt ved en 3- (4,5-dimetyltiazol-2- yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse som beskrevet tidligere [24]. I korthet ble 500 celler ble dyrket per brønn i 96-brønners plater og inkubert i 8 dager, og deretter, MTT (R & D, Minneapolis, MN, USA) ble tilsatt til cellene. Absorbans verdier ved 550 nm ble målt med en mikroplateleser. Resultatene er vist som midlere absorbans ved 550 nm og midlene (± sd) av kvadruplikate bestemmelser fra seks separate forsøk.
Western blotting-analyse
Totale cellelysater ble fremstilt og analysert ved western blotting som tidligere beskrevet [24]. Kort sagt ble antistoffer mot SPARC-, MMP-7, og VEGF (1:1000 fortynning) anvendes for å detektere SPARC, MMP-7, og VEGF, henholdsvis, mens antistoffer mot (p) SAPK /JNK, (p) ERK1 /2 og (p) p-38 (1:800 fortynning) ble anvendt for å detektere aktivering av MAPK-signalveien.
