Abstract
Nevroblastom (NB) patogenesen har blitt rapportert å være nært forbundet med en rekke genetiske endringer. Men underliggende DNA metylering mønstre har ikke blitt grundig undersøkt i denne utviklings malignitet. Her genererte vi microarray-baserte DNA metylering profiler av primær nevroblastiske svulster. Strenge overvåket differensial metylering analyser mulig for oss å identifisere epigenetiske forandringer karakteristiske for NB svulster samt for kliniske og biologiske undergrupper av NB. Vi observerte at genet spesifikke tap av DNA metylering er mer utbredt enn arrangøren hypermethylation. Bemerkelsesverdig, slik hypometylering påvirket kreftrelaterte biologiske funksjoner og gener som er relevante for NB patogenesen som
CCND1
,
SPRR3
,
BTC
,
EGF Hotell og
FGF6
. Spesielt differensial metylering i
CCND1
påvirket hovedsakelig et evolusjonært konservert funksjonelt relevant 3-utranslaterte område, noe som tyder på at hypometylering utenfor promotorområdene kan spille en rolle i NB patogenesen. Hypermethylation målrettet gener involvert i celle utvikling og spredning som
RASSF1A
,
POU2F2
eller
HOXD3
, blant andre. Resultatene fra denne studien gi nye kandidat epigenetiske biomarkører forbundet med NB samt innsikt i den molekylære patogenesen av denne svulsten, som innebærer en markert gen-spesifikk hypometylering
Citation. Mayol G, Martín-Subero JI , Ríos J, Queiros A, Kulis M, Sunol M, et al. (2012) DNA Hypomety-lering Påvirker kreft-relaterte biologiske funksjoner og Genes Relevante i Nevroblastom patogenesen. PLoS ONE 7 (11): e48401. doi: 10,1371 /journal.pone.0048401
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 7 august 2012; Godkjent: 01.10.2012; Publisert: 07.11.2012
Copyright: © 2012 Mayol et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det spanske helsedepartementet (Instituto de Salud Carlos III, Fondo de INVESTIGACION Sanitaria, 2007; PI070286) og spanske foreningen mot kreft (Asociación Española Contra el Cancer, 2007). G.M. støttes av en bevilgning på Hospital Sant Joan de Deu av Barcelona (Grant BR201102), S.G. av en donasjon fra NEN foreningen og J.I.M-S. studier på Epigenomics er støttet av det spanske departementet for vitenskap og innovasjon (Ryc kontrakt og SAF2009-08663)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Neuroblastom (NB), den mest vanlige ekstrakraniell tumor i barndommen, er en kompleks utviklingsformer kjennetegnes ved en rekke biologisk viktige genetiske endringer som er intimt forbundet med det kliniske resultatet av pasienter [1]. I tillegg til genetiske endringer, komplekse og heterogene klinisk utvikling av NB sterkt avhengig av pasientens alder ved diagnose, samt kliniske stadium og histopatologiske funksjoner av svulsten [1].
Endrede DNA metylering mønstre har vært mye rapportert å være en kritisk faktor i kreftutvikling og progresjon. Spesielt er regional DNA hypermethylation (hyperM) av CpG øyer i promoter regioner av tumorsuppressorgener samt global hypometylering (hypoM) påvirker DNA gjentar anses å være den mest hyppige kreftrelaterte epigenetiske forandringer [2], [3]. Så langt har de fleste studier fokusert sin oppmerksomhet på den rollen og mekanismer for arrangøren hyperM, siden tap av global DNA metylering ble antatt å påvirke DNA gjentakelser og for å være hovedsakelig involvert i strukturell-nukleære funksjoner som kromosom ustabilitet [2].
Selv om genomisk profilen til NB er godt karakterisert, DNA metylering endringer har ikke blitt grundig studert i disse svulstene. Flere gener er blitt rapportert som å være metylert i NB [4] – [9], likevel genom-DNA-metylering bredt mønster av NB er fremdeles i stor grad ukjent. Hensikten med denne studien var å undersøke mønsteret av epigenetiske forandringer i NB på genom-wide nivå ved hjelp av DNA-metylering spesifikke mikromatriser. I tillegg til å identifisere endringer globalt forbundet med NB, karakterisert vi DNA-metylering mønstre forbundet med forskjellige kliniske og biologiske undertyper av sykdommen. Interessant, observerte vi at genet spesifikke tap av DNA metylering er mer utbredt enn arrangøren hyperM. Slike hypoM påvirket kreftrelaterte biologiske funksjoner og gener som er relevante for NB patogenesen som
CCND1 product: [10].
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
totalt 25 primær nevroblastiske tumorer (NT) inkludert 22 NBs, 2 ganglioneuromas (GN) og en ganglioneuroblastoma (GNB) ble brukt for genome wide metylering analyse. I tillegg ble en uavhengig kohort av 13 NBS og 2 GN anvendt for bisulfitt pyrosekvensering, mRNA analyser genekspresjon og DNA-kopi antall variasjoner (tabell 1 og tabell S1A). GN og GNB samt normal menneskelig fosterets hjerne (FB) og binyrene (AG) vev ble brukt som referanseprøver. NB risikovurdering ble definert av International Nevroblastom Staging System (INSS) [11]. Tumorprøver ble vurdert av en patolog (M.S.), svulster bare med 70% levedyktige tumor celleinnhold ble inkludert i studien. DNA ble isolert fra snap-frosne prøver ved hjelp Cell Lysis Solution (Promega, USA) og proteinase K (Sigma, USA) etter produsentens protokoller
Etikk uttalelse. Studien ble godkjent av Institutional Forskning etisk komité (Comité Ético de INVESTIGACION Clínica, Fundación Sant Joan de Deu – CEIC-FSJD). Pasienter /foreldre /foresatte undertegnet et informert samtykke før innsamling av prøver.
Genome-wide DNA metylering profilering
DNA metylering profilering ble utført ved hjelp av infinium HumanMethylation27 BeadChip (Illumina, USA). Genomisk DNA bisulfite konvertering og hybridisering til plattformen ble utført ved Human Genotyping Unit ved den spanske National Cancer Center (CEGEN-CNIO, Madrid, Spania), som tidligere beskrevet. Data ble analysert ved hjelp av BeadStudio programvaren (versjon 3, Illumina Inc, USA) [12], [13]. For hver CpG stedet vi beregnet beta-verdi (βvalue), som er et kvantitativt mål for DNA metylering nivåer som spenner fra 0 til helt unmethylated til 1 for fullstendig denaturert cytosines. Mulige kilder til biologiske og tekniske skjevheter som kan påvirke våre resultater som kjønnsspesifikke og lav kvalitet CPGs ble ekskludert fra studien [14] – [16]. Metylering microarray data er blitt deponert på Gene Expression Omnibus dataregister (GSE39626).
Differensial DNA metylering analyse
Siden det er ingen konsensus strategi for differensial metylering analyse, brukte vi tre ulike tilnærminger. Først ble CpG områder kategorisert som hyperM når βvalues var 0,25 i referanseprøvene og 0,75 i minst 10% av NB prøvene, og hypoM da βvalues var 0,75 i referanseprøvene og mindre enn 0,25 i det minste 10% av prøvene NB. For det andre ble differensial metylering definert som gjennomsnitts βvalues mellom NB og referanseprøver som viser en absolutt forskjell større enn 0,25 [17]. Til slutt ble en uparet t-test utført ved hjelp av Step Down Permutation (SDP) [18] og False Discovery Rate (FDR) analyser [19]. Venn-diagrammer ble brukt for å sammenligne lister med forskjellig metylert CPGs (https://www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgi) og bare de samtidig identifisert av alle tre klassifiseringskriteriene ble definert som ulikt denaturert.
hierarkisk clustering og prinsipal komponent analyse
Unsupervised og overvåket agglomerative hierarkisk clustering ble utført ved hjelp av Cluster Analysis verktøy fra Bead Studio (versjon 3, Illumina Inc, USA). Principal Component Analysis (PCA) ble utført med R (www.r-project.org) ved hjelp av FactoMineR pakken tilgjengelig gjennom Bioconductor.
Bisulfite pyrosekvensering
For å validere DNA metylering data, bisulfit pyrosekvensering ( BPS) analyse ble utført som tidligere beskrevet [20]. Kort, genomisk DNA var bisulfite omregnes EpiTect Plus Bisulfite Conversion Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. En påfølgende PCR-amplifisering ble utført ved anvendelse av biotinylerte primere (tabell S1B). Pyrosekvensering og analyse av data ble utført med pyrosequencer analysator PyroMark Q96 (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner.
genekspresjonsanalyser
For å vurdere uttrykk nivåer av ulikt denaturert gener, offentlig- tilgjengelige uttrykk microarray datasett [21] – [23] med representative NB tumor spektra ble analysert. Rådata ble normalisert til en z-poeng transformasjon. Uparet t-test-analyse justert ved SDP og FDR ble utført. Gener med en statistisk signifikant differensial uttrykk (
p
0,01), z-poeng 1 i 50% av prøvene, ble vurdert forskjellig uttrykt
For kandidatgener, totalt. RNA isolasjon og genekspresjon kvantifisering ble utført i 10 tilfeller er inkludert i metylering matrise og et uavhengig sett av 13 NB prøver ved hjelp av kvantitativ sanntid polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) som tidligere beskrevet [22] (tabell S1B).
bioinformatiske annotering av ulikt denaturert gener
Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID) v6.7 (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) ble brukt for gen-annotering berikelse analyse og biologisk reaksjonsvei kartlegging [24]. Sannsynlighet (Benjamini-Hochberg korreksjon) lavere enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Forskjellig denaturert gener ble klassifisert i henhold til deres kromosomal lokalisering. Sannsynlighetsfordeling analyse ble utført for å bestemme potensialet kromosom berikelse.
P
-verdi. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Arrangøren klassifisering av ulikt denaturert gener i arrangører med høy (HCP), middels (ICP), lav (LCP) og blandet CpG innhold, samt identifisering av Polycomb (PCG) målgener ble utført som tidligere rapportert [14]
hyperometrisk sannsynlighetsfordelingsanalyse med en sannsynlighet cut-off. 0,05, ble utført for å bestemme hyperM eller hypoM kromosom anrikning og til å bestemme arrangøren type og PCG-merket berikelse i forskjellig metylert gener. Analyser ble utført med SPSS versjon 15.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL).
Resultater
DNA metylering profilering og identifisering av differensielt denaturert gener i NB
For å undersøke mønster av DNA metylering i NB, analyserte vi 22 primær NB svulster ved hjelp av infinium HumanMethylation27 BeadChip microarray. To GN, en GNB, samt, normale menneskelige FB og AG vev ble brukt som referanseprøver for å identifisere differensielt denaturert gener som er spesifikke for NB.
Vi utførte utgangspunktet en kvalitetskontroll av data innhentet fra microarray analyse og ekskludert 3337 kjønnsspesifikke og lav kvalitet CPGs. I tillegg ble en NB prøve (NT18, Tabell S1 A) ekskludert på grunn av dårlig registrering
p
-verdier.
Unsupervised Principal Component Analysis (PCA) utføres på alle prøvene inkludert i studien, viste at NBS vise en klart forskjellig DNA-metylering profil sammenlignet med normale referanseprøvene (FB og AG) og klinisk mindre aggressiv GNB og benign GN (figur 1 A), at disse to enhetene epigenetiske undistinguishable fra normale referanseprøver. For å identifisere differensielt denaturert gener i NB, ble overvåket analyser utført ved hjelp av uavhengig tre forskjellige referanseprøver (FB, AG og 2 GN med en GNB). Ved å sammenligne genet lister som genereres av disse analysene vi var i stand til å identifisere et felles sett av 351 gener, blir 23 hyperM og 328 hypoM i NB (figur 1B, tabell S2A). Dette sett av gener blir heretter omtalt som NB-spesifikke gener. Vi utførte en overvåket hierarkisk klynge og en PCA bruker hyperM og hypoM gen setter seg. Bemerkelsesverdig, DNA metylering mønster av hyperM gener tillatt oss å skille NBs med diverse
MYCN
forsterkning status. Interessant, hypoM gener segregert NBs av deres alder ved diagnose, clustering de med 5 eller flere år separat fra yngre pasienter (figur 1C og 1D)
A:. Unsupervised Principal Component Analysis (PCA) av matrise-basert DNA metylering data i 21 neuroblastomer (NB) (klassifisert i henhold til INSS Stage), 2 ganglioneuroma (GN), en ganglioneuroblastoma (GNB); og normale referanseprøver: fosterets hjerne (FB) og binyre (AG). B: Venn-diagram som viser strategien brukes til å identifisere NB-spesifikke gener. Hypermethylated og hypomethylated gener i NB ble bestemt ved hjelp av tre ulike tilsyn analyser med distinkte referanseprøver (FB, AG og GN /GNB). C: Veiledet hierarkisk klyngeanalyse av DNA metylering data fra NB-spesifikke gener i 21 NB prøver, 2 GN, en GNB; og 2 normale referanseprøver: FB og AG. D: Overvåket Principal Component Analysis (PCA) i 21 NB prøver, 2 GN, en GNB; og normale referanseprøver:. FB og AG for NB-spesifikke gener
NB-spesifikke gener ble rangert etter hvor mange prosent av prøvene fant forskjellig metylert og nivået på βvalue endringer. De mest tydelig hyperM gener i vår serie var
EMP1
,
RASSF1A
,
ACTC
,
GNG12
,
HOXD3
,
PAMR1
,
IL17RC
,
CARD11
,
POU2F2 Hotell og
P2RY6 product: (Tabell S2B). Blant disse,
RASSF1A Hotell og
POU2F2
har tidligere blitt beskrevet metylert i NB svulster og cellelinjer. Her, både gener viste tydelig økt metylering nivåer i ≥80% av NB prøvene, som er konsistent med tidligere rapporter [5], [7], [25]. Dessuten, så vidt vi vet bare
HOXD3
har tidligere blitt beskrevet hyperM i kreft, spesielt i prostata kreft [26], [27].
Bruk samme strategi, 69 gener var tydelig hypoM i NB (tabell S2B). Spesielt blant disse vi identifisert
CCND1
. Dette genet har blitt rapportert å være sterkt uttrykt i en betydelig del (mer enn 75%) av NB tumorer og cellelinjer [10], [28]. De 17 CPGs analysert over lengden av
CCND1
locus avdekket en kompleks epigenetisk mønster i NB tilfeller og kontrollprøver (Figur 2A). I NB, observerte vi en reduksjon av DNA metylering nivåer på 12 av 17 CpG sider og en betydelig hypometylering, ved hjelp av strenge kriterier, bare på to CPGs (Target IDer cg04717045 og cg02723533). Uventet, ble DNA metylering tap observert utenfor 5 «regionen
CCND1
, som var unmethylated i NB tilfeller og kontrollprøver. Hypometylering innenfor genet kroppen ble ikke som betydelig på grunn av epigenetisk heterogenitet i referanseprøvene (Figur 2A). Den 3 «ikke-translaterte region (3»-UTR), i motsetning til dette ble konsekvent metylert i referanseprøvene og hypomethylated i at en stor fraksjon av NBS. På de to betydelig hypoM nettsteder, 17 av 21 NB miste metylering i forhold til alle de referanseprøver (βvalue 0,90), er 11 av dem markert hypoM (figur 2A)
A: Grafisk visning av den. DNA metylering nivåer av de 17 CPGs målt over
CCND1
lengde. Heatmap viser data fra 21 neuroblastom (NB) og referanseprøver (2 GN, en GNB, en FB og en AG). Under heatmap viser vi noen genomiske funksjonene i
CCND1
locus (UCSC Genome Browser, data fra hg19 tilpasset hg18) inkludert transkripsjonsfaktor bindingsseter (TFBS), evolusjonære konservert DNaseI overfølsom domene (DNaseI cluster) og Vertebrate Multiz Aligment, PhastCons Conservation (Mammal Conservation) og miRNA målwebområder (TS). B: DNA metylering spesifikke pyrograms for
CCND1
. Den pyrogram ovenfor tilsvarer en neuroblastom prøve, mens den pyrogram nedenfor tilsvarer en referanseprøve (FB). Grey skyggelegging viser prosentandelen av metylering observert for de CPGs analysert. C: Box-plott for DNA metylering data av
CCND1
innhentet av sulfitt pyrosekvensering i en uavhengig kohort av 13 NB og 2 GN prøver og referanseprøver. D: mRNA uttrykk nivåer av
CCND1
analysert ved QRT-PCR i to NB uavhengige kohorter
DNA metylering endringer i klinisk og biologisk relevante NB undergrupper
A. veiledet tilnærming ble brukt til å analysere differensial DNA metylering profiler mellom klinisk og biologisk relevante NB undergrupper.
Høy risiko (HR) NBS (n = 9), definert som stadium 4 og
MYCN
forsterket (
MYCN
A) svulster, ble sammenlignet med lav risiko (LR) NBS (n = 8), som inkluderer stadium 1-3
MYCN
ikke-forsterket (
MYCN
NA) svulster. Totalt 19 tydelig forskjellig metylert gener ble identifisert. Fem gener var hyperM i HR med hensyn til LR NB og referanseprøver, mens ingen hypoM genet ble observert i denne kliniske undergruppen. I kontrast, ble hyperM ikke observert i LR NBs mens 14 gener utstilt
de novo
tap av metylering i dette klinisk gunstig gruppen (tabell S2C).
neste sammenlignet de to klinisk relevante metastatisk NB undergrupper, dvs. trinn 4 (n = 6) og scene 4S (n = 4) NBS. Vi identifiserte totalt 9 ulikt denaturert gener. Av disse 2 gener var hyperM i minst 3 av 4 trinns 4S NBs og ingen hyperM ble oppdaget i stadium 4 NBs. Med hensyn til hypoM, ble 5 og 2 gener observert i scene 4S og 4 NBs, henholdsvis (Tabell S2C).
Sammenligning
MYCN, En (n = 5) og NA (n = 15 ) svulster, identifiserte vi 23 differentially denaturert gener (7 hyperM og 16 hypoM) i
MYCN
forsterket i forhold til ikke-forsterkede svulster og referanseprøver (Tabell S2C).
til slutt, vi sammenlignet NBs basert på pasientens alder ved diagnose ved hjelp av klinisk etablert 18 måneders alder cut-off, dvs. 18 måneder (n = 11) og ≥ 18 måneder (n = 10). Ifølge våre utvalgskriteriene, ikke gjennomgående differensielt denaturert gener ble identifisert, mest sannsynlig på grunn av høy heterogenitet i begge undergrupper. Basert på den overvåkede PCA analysen er vist i figur 1D, observerte vi at pasienter med 5 eller flere år segregert separat fra yngre pasienter, tyder ulike underliggende metylering mønstre. En overvåket analyse ble derfor utført ved hjelp av to alders cut-offs, 18 måneder og 5 år (dvs. 0 til 18 måneder (n = 12), ≥18months til 5 år (n = 4), ≥ 5 år (n = 5)). Det ble ikke observert forskjeller mellom metylering mønstre av tre alders undergrupper. Men metylering var heterogen hos pasienter yngre enn 5 år, men klart atskilt fra de eldre NB pasientene (tabell S2C). Påføring av bare en 5 års alder cut-off ( 5 år, n = 16 og ≥5 år, n = 5), vi identifisert en klar DNA-metylering mønster, karakterisert ved et sett av gener med en konsistent tap av DNA-metylering i pasienter yngre enn 5 år sammenlignet med de eldre pasientene, sistnevnte er lik referanseprøver (tabell S2C).
Teknisk og klinisk validering av kandidatgener ved pyrosekvensering
DNA bisulfite pyrosekvensering av 3 NB-spesifikke kandidatgener (
EMP1
,
GNG12 Hotell og
CCND1
) samt av
EPSTI1
, som er forskjellig metylert i klinisk relevant NB undergrupper, ble utført for å validere DNA metylering array-data. To NB tumorer inkludert i mikromatrise, så vel som en uavhengig kohort av 13 NB og 2 GN prøver ble anvendt for dette formål. Først ble graden av samsvar mellom mikromatriser DNA metylering og BPS data testet og funnet å være signifikant høy (r = 0,958,
p
0,001) (figur S1)
I samsvar med. oppstillings resultater,
EMP1 Hotell og
GNG12
NB-spesifikke gener viste høye metylering nivåer sammenlignet med referanseprøver i alle NB tilfeller av valideringssettet (n = 13) (figur S2B og S2C ).
CCND1
viste en tydelig tap av metylering i 10 av de 13 selvstendige NBS som ble testet, noe som er i samsvar med den andel av hypoM tilfeller identifisert ved metylering array (figur 2A, 2B og 2C, fig S2A).
EPSTI1
metylering analyse i valideringen serien også bekreftet tabelldata (Figur S2D).
Sammenhengen mellom DNA metylering og genuttrykk
For å undersøke om differensial DNA metylering i NB er assosiert med genuttrykk, analyserte vi publiserte genekspresjonsdata av uavhengige og representative NB kreft sett [21] – [23]. Expression data var tilgjengelig for 13 av 23 hyperM og 136 av 328 hypoM NB-spesifikke gener (Tabell S3A). Fem av tretten (38,4%) hyperM gener viste lavere ekspresjonsnivåer i forhold til referanseprøver. I motsetning til dette var 10 av 136 gener (7,3%) med lavere metylering nivåer sterkt uttrykt i NB sammenlignet med referanseprøver. Disse resultatene er i tråd med tidligere studier rapporterer at bare en brøkdel av gener med arrangøren hypometylering viser en betydelig økning i genuttrykk, blir muligens betinget til spesifikk aktivering [29] -. [30]
For å validere hvis differensial DNA metylering i NB er assosiert med genuttrykk endringer, analyserte vi 5 kandidatgener ved QRT-PCR i 23 NBs med tilgjengelige RNA (10 tilfeller inkludert i metylering matrise og et uavhengig sett av 13 NB prøver). Generelt hyperM gener viste lavere ekspresjonsnivåer i NB prøvene sammenlignet med referanseprøver. Likeledes er de fleste hypoM gener viste høyere ekspresjonsnivåer i NB tumorer med hensyn til referanseprøver, som bekrefter mikroarray data (data ikke vist).
CCND1
ble funnet å være sterkt uttrykt i alle NB prøvene, i samsvar med tidligere rapporter [10], [31] (figur 2D).
Biologiske og funksjonelle trekk ved differensielt denaturert gener i NB
Forskjellig denaturert gener ble funksjonelt preget ved hjelp av bioinformatiske metoder. Et gen ontologi (GO) analyse av gener hypoM i NB tillot identifikasjon av betydelig anriket (
p
0,05) fungerer som forsvar respons, immunrespons, immunsystem prosess, respons på stimuli og epidermis utvikling ( Tabell S3b). På grunn av den lille størrelsen på utvalget, gjorde gensettene avledet fra andre sammenligninger ikke resultere i noen vesentlig beriket GO sikt.
De fleste studier hos voksne svulster har rapportert at hyperM gener er beriket med arrangører med høy CpG innhold (HCP) og PRC2 målgener i embryonale stamceller (ESC) [17]. Bemerkelsesverdig, i vår serie, gruppen av hyperM gener viste et tap for HCP arrangører (21,7%
vs.
53,5% i bakgrunnen,
p
= 0,072) og en berikelse for ICP arrangører (34,78%
vs.
11,68% i bakgrunnen,
p
= 0,012). Det ble ikke observert noen signifikant berikelse for PRC2 mål (13%
vs
. 9,6% i bakgrunnen,
p
= 0,49). I kontrast, hypoM gener viste tidligere rapportert mønster [17], det vil si de var assosiert med en økning for lave CpG innhold arrangører (LCP) (68,3%
vs.
22,6% i bakgrunnen,
p
. 0,001) og en nedgang på PRC2 mål (3,3%
vs
9,6% i bakgrunnen,
p
. 0,001) (tabell S3C)
for å finne ut om differensial metylering i NB oppstår homogent i hele genomet, ble kromosom fordelingen av NB-spesifikke gener analysert. Gitt det lave antallet hyperM gener ingen signifikant berikelse eller gruppert tendensen ble observert (tabell S3D). Motsatt vil en betydelig del av hypoM gener kartlagt til kromosom 1 (48 gener), 17 (25 gener), 19 (58 gener) og 21 (9 gener) (
p
0,05 for alle) og viste kromosom bestemt lokalisering. Disse genene kartlagt til spesifikke kromosom regioner 1p36 (20%) og 1q21 (25%), kromosom 17p13 og 17q21 (begge 27%), mens de fleste genene som er identifisert på kromosom 19 var begrenset til 19p13 (mer enn 70%, 43 av 58), og alle kromosom 21 hypoM genene er kartlagt til 21q22 (9/9).
dicussion
i denne studien har vi analysert mønsteret av differensial metylering i primær NB prøver ved hjelp av microarray -basert DNA metylering analyse. Unsupervised PCA viste at DNA-metylering profilene i NB er klart atskilt fra de av klinisk mindre aggressive GNB og godartet GN og de normale referanseprøvene som brukes i denne undersøkelsen (figur 1A). Differensial DNA metylering analyse ved hjelp av strenge kriterier gjort oss i stand til å identifisere DNA metylering endrer karakteristikk av NB svulster. Interessant nok var det mønster av hyperM og hypoM funnet å være assosiert med klinikken-biologisk relevant undergrupper av NB svulster. Nærmere bestemt DNA metylering mønster av hyperM gener tillatt oss å skille NBs med diverse
MYCN
forsterkning status. HypoM gener segregert tilfeller i henhold til alder ved diagnose, clustering de med 5 eller flere år separat fra yngre pasienter (figur 1D). Overvåket DNA metylering analyse som sammenligner kjente NB kliniske undergrupper bekreftet eksistensen av forskjellig denaturert gener mellom svulster høy og lav risiko,
MYCN
A fra NA svulster samt stadium 4 fra scenen 4S NB. Tidligere rapporter analyse bestemte kandidat gener er identifisert hypermethylated gener assosiert med
MYCN
forsterkning status i NB cellelinjer og tumorer [4], således som bekrefter eksistensen av undergruppespesifikke DNA-metylering mønstre i NB. Men ingen konsistent DNA metylering forskjeller ble identifisert ved sammenligning av undergrupper med klinisk etablert prognostisk alder cut-off på 18 måneder. I motsetning til dette, i samsvar med analysen er vist i figur 1D, ble en konsistent tap av DNA-metylering observert hos pasienter som er yngre enn 5 år, sammenlignet med eldre pasienter og referanseprøver (tabell S2C). I NB, alder ved diagnosetidspunktet er en kraftig markør for tumor atferd, og er dermed kritisk i prognostisk vurdering av denne utviklings malignitet [32]. Tradisjonelt har pasientens alder blitt analysert som en binær funksjon, med en cut-off point opprinnelig etablert på 12 måneder, og nylig satt på en mer optimal prognostisk alder cut-off på 18 måneder [32]. Men den internasjonale Nevroblastom patologi Klassifisering (den Shimada system) evaluerer den prognostiske effekten av histologiske trekk ved svulsten vurderer to alders cut-offs på diagnosetidspunktet: 18 måneder og 5 år [33]. Interessant, selv om vi observerte aldersrelaterte DNA metylering mønstre hente frem disse to alders cut-offs, de var mer i samsvar med de 5 årene cut-off.
Totalt observerte vi at tap av DNA metylering er mer utbredt enn promoter hyperM i NB. Dette er i tråd med den kjente globale hypometylering av kreftcelle-DNA, vanligvis antas å påvirke repetitive sekvenser og satellitt-DNA og for å bidra til dannelsen av kromosomal ustabilitet [2]. Derfor genspesifikke hypometylering er ikke blitt grundig studert. Interessant, observerte vi at hypoM påvirket gener som er relevante for NB patogenesen som
CCND1
. Cyclin D1 er en regulator subenhet av cyklin-avhengige kinaser som er nødvendige for cellesyklus G1 /S overgang som har blitt beskrevet sterkt uttrykt i forskjellige typer av faste tumorer, så vel som i mer enn 75% av NBS. Årsaken til
CCND1
overekspresjon i disse svulstene er sterkt ukjent. Høyt nivå presiseringer av
CCND1
er rapportert kun i en liten prosentandel (2%) av NB svulster [10]. Derfor annet enn genamplifisering mekanismer synes å være ansvarlig for økt
CCND1
uttrykk [34]. Nylig,
GATA3
, en transkripsjonsfaktor uttrykt i NB, har blitt rapportert å være innblandet i
CCND1
overekspresjon [35]. I denne studien ble det observert tap av
CCND1
genet metylering i mer enn 70% av NB svulster analysert, forbundet med høye
CCND1
uttrykk nivåer og fravær av genet forsterkning (data ikke vist) . Differensielt denaturert CPGs ikke ble lokalisert i den promoter-regionen, men i den 3 «ikke-translaterte området (figur 2A). Interessant, basert på dataene som er tilgjengelige i UCSC Genome Browser (GRCh37 /hg19), 3»-UTR av
CCND1
er et evolusjonært konserverte DNaseI overfølsom domene høyanriket for mikroRNA målse og transkripsjonsfaktor bindingsseter, inkludert
GATA3
,
MYC
,
FOXA1 /2
og
JUND
, blant andre. Eksperimentelle data som støtter den funksjonelle rollen til 3′-UTR-regionen i uttrykket for
CCND1
har blitt rapportert i mantelen celle lymfomer (MCL), hvor det i tillegg til smelting av
CCND1
gen på kromosom 11 til immunoglobulin-tungkjedeforsterkeren, og tapet av det 3′-UTR vært knyttet til hyper-proliferativ MCL [36]. Men
CCND1
rearrangements som fører til tap av 3′-UTR er observert bare i en svært liten andel av NBs [10]. Verdt å merke seg, i vår serie
CCND1
hypoM skjer i nærvær av
RASSF1A
promoter hyperM. Selektiv epigenetisk stanse av
RASSF1A
er en vanlig hendelse i kreft hos mennesker, inkludert NB der det har blitt rapportert hypermethylated i 75% av svulster [5], [25]. Ras forening domene familie en isoform A er en tumor suppressor som negativt regulerer celleproliferasjon ved å hemme cyclin D1 akkumulering av proteiner gjennom posttranskripsjonelt mekanismer [37].
RASSF1A
hyperM har tidligere blitt omvendt assosiert med cyclin D1 uttrykk og tumor celleproliferasjon [38]. Det er derfor fristende å spekulere i at tap av
CCND1
genet metylering i 3′-UTR regulatoriske regionen og samtidig hypermethylation av
RASSF1A
kunne representere en potensiell underliggende mekanismen
CCND1
gen overekspresjon i NB.
Tap av metylering også påvirket gener med kreftrelaterte biologiske funksjoner, dvs.
SPRR3
, tidligere rapportert som hypomethylated i kreft, spesielt i leverkreft [39]. Overekspresjon av
SPRR3
har blitt rapportert å fremme brystkreft og tykktarmskreft spredning ved å styrke p53 degradering via
AKT Hotell og
MAPK
trasé [40], [41]. HypoM også påvirket gener rapportert å stimulere cellevekst, dvs.
BTC
,
EGF Hotell og
FGF6
. Betacellulin, medlem av EGF familien, har nylig blitt rapportert å indusere spredning av nevrale stamceller og hindre spontan differensiering i cellekultur via både EGF reseptor (
EGFR
) ligger i NSC og
ErbB4
på neuroblasts [42]. Epidermal vekstfaktor virker også via EGFR til å stimulere celleproliferasjon og neoplastisk transformasjon.
