Abstract
Cetuximab, et monoklonalt antistoff som blokkerer epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), er for tiden godkjent for behandling av flere typer av faste tumorer. Vi har tidligere vist at cetuximab kan hemme hypoksi-induserbar faktor-1 alfa (HIF-1α) proteinsyntese ved å hemme aktivering av EGFR nedstrøms signalveier inkludert Erk, Akt, og mTOR. 1, 9-pyrazoloanthrone (1, 9 PA) er en forbindelse anthrapyrazolone best kjent som SP600125 som spesifikt hemmer c-Jun N-terminal kinase (JNK). Her rapporterer vi en, kan ni PA downregulate HIF-1α uavhengig av sin hemming av JNK. Denne nedregulerende effekt ble avskaffet da oksygenavhengig domene (ODD) av HIF-1α (HIF-1α-ΔODD, domenet ansvarlig for HIF-1α nedbrytning) ble eksperimentelt slettet eller når aktiviteten av HIF-1α prolylhydroksylase (PHD) eller 26S proteasomal komplekset ble hemmet, noe som indikerer at en, 9 PA nedregulerer HIF-1α ved å fremme PHD-avhengig HIF-1α degradering. Vi har funnet at kombinasjonen av 1, 9 PA og cetuximab virket synergistisk til å indusere apoptose i kreftceller hvori cetuximab eller 1, 9 PA alene hadde ingen eller bare svak apoptotisk aktivitet. Denne synergistiske virkning ble betydelig redusert hos kreftceller transfektert med HIF-1α-ΔODD, noe som indikerer at nedregulering av HIF-1α var mekanismen av denne synergistisk effekt. Enda viktigere, 1, 9 PA kan nedregulere HIF-1α i kreftceller som er ufølsom for cetuximab-indusert hemming av HIF-1α uttrykk skyldes overekspresjon av onkogene
Ras
(RasG12V). Våre funn tyder på at en, er 9 PA en blyforbindelse av en ny klasse av legemidler som kan anvendes for å forbedre responsen av kreftceller til cetuximab gjennom en komplementær virkning på nedregulering av HIF-1α.
Citation : Lu Y, Li X, Lu H, Fan Z (2010) 1, 9-Pyrazoloanthrones downregulate HIF-1a og bevisstkreftceller til å Cetuximab-mediert Anti-EGFR terapi. PLoS ONE 5 (12): e15823. doi: 10,1371 /journal.pone.0015823
Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge
mottatt: 29 august 2010; Godkjent: 29 november 2010; Publisert: 29.12.2010
Copyright: © 2010 Lu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av en National Institutes of Health award 5R01CA129036 (til ZF) og et tilskudd fra Center for målrettet terapi av The University of Texas MD Anderson Cancer Center (til ZF). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) spiller flere viktige roller i utvikling og progresjon av mange typer solide tumorer [1]. I løpet av de siste to tiårene, har nye kreft terapier rettet mot EGFR blitt utviklet og grundig studert [2], [3]. Nyere kliniske studier har vist en objektiv respons hos pasienter med flere typer kreft behandlet enten ved å blokkere EGFR med monoklonale antistoffer (cetuximab, panitumumab, etc.) eller ved å hemme EGFR tyrosin kinase aktivitet med små-molekyl hemmere (gefitinib, erlotinib, etc. ) [4] – [9]. Disse studiene førte til regulatorisk godkjenning av disse EGFR målretting midler for behandling av kolorektal, lunge og hode og nakke kreft i kombinasjon med konvensjonell kjemoterapi eller strålebehandling; Men til tross for de objektive svar, er den samlede svarprosent på pasienter behandlet med EGFR-målrettet terapi lav, spesielt når disse EGFR målretting midler blir brukt som monoterapier [10] – [12]. Videre mange pasienter med svulster som uttrykker eller sterkt uttrykker EGFR kan ikke ha optimal effekt av behandling med EGFR-målsagenter [3]. For eksempel hos pasienter med tykktarmskreft, bare 20-30% av pasientene hadde sykdom som svarte til EGFR-blokkerende antistoffer [4]. Blant de 70-80% av pasienter med nonresponsive sykdom, 30-35% hadde
K-Ras
mutasjoner, 20% hadde
B-Raf Hotell og
PI3K
mutasjoner, og resten hadde andre aberrasjoner [13]. Derfor, selv om EGFR spiller viktige roller i tumorigenesis, kreft celler er genetisk ustabile, og kan unnvike effekten av EGFR-rettet behandling gjennom flere godt karakterisert og noen ikke-ennå kjente resistensmekanismer. Mye pågående forskning er fokusert på utvikling av nye kombinatoriske terapi rettet mot EGFR og molekyler i EGFR nedstrøms signalveier i et forsøk på å overvinne disse resistensmekanismer.
Vi har tidligere rapportert at cetuximab kan markant nedregulere de høye basale nivåer av hypoksi -inducible faktor-1 alfa (HIF-1α) ved å hemme HIF-1α proteinsyntese i cancercellelinjer som er følsomme for inhibering av EGFR [14], [15]. Vi har vist at inhibering av HIF-1α er nødvendig, selv om det ikke kan være tilstrekkelig, til å formidle responsen av kreftceller til EGFR-målrettet terapi [14] – [17]. Knockdown av HIF-1α av RNA interferens (RNAi) bemerkelsesverdig sensibilisert kreftceller med onkogene
Ras
mutasjoner eller de med
PTEN
inaktivering eller sletting til cetuximab behandling [16]. I motsetning til overekspresjon av HIF-1α i kreftceller som opprinnelig var følsomme for behandling dratt betydelig resistens mot anti-EGFR-terapi [16]. Disse funnene antyder at direkte rettet mot HIF-1α kan gå forbi flere kjente cetuximab-resistensmekanismer, som mutasjons aktivering av onkogener og inaktivering av tumor-suppressor-gener i EGFR nedstrøms trasé og /eller alternativ aktivering av disse nedstrøms banene av andre vekstfaktorreseptorer . Novel kombinasjon tilnærminger til målretting EGFR og HIF-1α kan derfor resultere i en forbedret terapeutisk respons hos pasienter.
Flere strategier for å målrette HIF-1α eller oppstrøms regulatorer eller nedstrøms målgener har blitt testet i de senere år [18]. Tilnærminger til direkte rettet mot HIF-1α funksjon inkluderer inhibering av HIF-1α genekspresjon ved hjelp av antisense-RNA eller forstyrrelser eller inhibering av den transkripsjonelle aktivitet av HIF-1α /β heterodimeren ved å interferere med interaksjonen med DNA eller kofaktorer. Disse tilnærmingene har hovedsakelig vært testet eksperimentelt, gitt at de er vanskelige å teste klinisk med for tiden tilgjengelig teknologi. Alternativt kan den HIF-1α protein være målrettet indirekte ved å regulere sin proteinsyntesen eller stabilitet ved hjelp av farmakologiske strategier som kan testes klinisk [19].
I vårt arbeid med å finne nye små-molekyl blyforbindelser som har anti -HIF-1α aktivitet og som kan bli ytterligere optimalisert for kombinasjon med cetuximab å forbedre terapeutiske effekter på kreftceller, oppdaget vi at 1, 9-pyrazoloanthrone (1, 9 PA), som er en anthrapyrazolone best kjent som SP600125 som spesifikt hemmer c -Jun N-terminal kinase (JNK) [20], [21], kan sterkt nedregulere HIF-1α i flere cancercellelinjer. I denne studien, studerte vi forholdet mellom 1, 9 PA er kjent aktivitet for inhibering av JNK og dets nylig oppdaget aktivitet av downregulating HIF-1α. Vi har også utforsket de biokjemiske mekanismene som 1, 9 PA nedregulerer HIF-1α. Til slutt utførte vi proof-of-bevis eksperimenter for å teste vår hypotese at behandling av kreftceller med en kombinasjon av cetuximab og 1, kan 9 PA øke antitumoraktivitet av og sensibilisere kreftceller for å cetuximab behandling. Våre funn rettferdiggjøre utvikling av nye derivater av 1, 9 PA som kan anvendes i kombinasjon med cetuximab for behandling av kreft ved komplementær nedregulering av HIF-1α uten samtidig inhibering av JNK.
Resultatene
1, nedregulerer 9 PA HIF-1α uavhengig av inhibering av JNK
i denne studien, har vi funnet at i tillegg til inhibering av c-Jun-fosforylering i en doseavhengig måte, 1, 9 PA markert redusert det totale HIF -1α proteinnivået i A431 vulva squamous karcinomaceller så tidlig som 15 minutter etter behandling, mens en, ble 9 PA-induserte inhibering av JNK detektert på et senere tidspunkt (figur 1A). Dette tyder på at en, 9 PAs nedregulerende effekt på HIF-1α er uavhengig av dets hemmende effekt på JNK. Forbindelsen induserte også en forbigående økning i nivåene av aktiverings-spesifikk fosforylering av Akt på både T308 og S473, samt et varig og gradvis økning i nivået av fosforylert Erk i cellene, som er tidsmessig korrelert med utvinning av HIF -1α nivå fra ca 4 timer etter behandling (figur 1A).
(A) Temporal orden og korrelasjon av 1, 9 PA-indusert HIF-1α nedregulering og JNK-inhibering, og behandlingen-indusert aktivering kompenserende av Akt og Erk. A431-celler ble behandlet med 5 uM 1, 9 PA i 0,5% FBS kulturmedium for de angitte tidsintervaller. Cellelysatene ble deretter preparert for Western blotting med antistoffene som er vist. (B) doseavhengige effekter av en, ni PA på downregulating HIF-1α, hemme JNK, og aktivere Erk. A431-celler ble utsatt for økende konsentrasjoner av 1, 9 PA i 16 timer i 0,5% FBS kulturmedium ved 37 ° C. Cellelysatene ble deretter preparert for Western blotting med antistoffene som er vist. (C) Uavhengighet av 1, 9 PA-indusert HIF-1α nedregulering fra sin JNK-hemmende funksjon. A431-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av 1, 9 PA eller 1-metyl-1, 9 PA i 1 time i 0,5% FBS kulturmediet. Cellelysatene ble deretter preparert for Western blotting med antistoffene som er vist. (D) Ingen endringer i HIF-1α nivå etter aktivering eller hemming av JNK. A431-celler Wert transient transfektert med en kontrollvektor, eller en av de konstruksjoner som inneholder et konstitutivt aktiv SEK1 S220E /T224D mutant (SEK1-CA), en dominant-negativ SEK1 K129R mutant (SEK1-DN), eller en dominant-negativ MEKK1 K432M mutant (MEKK1-DN) over natten. Cellelysatene ble deretter preparert for Western blotting med antistoffene som er vist. (E) Kompenserende aktivering av Erk etter HIF-1α stanse i sammenligning med behandling med 1, 9 PA eller 1-metyl-1, 9 PA. A431-celler ble underkastet knockdown av HIF-1α med spesifikk eller kontroll siRNA, eller behandlet med 10 uM 1, 9 PA eller 1-metyl-1, 9 PA i 16 timer. Cellelysatene ble deretter preparert for Western blotting med antistoffene som er vist. (F) nedregulering av HIF-1α med 1, 9 PA i forskjellige kreftcellelinjer. Indikerte cellelinjene ble utsatt for 10 eller 40 uM 1, 9 PA i 1 time i 0,5% FBS kulturmediet. Cellelysater ble deretter utarbeidet for Western blotting med antistoffene vist.
Behandlingen-indusert nedregulering av HIF-1α og kompensatorisk økning i cellesignalisering var også 1, 9 PA doseavhengig (figur 1B) . Den minimale dose på 1, 9 PA er nødvendig for å nedregulere HIF-1α var mellom 1,25 og 2,5 uM, noe som er noe høyere enn den minimale dose som er nødvendig for effektivt å redusere c-Jun-fosforylering ved å hemme JNK (mellom 0,6 og 1,25 uM, figur 1B ), noe som ytterligere antyder at den nyoppdagede nedregulerende effekt på 1, 9 PA på HIF-1α er uavhengig av dets kjente hemmende effekt på JNK.
for å bekrefte denne observasjonen, behandlet vi de samme cellene med 1-metyl -1, 9 PA, en strukturanalog til 1, 9 PA som har vært brukt som en negativ kontroll for 1, 9 PA i litteraturen, fordi det ikke inhiberer JNK. Vi har bekreftet at 1-metyl-1, hadde ni PA ikke redusere c-Jun-fosforylering i A431-celler i forhold til 1, 9 PA; Det var imidlertid like effektive ved downregulating HIF-1α i disse celler (figur 1C). På den annen side, transfeksjon av A431-celler med enten en konstitutivt aktiv SEK1, som aktiverer JNK, eller med dominant-negative SEK1 eller dominant-negativ MEKK1, som begge deaktivere JNK, påvirket ikke nivået av HIF-1α i cellene (figur 1D). Disse ytterligere kontrollforsøk ga sterke bevis på at inhibering av JNK alene hadde ingen effekt på nivået av HIF-1α i cellen modellen undersøkes.
Figur 1E viser at behandling av A431-celler med enten 1, 9 PA eller en -metyl-1, 9 PA, eller knockdown av HIF-1α ekspresjon av RNAi førte til en kompensatorisk økning i nivået av fosforylert Erk i disse cellene, noe som ytterligere støtter den konklusjon at økningen i cellesignalisering etter 1, er 9 PA behandling en kompenserende reaksjon som er sannsynlig relatert til nedregulering av HIF-1α, men ikke til hemming av JNK.
i tillegg til A431 vulva plateepitel karsinom celler, fant vi ut at en kunne 9 PA downregulate HIF-1α i PC3 prostatakreftceller, MDA468 brystkreftceller, MCF7 brystcancerceller transfektert med et høyt nivå av HER2, og H3255 og HCC827 ikke-småcellet lungecancerceller (figur 1F). Til sammen utgjør disse funnene indikerer sterkt at en kan 9 PA nedregulere HIF-1α i humane cancerceller via en mekanisme (r) som er uavhengig av mekanismen (e) ved hvilken det hemmer JNK. Disse funnene tyder også på at celler reagerer på 1, 9 PA eller 1-metyl-1, 9 PA-indusert nedregulering av HIF-1α eller RNAi-mediert HIF-1α stanse gjennom en kompenserende respons på aktivering av cellesignalveier som er kjent for å øke HIF-1α uttrykk [22] -. [26]
1, 9 PA reduserer HIF-1α nivå ved å fremme ubiquitinering av HIF-1α
Vi utforsket mekanismen (e) ved hvilken en, nedregulerer 9 PA HIF-1α. HIF-1α er en meget ustabil proteinet under betingelser normoksisk fordi det har den oksygenavhengig domene (ODD) som er gjenstand for posttranslasjonelle regulering gjennom protein ubiquitinering og degradering [27], [28]. Fordi 1, 9 PA dramatisk redusert HIF-1α nivå på mindre enn 15 min (0,25 h, figur 1 A), en hypotese om at vi 1, 9 PA virker gjennom en mekanisme som forbedrer HIF-1α proteinnedbrytingen. Figur 2A viser at, sammenlignet med bærerkontroll behandling av A431-celler etter blokkade av ny proteinsyntese med sykloheksimid, behandling av cellene med 1, 9 PA vesentlig fremskyndet degradering av HIF-1α; degradering tiden ble forkortet fra 60 min i kontrollcellene til mindre enn 20 min i cellene behandlet med 1, 9 PA. Videre, 1, 9 PA-indusert nedregulering av HIF-1α ble fullstendig blokkert ved behandling av A431-celler med MG132 (figur 2B), som hemmer 26S proteasomal komplekset, noe som indikerer at reduksjonen i HIF-1α etter 1, 9 PA-behandling var mediert ved økning proteindegradering.
(A) Redusert HIF-1α proteinstabilitet i nærvær av 1, 9 PA (1, 9 PA). A431-celler ble behandlet med 10 uM cykloheksimid (CHX) pluss 10 uM 1, 9 PA eller DMSO bærerkontroll i 0,5% FBS kulturmedium i opptil 60 minutter ved 37 ° C. Cellelysatene ble fremstilt etter behandling ved hvert tidspunkt, og analysert ved Western blotting med antistoffene som er vist. (B) Hemming av 1, 9 PA-indusert HIF-1α nedbrytning av proteasomal inhibitor MG132. A431-celler ble behandlet med 10 uM 1, 9 PA ± 10 uM MG132 for de angitte tidsintervaller. Cellelysatene ble fremstilt etter behandling ved hvert tidspunkt, og analysert ved Western blotting med antistoffene er vist.
1, 9 PA markert downregulated HIF-1α henhold til normoksisk betingelser, har vi funnet at evnen til ett , 9 PA for å nedregulere HIF-1α ble merkbart redusert når oksygen ikke var tilgjengelig eller når cellene ble behandlet med deferoksamin (DFO), et jern-chelaterende middel (figur 3A); både O
2 og Fe
2+ er nødvendig for HIF-1α prolylhydroksylase (PHD) aktivitet til Hydroksylering HIF-1α for anerkjennelse av VHL ubiquitin ligase [29], [30]. Resultatet av behandling med DFO var lik den i behandling med MG132: den ubiquitinmolekyler HIF-1α ble inhibert mot nedbrytning gjennom proteasom-reaksjonsveien (figur 3A). Disse funnene tyder på at en kan ni PA direkte eller indirekte påvirke ubiquitinering av HIF-1α [29], [30].
(A) Krav til O
2 og Fe
2+ i 1, 9 PA-indusert nedregulering av HIF-1α. A431-celler var ubehandlet eller behandlet med 10 uM 1, 9 PA i 0,5% FBS kulturmedium under normoksisk betingelser i fravær eller nærvær av DFO (100 uM) eller MG132 (10 uM), og under hypoksiske betingelser i 16 timer ved 37 ° C. Cellelysatene ble deretter preparert for Western blotting med antistoffene som er vist. (B) Rolle av ODD av HIF-1α i 1, 9 PA-indusert nedregulering av HIF-1α. A431-celler ble transient transfektert med HIF-1α-ΔODD konstruere eller en kontrollvektor i 48 timer og ble deretter enten ubehandlet eller behandlet med de angitte konsentrasjoner av 1, 9 PA i 1 time ved 37 ° C. Cellelysatene ble deretter preparert for Western blotting med antistoffene som er vist. (C) Resistance av A431 /HIF-1α-ΔODD celler til 1, 9 PA-indusert nedregulering av HIF-1α. A431-celler som stabilt uttrykker den HIF-1α-ΔODD-konstruksjonen ble behandlet som beskrevet i (A). Cellelysater ble deretter utarbeidet for Western blotting med antistoffene vist.
For ytterligere å teste denne hypotesen, undersøkte vi muligheten for en, ni PA å regulere en HIF-1α mutant der PHD /VHL samspill domene på HIF-1α, dvs. ODD, ble slettet (HIF-1α-ΔODD). Som forventet, mens en redusert 9 PA nivået av villtype HIF-1α, det gjorde ikke påvirke nivået av HIF-1α-ΔODD i A431 celler forbigående transfektert med HIF-1α-ΔODD konstruere (figur 3B). Vi deretter etablert sammenslåtte A431-celler som stabilt uttrykte HIF-1α-ΔODD og ytterligere bekreftet resultatene oppnådd i de paren A431-celler ved behandling av A431-celler som uttrykker HIF-1α-ΔODD på samme måte (figur 3C). Sammen utgjør disse funnene støtter sterkt den konklusjon at en, ni PA nedregulerer HIF-1α gjennom en mekanisme som involverer samspillet mellom PHD /VHL og ODD av HIF-1α. Når de viktigste elementene (O
2, Fe
2 +, og 26S proteasomer) som kreves for PHD aktivitet for å Hydroksylering HIF-1α og for den påfølgende VHL-mediert ubiquitinering og degradering mangler eller hemmet, eller når ODD av HIF-1α, som er rettet mot domenet av VHL ubiquitin ligase kompleks, er fraværende, 1, 9 PA mister sin evne til å nedregulere HIF-1α.
for å oppnå direkte bevis på at en, fremmer 9 PA i ubiquitinering av HIF-1α, vi kastes den HIF-1α immunoutfelt fra lysater av 1, 9 PA-behandlede A431-celler til Western blotting med et anti-ubiquitin-antistoff. Vi har funnet at nivået av polyubiquitinated HIF-1α var tydelig øket i løpet av 10 minutter etter 1, 9 PA behandlingen (figur 4A). Tilstedeværelse av den proteasomal inhibitoren MG132 i løpet av 1, 9 PA behandling inhiberte ubiquitinmolekyler HIF-1α fra å bli degradert (figur 4B).
(A). A431-celler ble behandlet med 10 uM 1, 9 PA for angitte tidsperiode. Cellelysater ble fremstilt for HIF-1α immunoutfelling, etterfulgt av Western blotting av immunopresipitatene med antistoffer rettet mot ubiquitin (øverst), HIF-1α, og β-aktin. (B) A431-celler var ubehandlet eller behandlet med 10 uM 1, 9 PA i nærvær av 10 uM MG132 i 1 time i 0,5% FBS medium. HIF-1α ble immunopresipitert etterfulgt av Western blot-analyse med et anti-HIF-1α antistoff.
Til sammen våre data gir sterke bevis for at 1, 9 PA minker HIF-1α gjennom en mekanisme som forbedrer samspillet mellom ODD av HIF-1α og PHD /VHL /ubiquitinering komplekse, og dermed fører til en forbedret nedbrytning av HIF-1α gjennom proteasome veien.
1, synergizes 9 PA med cetuximab å indusere apoptose gjennom co-downregulating HIF-1α
Vi viste tidligere at cetuximab nedregulerer HIF-1α i kreftceller er følsomme for anti-EGFR terapi gjennom hemming av HIF-1α proteinsyntese, som ble forhindret av uttrykk for en Myristoylated Akt som er konstitutivt aktiv [16]. Figur 5A viser våre nåværende funn, som er lik de vi tidligere har rapportert; Interessant, i motsetning til våre tidligere funn, uttrykk for den konstitutivt aktive Akt ikke påvirker 1, 9 PA-indusert nedregulering av HIF-1α (figur 5B), som impliserer at rollen til 1, 9 PA-induserte økning av Akt-aktivitet (se figur 1A) var ikke til å motvirke 1, 9 PA-indusert HIF-1α proteindegradering, men snarere for å kompensere for 1, 9 PA-indusert HIF-1α proteinnedbrytning ved å stimulere ny HIF-1α proteinsyntese.
A431 cellene ble transient transfektert med en kontrollvektor eller en Myristoylated Akt (Myr-Akt) i 24 timer i 0,5% FBS medium. Den vektor- eller Myr-Akt-transfekterte celler ble deretter behandlet med enten 20 nM cetuximab, eller PBS over natten (A), eller med 10 uM 1, 9 PA eller DMSO bærerkontroll i 1 time og (B). Etter behandling ble cellelysater fremstilt for Western blotting med antistoffene er vist.
således en hypotese om at kombinasjonen av 1, 9 PA og cetuximab, som kan hemme den Akt og ERK-reaksjonsveier og derved blokkere kompenserende mekanismer, ville ha en additiv eller synergistisk effekt på nedregulering av HIF-1α. Vi testet denne hypotesen i 3 kreftcellelinjer som er følsomme for cetuximab behandling: A431, HN5 (hode og nakke kreft), og Difi (kolorektal kreft). Fordi Difi cellene er ekstremt følsomme for cetuximab ble de behandlet med 2 nM cetuximab; A431 og HN5 celler, som ikke er så følsomme for cetuximab som Difi celler, ble behandlet med 10 nM cetuximab. Figur 6A viser at når en hvilken som helst av de 3 cellelinjer ble behandlet med enten 10 eller 40 uM 1, 9 PA eller cetuximab alene, ble HIF-1α nedregulert. Når cellene ble behandlet med både 1, 9 PA og cetuximab, ble HIF-1α ytterligere nedregulert. Behandling av cellene med cetuximab eller 1, 9 PA alene induserte bare minimal eller ingen spaltning av PARP, er en markør for apoptose; Men kombinasjonen av cetuximab og 1, 9 PA markert forbedret induksjon av PARP spalting i alle 3 cellelinjer.
(A) induksjon av PARP spalting ved kombinasjonen av 1, 9 PA og cetuximab. A431, HN5, og Difi celler var ubehandlet eller behandlet med cetuximab (10 nM for A431 og HN5 celler og 2 nM for Difi celler i 16 t), 1, 9 PA (10 uM eller 40 uM tilsatt den siste time før cellelysering) eller begge, i 0,5% FBS kulturmediet. Cellelysater ble fremstilt og analysert ved Western blotting med antistoffene som er vist. (B) Økt induksjon av apoptose ved kombinasjonen av 1, 9 PA og cetuximab. A431-celler ble behandlet som beskrevet i (A). Cellelysater ble fremstilt og analysert ved ELISA apoptose. De relative absorbans-verdier plottes.
p
verdien var mindre enn 0,01 når man sammenligner nivået av apoptose med 1, 9 PA alene (10 eller 40 mm) eller cetuximab alene med at av apoptose ved kombinasjon av de 2 agenter (Merk: Bare
p
verdiene sammenligner 10 uM 1, 9 PA alene og i kombinasjon med cetuximab er vist). (C) Avhengighet av induksjon av apoptose ved kombinasjonen av 1, 9 PA og cetuximab på HIF-1α nedregulering. A431neo og A431 /HIF-1α-ΔODD celler ble behandlet som angitt, og cellelysatene ble fremstilt og analysert som beskrevet i (A).
Vi valgte A431-celler for ytterligere å bekrefte dette resultatet ved hjelp en uavhengig apoptose ELISA som kvantitativt måler nivået av histon-assosiert DNA-fragmentering i cytoplasma etter apoptose (figur 6B). 1, 9 PA alene ved konsentrasjoner på 10 og 40 uM ikke merkbart øker nivået av apoptose; cetuximab alene kun moderat økt nivå av histon-assosiert DNA-fragmentering i cytoplasma. Men vi fant at kombinasjonsbehandlingen betydelig økt nivå av apoptose (
p
0,01). For ytterligere å bekrefte hvorvidt induksjon av apoptose sett med kombinasjonen behandlingen ble mediert av de komplementære virkninger på nedregulering av HIF-1α av disse 2 midler, vi gjentok forsøk i A431-celler som uttrykker HIF-1α-ΔODD celler. Figur 6C viser at, sammenlignet med dets virkning i kontroll vektor-transfiserte celler A431neo, kombinasjonsbehandling hadde en markert lavere effekt på PARP-spaltning i A431 /HIF-1α-ΔODD celler. Effekten av 1, 9 PA på nedregulering av endogene HIF-1α ble også redusert i A431 /HIF-1α-ΔODD-celler sammenlignet med A431neo celler. Disse data indikerer at nedregulering av HIF-1α var mekanismen for den synergistisk effekt av kombinasjonen av 1, 9 PA og cetuximab.
1, overvinner 9 PA onkogen Ras-indusert cetuximab motstand
onkogen mutasjon av
Ras
har vist seg å være en viktig mekanisme for cetuximab motstand hos pasienter med kolorektal kreft [10]. Vi har tidligere vist som et bevis på konseptet at knockdown av HIF-1α gjennom RNAi vesentlig gjenoppretter følsomheten av A431 celler transfektert med en onkogen
H-Ras plakater (G12V) mutant til cetuximab behandling [16]. For ytterligere å bevise denne romanen konseptet, undersøkte vi effekten av en, ni PA alene og i kombinasjon med cetuximab i A431 celler transfektert med
Ras-G12V plakater (A431 /RasG12V). Figur 7A viser at, sammenlignet med kontroll vektor-transfiserte A431neo celler, A431 /RasG12V celler hadde en høyere basalnivå av Akt-fosforylering og var resistente overfor cetuximab-indusert inhibering av Akt fosforylering, nedregulering av HIF-1α, og spalting av PARP. I tillegg, 1, 9 PA alene inhiberte både basal og Ras-indusert oppregulering av Akt-fosforylering og downregulated HIF-1α i både A431neo og A431 /RasG12V celler, men det hadde ingen påvisbar effekt på induksjonen av PARP spaltning enten i cellelinjen . Kombinasjonen av 1, 9 PA og cetuximab, men markant økt spaltning av PARP i begge A431neo og A431 /RasG12V celler. Spaltingen av PARP i A431 /RasG12V celler er spesielt viktig, fordi cetuximab alene var ikke i stand til å indusere PARP-spaltning i disse celler på grunn av ekspresjon av onkogene
Ras
; mens kombinasjonsbehandling i A431 /RasG12V celler resulterte i et nivå på PARP-spaltning som var lik nivået av PARP spalting i A431neo-celler, noe som indikerer en synergisme mellom 1, 9 PA og cetuximab til å indusere apoptose i cetuximab-resistente kreftceller.
(A) Virkning av 1, 9 PA og cetuximab, enten alene eller i kombinasjon, på den HIF-1α nivå og induksjon av apoptose. A431neo og A431 /RasG12V celler var ubehandlet eller behandlet med cetuximab (10 nM i 16 timer), 10 uM 1, 9 PA (tilsatt den siste time før cellelysering), eller begge i 0,5% FBS kulturmediet. Cellelysater ble fremstilt og analysert ved Western blotting med antistoffene som er vist. (B) 1, 9 PA-mediert allergi til cetuximab-indusert veksthemming. A431neo og A431 /RasG12V-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av cetuximab ± 5 uM 1, 9 PA i 0,5% FBS kulturmedium i 5 dager. Etter behandling ble cellene underkastet et MTT-assay. De optiske tetthetsverdiene for de behandlede grupper ble normalisert til verdiene for kontrollgruppene (med eller uten 1, 9 PA behandling) og uttrykt som en prosent av respektiv kontroll. Prosentandelen av overlevende celler ble plottet som en funksjon av behandling med økende konsentrasjoner av cetuximab. Forskjellene i celleoverlevelse mellom de to gruppene var statistisk signifikant (
p
0,01) når konsentrasjonene av cetuximab var større enn 0,625 nM i A431neo celler og 1,25 nM i A431 /RasG12V celler. (C) 1, 9 PA-mediert allergi til cetuximab-indusert inhibering av VEGF-produksjon. A431neo og A431 /RasG12V celler var ubehandlet eller behandlet med 10 nM cetuximab, 10 uM 1, 9 PA, eller begge deler i 0,5% FBS kulturmedium i 16 timer. VEGF utskilt i det kondisjonerte medium av cellene ble målt ved hjelp av ELISA.
p
-verdier for angitte sammenligninger ble vist. (D) Sammenligning av A431 og GEO-celler til behandling med 1, 9 PA og cetuximab, enten alene eller i kombinasjon. A431 og GEO-celler ble behandlet som beskrevet i (A). Cellelysater ble fremstilt og analysert ved Western blotting med antistoffene som er vist. (E). 1, 9 PA-mediert allergi GEO-celler til cetuximab-indusert veksthemming. GEO-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av cetuximab ± 5 uM 1, 9 PA i 0,5% FBS kulturmedium i 5 dager. Etter behandling ble cellene underkastet et MTT-assay. Dataene ble prosessert som beskrevet i (B). Forskjellene i celle overlevelse mellom de to gruppene var statistisk signifikant (
p
0,01). Ved alle konsentrasjoner av cetuximab testet
For å få ytterligere bevis på cellenivå for å støtte den pro-apoptotiske virkning av kombinasjonsbehandlingen, utførte vi en konvensjonell cellevekst og overlevelse analyse som sammenligner virkningen cetuximab doseavhengig med og uten 1, 9 PA i A431neo og A431 /RasG12V celler. Vi fant ut at 1, 9 PA sensibilisert både A431neo og A431 /RasG12V celler til cetuximab (figur 7B). Tillegg av 1, 9 PA til cetuximab skiftet IC
50 av cetuximab 3-10 nM til mindre enn 1 nM i A431neo celler, og enda viktigere, det oppnås en IC
50 av 3 nM for cetuximab i A431 /RasG12V celler; i motsetning til dette IC
50 av cetuximab alene ble ikke oppnådd (figur 7B), selv ved konsentrasjoner større enn 10 nM (data ikke vist).
Vi har funnet at behandling av celler med A431neo 1, 9 PA alene ikke vesentlig hemmer VEGF produksjon i forhold til behandling av disse cellene med cetuximab alene; tilsetning av 1, fikk 9 PA ikke lenger å senke nivået av VEGF-produksjon ble hemmet av cetuximab (figur 7C). Interessant, men når A431-celler ble resistens mot cetuximab-indusert inhibering av VEGF-produksjon på grunn av ekspresjon av det onkogene RasG12V, tilsetning av 1, 9 PA betydelig senket nivået av VEGF-produksjon (
p
0,01 ).
til slutt, for å finne ut om en kan ni PA også bevisstgjøre kreftceller med naturlig forekommende
Ras
mutasjoner, undersøkte vi effekten av kombinasjonen av 1, 9 PA og cetuximab på GEO kolorektal kreft celler, som er kjent for å ha mutert
Ras product: [31]. Imidlertid, til tross bærer et mutert
Ras
på exon 2, GEO-celler reagerte på 1, 9 PA og cetuximab på en lignende måte som A431-celler gjorde. 1, 9 PA ført til en kompensatorisk økning i nivået av fosforylert Erk etter behandling over natten (16 timer) i begge A431 og GEO-celler, som ble redusert i nærvær av cetuximab. Kombinasjonen av disse 2 agenter forbedret PARP spalting i begge typer celler (figur 7D) og sensibiliserte GEO celler til cetuximab-indusert hemming av cellevekst og overlevelse (figur 7E).
I sammendraget, våre funn tyder på at 1, kan ni PA sensitivkreftceller til cetuximab-mediert anti-EGFR terapi ved downregulating HIF-1α og kan forbedre cellulær respons på cetuximab behandling i kreftceller som bærer onkogene
Ras
mutasjoner.
Diskusjoner
Her rapporterer vi 2 viktige funn, som, så vidt vi vet, har ikke tidligere vært rapportert.
