Abstract
Bakgrunn
Aktivering av Wnt signalveien er innblandet i avvikende celleformering i ulike kreftformer. I 40% av endometrioid ovariekreft, konstitutiv aktivering av veien er på grunn av onkogene mutasjoner i β-catenin eller andre inaktiverende mutasjoner i nøkkel negative regulatorer. Utskilt frizzled relaterte protein 4 (SFRP4) har blitt foreslått å ha hemmende aktivitet gjennom forpliktende og avsette Wnt ligander.
Metodikk /hovedfunnene
Vi utførte RT-qPCR og Vest-blotting i grunnskolen kulturer og eggstokkene cellelinjer for SFRP4 og nøkkel nedstrøms regulatorer aktivert β-catenin, β-catenin og GSK3p. SFRP4 ble deretter undersøkt ved hjelp av immunhistokjemi i en kohort av 721 pasienter, og på grunn av den foreslåtte sekretorisk funksjon, i plasma, som representerer det første ELISA for SFRP4. SFRP4 ble de sterkt uttrykt i eggleder epitel og redusert med malign transformasjon, både RNA og på proteinnivå, hvor det var enda mer uttalt i membranfraksjonen (p 0,0001). SFRP4 ble uttrykt på proteinnivå i alle histotypes av eggstokkreft, men ble redusert fra borderline tumorer til kreft og med tap av celledifferensiering. Tap av ekspresjon membran var en uavhengig prediktor for dårlig overlevelse in ovarian kreftpasienter. (P = 0,02 ujustert; p = 0,089 justert), som øker risikoen for at en pasient for å dø av sykdommen med faktoren 1,8
konklusjoner /Betydning
Våre resultater støtter en rolle for
SFRP4
som en tumor suppressor genet i eggstokkreft
via
hemming av Wnt signalveien. Dette har ikke bare prediktive konsekvenser, men kan også legge til rette for en terapeutisk rolle ved hjelp av epigenetiske mål
Citation. Jacob F, Ukegjini K, Nixdorf S, Ford CE, Olivier J, Caduff R, et al. (2012) Tap av utskilt frizzled relaterte Protein 4 korrelerer med en aggressiv Phenotype og Spår dårlig resultat i eggstokkreft pasienter. PLoS ONE 7 (2): e31885. doi: 10,1371 /journal.pone.0031885
Redaktør: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Research Centre, Saudi-Arabia
mottatt: 15 august 2011; Godkjent: 14 januar 2012; Publisert: 21 februar 2012
Copyright: © 2012 Jacob et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Kreft League Canton Zurich (til VHS); Oncosuisse (02115-08-2007 til V.H.S.); Swiss National Foundation (320000-12543 til V.H.S .; PBZHP3-133289 til F. J.); European Science Foundation (til V.H.S.); Cancer Institute of New South Wales (09 /CRF /2-02 til V.H.S.); Royal Australian og New Zealand College of Fødselsleger og Gynekologer (til V.H.S.); William Maxwell Trust (til V.H.S.) og Royal Hospital for Women Foundation (til V.H.S.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) er den femte vanligste årsaken til død av alle krefttilfeller oppstår i kvinner og den ledende dødsårsaken fra gynekologiske kreftformer. Over 75% av kvinner tilstede med lokalavansert eller disseminert sykdom, vanligvis preget av en gradvis invasjon av omkringliggende organer, og i høye scene tilfeller av bukhulen. Survival har endret seg lite siden tidlig på 1980-tallet til tross for nye chemotherapeutical narkotika. Overlevelsesraten for tre fjerdedeler av pasienter med utbredt metastatisk sykdom er bare rundt 20% [1].
Denne dårlige samlede prognose resultater fra en mangel på tidlige symptomer og tidlig diagnose, ineffektiv behandling ved avansert sykdom, motstand mot platinabaserte chemotherapies og fra begrenset forståelse av de tidlige-initiere hendelser og tidlige stadier av eggstokkreft utvikling. En stor utfordring forblir identifisering av onkogene eggstokkreft veier for å hjelpe til diagnose, som prognostiske indikatorer, og som mål for nye terapeutiske muligheter [2]. Mange grupper, inkludert vår egen, har benyttet arraybaserte genom-wide funn plattformer for å identifisere avvikende mRNA uttrykk og somatisk ervervet DNA sekvensvarianter eller mutasjoner å bestemme de molekylære endringer som ligger bak utvikling av eggstokkreft, som et første skritt for å identifisere molekylære markører med potensiell klinisk nytte [3], [4].
ved hjelp av denne teknologien, medlemmer av Wnt signalveien har vært innblandet i eggstokkene karsinogenese, som har potensial for diagnostiske, prognostiske og terapeutiske mål [5], [6]. Wnt signalveien er sterkt konservert i hele dyr og medierer en rekke forskjellige cellulære funksjoner inkludert cellen polaritet, vevet mønster, kontroll av cellulær proliferasjon og utvikling av neoplasi [7], [8]. Wnt proteiner utskilles, cystein-rike signalmolekyler med konserverte strukturer. Nitten Wnt proteiner har blitt identifisert og knyttet til ulike stadier av menneskelig utvikling og kreftutvikling, inkludert kreft i bryst, lunge, tykktarm, eggstokker og huden [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Wnt proteiner signal
via
frizzled reseptorer gjennom en rekke forskjellige, men sammenkoblet signalveier, inkludert Wnt /Ca
2 +, β-catenin og planar-celle polaritet trasé [15], [16] , [17]. Generelt er det Wnt familien klassifisert på grunnlag av ligand og reseptor involvert i den kanoniske /β-catenin veien og den β-catenin uavhengig /ikke-kanonisk pathway. Interessant, ikke-kanoniske Wnt signal kan motvirke kanoniske Wnt signalering, og kan representere en ny vei for å målrette kreft drevet av kanonisk Wnt signalering [18]. Nedstrøms målgener av Wnt /β-catenin /TCF signalveien har blitt identifisert til å være avgjørende for eggstokkreft epitelial celle transformasjon, og ble oppregulert i alle endometrioid eggstokkreft med Wnt pathway defekter [19], [20]. Flere andre studier støtter denne observasjonen, rapportering overekspresjon av cyclin D1 i eggstokkreft bærer β-catenin mutasjoner [21], [22], [23], [24].
Utskilte frizzled relaterte proteiner (SFRPs) er ekstracellulære hemmere av wnt signal som virker ved å binde seg direkte til wnt ligander [25] eller frizzled reseptorer [26]. Frizzled reseptorer finnes eksklusivt på plasmamembranen, som ligger ved overflaten av Wnt-responsive celler. De siste årene har en rekke rapporter beskrevet epigenetisk stanse av disse kanoniske Wnt signal antagonister i ulike kreft hos mennesker, noe som tyder på at de kan fungere som tumor suppressors [27]. I eggstokkreft,
SFRP1
var den første familiemedlem rapportert å være hypermethylated og brakt til taushet i eggstokkreft cellelinjer og pasientprøver, men ikke i normale kontroller, noe som tyder på en potensiell rolle som en tumor suppressor [28]. Arrangøren hypermethylation av
SFRP2 Hotell og
SFRP5
senere ble også funnet i eggstokkreft [29]. En fersk studie rapporterte tap av
SFRP5
uttrykk for å være assosiert med både progresjon av eggstokkreft kreftutvikling og kjemoterapi motstand [29].
Som vi tidligere hadde identifisert
SFRP4
å være avvikende uttrykt på RNA-nivå i et stort transcriptional profilering eksperiment av ovarialcancer pasienter (upubliserte data), her undersøker vi for første gang SFRP4 RNA og protein ekspresjon i 725 pasienter ved bruk av revers transkripsjon kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR), Vest- -blot, immunhistokjemi (IHC) og fangst enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) i primærkulturer, eggstokkcellelinjer, ascites, vev og plasma.
Metoder
Clinicopathological pasient kohort
Etisk godkjenning og skriftlig informert samtykke ble gitt på tre forskjellige steder i Sveits, Tyskland og Australia: 1. Avdeling for gynekologi, Universitetssykehuset Zurich og Institutt for gynekologi og obstetrikk, Spital Limmattal, Zürich (SPUK, StV06 /2006, VHS); 2. Avdeling for gynekologi og obstetrikk, Universitetet i Schleswig-Holstein (Ethics Committee ved Universitetet i Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, til D.H.); og 3. Gynekologisk Cancer Centre, Royal Hospital for Women, Sydney (HREC 08/09/17 /3,02, til V.H.S.). Arkiv vev fra 721 pasienter i den sveitsiske Cohort med normale, godartede og eggstokkene /tubal /peritoneal eller livmorkreft ble inkludert i microarray (281 godartede diagnoser, 440 kreftformer), med de fleste kreftformer som er av eggstokkreft opprinnelse (69,8%; Table 1). Haematoxylin Eosin (H E) farget deler av hver prøve fra både sveitsiske og australske Kohorter ble anmeldt av en patolog som spesialiserer seg på gynekologisk patologi (R.C. for Swiss Cohort; J.S. for australske Cohort) og områder som tilsvarer svulst /godartet vev merket. Tissue kjerne biopsi av 1,0 eller 2,0 mm ble innlemmet i medium-density microarray (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA). Hver pasient ble representert ved to kjerner samplet fra forskjellige områder av tumoren. Seksjoner fra hver gruppe var H E farget for å bekrefte inkludering av den valgte vev i hver kjerne, og pasienter med uklare eller blandede histologier utelukket. Alle clinicopathological pasientdata som FIGO stadium, klasse, restsykdom, tilstedeværelsen av ascites, fortid og nåtid medisinsk sykdom, ultralydfunn og resultatdata ble lagret i en spesialdesignet in-house database (PEROHU) basert på Microsoft Access (ikke utgitt; Microsoft , Seattle, USA). Pasienter med en tidligere historie med kreft eller inflammatoriske /autoimmune sykdommer ble ekskludert fra denne studien.
Vår plasma kohorten ble forlenget med 52 pasienter (tysk gruppe) for å lette en større endometriose pasientgruppen. Blodprøver ble samlet i EDTA blod rør (BD Vacutainer®, BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA) før operasjonen og lagret på is inntil videre behandling. Prøvene ble behandlet innen tre timer etter sentrifugering av 3’000 g for 10 min ved 4 ° C og plasma oppbevares ved -80 ° C.
Cell kultur
Cell linje SKOV3 (serøs eggstokkreft ) ble dyrket i RPMI 1640 medium som inneholdt penicillin /streptomycin (Pen /Strep), 10% føtalt kalveserum (FCS) og L-glutamin (L-Glut). TOV112D (endometrioid eggstokkreft) og TOV21G (klarcellet eggstokkreft) ble dyrket i DMEM + Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut. Normale menneskelige eggstokkene overflaten epitelceller (HOSE6-3) ble dyrket i Medium 199 /MCDB 105 (1:02) som inneholder Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut. Alle kreftcellelinjer ble avledet fra ATCC (www.atcc.org), HOSE6-3 var en gave fra Garvan Institute of Medical Research, Sydney, Australia.
primærkulturer
Primære kulturer ble samlet under en operasjon eller flere ganger i løpet av paracentesis nødvendig for kjemoresistent progressiv sykdom (Australian Cohort). Eggstokkreft kulturer avledet under paracentesis ble tatt fra cellen pellet generert etter sentrifugering av ascites ved 4 ° C med 3’000 g. Tubene celler for kultur ble samlet opp ved hjelp av en cytobrush ved fimbrial ende av røret umiddelbart etter profylaktisk bilateral salpingo-ooforektomi. De to tubal cellelinjer som brukes i denne publikasjonen ble hentet fra to pasienter som gjennomgår risikoreduserende kirurgi for
BRCA1
mutasjonsstatus (Tube 1) og sterk familie historie av eggstokkreft /brystkreft (Tube 2), hvor skriftlig informert etisk samtykke ble gitt (HREC 08/09/17 /3,02, til VHS). Etter samlingen, ble kulturene umiddelbart lagret i DMEM og overføres til laboratoriet for dyrking. Primære kulturer ble enten dyrket i DMEM + Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut (eggstokkkreft cellelinjer) eller Medium 199 /MCDB 105 (1:02) som inneholder Pen /Strep + 10% FCS + L-Glut (normal tubal cellelinjer) inntil sammenflytende. Den andre passasjen av hver kultur ble anvendt for eksperimentene.
RT-qPCR
RT-qPCR ble utført i henhold til retningslinjene MIQE Celler ble dyrket i 6-brønners plater (NUNC, Thermo Fisher Scientific , Roskilde, Danmark) til en confluency på 60%, vasket med 1 x DPBS (Gibco, Invitrogen Australia Pty Ltd, Mulgrave) og total RNA ekstrahert (NucleoSpin RNAII kit, Macherey Nagel, Duren, Tyskland). RNA-konsentrasjonen ble målt ved bruk av Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Danmark), integriteten bekreftet ved agarosegelelektroforese (1,7% agarose-gel) og et forhold mellom optisk tetthet på 260/230 nm≈2.1 (2,0 til 2.2) og 260 /280≈2.0 (01.08 til 02.02) valgt som inklusjonskriterier. QPCR ble utført på tre referanse gener, så vel som målgenet,
SFRP4
anvendelse av 500 ng revers transkribert RNA i et totalvolum på 20 ul (iScript Reverse Transcription Supermix, Bio-Rad Laboratories Pty Ltd, Gladesville, Australia ). Primere for referanse gener ble valgt på grunn av deres stabile uttrykk: TATA-boks-bindende protein [30] fremover 5′-TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3 «og 5′-revers CACATCACAGCTCCCCACCA-3′; beta-glukuronidase [31] fremover 5»-AGCCAGTTCCTCATCAATGG-3 «og 5′-revers GGTAGTGGCTGGTACGGAAA-3′; suksinat-dehydrogenase-komplekset, subenhet A [32] fremover 5»-TGGGAACAAGAGGGCATCTG-3 «og 5′-revers CCACCACTGCATCAAATTCATG-3»; og
SFRP4
frem 5′-ACACCCTCTTAAGCAGCACCAG-3 «og omvendt 5′-AGGGTGGATGTCCTGGGAAGTAAG-3» [33] (Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, Australia). QPCR utført på Stratagene Mx3005® (Integrated Sciences Pty Ltd, Sydney, Australia) ved hjelp av 96-brønners mikrotiterplater (Bio-Rad Laboratories (Pacific) Pty Ltd, Gladesville, Australia) og SensiFAST ™ SYBR lo-ROX Kit (Bioline ( Aust) Pty Ltd, Alexandria, Australia) med lav ROX som fluorescens referansen fargestoff. Optimale reaksjonsbetingelser ble oppnådd etter 2 x SensiFAST ™ SYBR blanding, 400 nM primer spesifikk forstand, 400 nM spesifikk antisense-primer, RNase /DNase-fri vann og 25 ng cDNA som templat opp til et sluttvolum på 20 ul. Amplifikasjoner ble utført som starter med 30 sek enzymaktivering ved 95 ° C etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 5 sek og gløding /forlengelse ved 60 ° C i 30 sek. En smeltekurve ble deretter fremstilt ved 65-95 ° C. Alle prøver og negative kontroller ble amplifisert i triplikat og gjennomsnittet av basislinjekorrigert normaliserte fluorescens-signaler (DRN) oppnådd for videre beregninger. Kvantifisering syklus (CQ) verdier av våre referanse gener ble kombinert i et geometrisk gjennomsnitt for hver prøve [32] og trekkes fra
SFRP4
uttrykk: ΔCq = Cq
SFRP4
-Cq
Ref. Å relativt kvantifisere
SFRP4
uttrykk (R) i alle undersøkte cellelinjer, ble HOSE6-3 valgt som vår kontroll, og uttrykk for andre linjer ble beregnet som et forholdstall i forhold til HOSE6-3 som følger: R = 2
-. [ΔCqSFRP4- ΔCqHOSE6-3]
Western-blot analyse
Ascites ble samlet inn under paracentesis fra to kreftpasienter på eggstokkene ved to påfølgende tidspunkter, tre måneder fra hverandre. Tubulin ble anvendt som en kontroll for lasting cellelinjer og anti-beta-2-mikroglobulin for pasienten ascites proteinekstrakter. Porsjoner på 30 mikrogram ble kombinert med NuPAGE® LDS prøve og redusere buffere (Invitrogen Australia Pty Ltd, Mulgrave) og kokt før du legger inn natrium (SDS) -polyacrylamide geler. Alle geler ble elektrisk overført til PVDF-membraner før blir blokkert i 1 time ved RT i 0,01% TBS /Tween inneholdende 3% ikke-fett tørrmelk (TBS /Tween med ikke-fettholdig melk). Membraner ble inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C i TBS /Tween med ikke-fettmelk og deretter vasket tre ganger i 5 minutter i TBS /Tween. Visualisering av proteiner ble utført
via
tilsetning av et sekundært antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (HRP), som ble inkubert i 1 time ved RT i TBS /Tween med ikke-fettholdig melk. Membraner ble vasket tre ganger i 10 minutter i TBS-Tween, inkubert i ECL og utviklet med Hyperfilm. Skanning og kvantifisering av signalintensitet ble utført ved hjelp av en Bio-Rad GS-800 densitometer med Antall One-programvaren (Hercules, CA, USA). Antistoffer ble brukt på følgende fortynninger: SFRP4 (Abnova, # 6424-A01): 1:1’000, aktivert β-catenin (Millipore, # 05-665) 1:1’000, β-catenin (Santa Cruz Biotechnology, # SC-7963), GSK3P (Sigma, # G7914) 1:1’000, anti-beta-2-mikroglobulin (Sigma, # WH0000567M1, 1:1’000). Alle sekundære antistoff fra DAKO (Dako Australia Pty Ltd, Botany, Australia) og ble anvendt ved de følgende fortynninger: geite-anti-kanin, 1:5’000 og geit anti-mus, 1:5’000
Immunohistokjemi
for deteksjon av SFRP4 uttrykk i ulike vev, ble vevet microarray lysbilder analysert ved hjelp av Ventana Benchmark automatiserte farging system (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, USA). For antigen gjenfinning, ble lysbilder oppvarmet med celle condition løsning i 1 time (CC1, Tris-basert buffer med svakt alkalisk pH) ved hjelp av en standard protokoll. Platene ble inkubert i 1 time med primær mus polyklonalt anti-humant SFRP4 antistoff (1:30; Abnova, Taipeh, Taiwan). Deteksjon ble utført ved hjelp av UView HRP-systemet (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, USA). Negative kontroller utelatt det primære antistoff, og en positiv og negativ kontroll vev for hvert antistoff ble identifisert fra elektronisk Northern blot data eller den publiserte litteratur. Kontra ble utført med hematoksylin og 1% syre alkohol. Farging ble scoret i prosent og intensitet av SFRP4 uttrykk i ulike cellulære avdelinger (membran, cytoplasma, nucleus). Scoring ble uavhengig vurdert av to forskere og uoverensstemmelser løses ved konsensus. SFRP4 uttrykk fra alle kjerner fra en pasient ble i gjennomsnitt.
ELISA
Serum SFRP4 konsentrasjoner ble bestemt av en egenutviklet Sandwich ELISA. Immunoplater (96-brønn NUNC Maxisorp; Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Danmark) ble belagt med en fange musepolyklonalt antistoff reist mot en delvis rekombinant humant SFRP4 protein (# H00006424-A01, Abnova, Taipei City, Taiwan) og fortynnet 1:250 i 0,1 M fosfatbuffer pH 7,2. Belegg og inkubering ble utført over natten ved 4 ° C. Rekombinant protein, primære og sekundære antistoffer ble fortynnet i PBS, og platene ble vasket tre ganger med 0,05% (v /v) Tween 20 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Sveits). Platene ble blokkert med PBS inneholdende 5% (w /v) standard kommersielt tilgjengelig tørrmelk i 40 minutter ved 37 ° C og vasket tre ganger. Etter blokkering av uspesifikke bindingsseter en standardkurve ble utviklet ved hjelp av rekombinant SFRP4 protein (# H00006424-Q01, Abnova, Taipei City, Taiwan) som strekker seg fra 3’200 ng /ml 12,5 ng /ml. Ufortynnede plasmaprøver ble inkubert i duplikat i 1 time ved RT. Bundet SFRP4 ble påvist ved hjelp av kanin polyklonale primær antistoff mot humant SFRP4 ved RT i 60 min (Dr. R. Friis, Universitetet i Bern, Sveits). Platene ble vasket tre ganger, etterfulgt av inkubasjon med sekundær polyklonalt anti-mus-antistoff konjugert til kanin pepperrotperoksidase (1:1’000, Abcam, Cambridge, UK) i 60 minutter ved RT. Etter fem vasketrinn, ble kromogen TMB (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Sveits) påført som et substrat, og peroxidase reaksjonen stoppet ved 30 min med et like stort volum av 2 M svovelsyre. Optisk tetthet ble målt ved hjelp av en 450 nm ELISA-leser (Tecan Spectrafluor Plus, Tecan, Mannedorf, Sveits).
Statistisk analyse
Mens SFRP4 protein uttrykk i vev ble opprinnelig kvantifisert som cytoplasma, membran og nukleær farging, tallene var ofte er for lav for ytterligere statistisk analyse av de enkelte histologiske undergrupper. Derfor SFRP4 ekspresjon ble kombinert, uavhengig av plasseringen av flekker, og ble kalt total «SFRP4 expression» (vilkårlig enheter). SFRP4 uttrykk både i vev og plasma ble først beskrevet ved hjelp av boksplott for ulike diagnosegrupper. En normal quantile tomt for SFRP4 uttrykk i plasma var indikasjon på positiv skjevhet gjør eventuelle senere analyser krever en normalfordeling forutsetning tvilsom. Men avviket stabiliserende logaritmisk transformasjon bedres problemet. Forskjeller i SFRP4 uttrykk blant diagnosegruppene ble vurdert ved hjelp av en rekke generelle lineære modeller sammen med en Bonferroni justering for parvise sammenligninger. Mulige sammenhenger mellom SFRP4 uttrykk og kliniske parametre ble vurdert ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient. Sykdom spesifikk overlevelse og tilbakefall overlevelse for uttrykket av SFRP4 ble beskrevet ved hjelp av Kaplan-Meier-kurver og statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av Cox regresjon ved å beregne ujusterte og justerte hazard ratio. Justerte Cox modeller inkludert alderskategorier (≤60, 60), tumor Karakter (1-2, 3), kreft FIGO stadium (I-II, III-IV) og restsykdom ( 10 mm, ≥10 mm) . P-verdier som er mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Dataanalyser ble generert ved hjelp av SAS programvare (v9.2, Cary, NC, USA).
Resultater
Tap av SFRP4 uttrykk korrelerer med aggressiv fenotype
SFRP4
ble sterkt uttrykt i primærkulturer tubene i forhold til den normale eggstokk-overflate epitelcellelinje HOSE6-3 og var spesielt høy i pasienten med den BRCA mutasjon (rør 1) sammenlignet med pasienter med positiv familiehistorie av bryst /eggstokkreft (rør 2, figur 1 A). Mens en klar celle og endometrioid eggstokk-kreft cellelinje (TOV21D, TOV 112d, henholdsvis) uttrykt
SFRP4
på samme nivå til den ene av de tubal kontroller, vises det udifferensierte serøs ovarian cancer cellelinje (SKOV3) meget lave nivåer av
SFRP4 plakater (figur 1 A). SFRP4 uttrykket ble så målt på proteinnivået i ulike sunne og eggstokkreft cellelinjer ved Western-blot. SFRP4 uttrykk ble sammenlignet med sin viktigste nedstrøms regulatorer aktivert og total β-catenin. HOSE6-3 ble sammenlignet med ulike eggstokkreft cellelinjer av ulik histotypes og cellulær differensiering. SFRP4 uttrykk ble tapt i alle kreftcellelinjer i forhold til HOSE6-3 (figur 1 B). Interessant, TOV112D, den endometrioid eggstokkreft cellelinje, uttrykt høyeste nivåene av både aktivert og total β-catenin, konsekvent den kjente Wnt signale avbrudd i endometrioid kreft (figur 1 B) [19]. Ascites fluid oppsamlet i løpet av progressiv kjemoterapi motstand ble deretter analysert med hensyn til sin ekspresjon av SFRP4 og nedstrøms mål som et mål på progresjon over tid. Ved hjelp av ascites ved to etterfølgende tidspunkter fra to cancerpasienter med tilsynelatende forskjellig aggressivitet (Pt 1 blandet eggstokkreft G1, Pt 2 serøs peritoneal kreft G3), disse eksperimentene viste en reduksjon av SFRP4 proteinekspresjon under progressiv kjemoresistent sykdom (figur 1 C, D ). Parallelt med SFRP4 nedgang, var nivåene av nedstrøms Wnt signal regulator GSK3p også redusert, mens aktivert β-catenin økt, noe som tyder på at Wnt signal ble faktisk aktivert hos disse pasientene.
Tap av
SFRP4
uttrykk fra primære tubal epiteliale cellelinjer mot eggstokkreft cellelinjer er vist i ulike eksperimentelle innstillinger. (A) Vi har søkt fluorescens basert RT-qPCR å undersøke
SFRP4
genekspresjon i primære tubal (friske pasienter) og foreviget cellelinjer. HOSE6-3 ble valgt som kontroll og uttrykk for andre cellelinjer ble beregnet som et forholdstall i forhold til HOSE6-3: R = 2
– [ΔCq
SFRP4 Anmeldelser – ΔCqHOSE6-3]. (B) SFRP4 og dens nedstrøms mål aktivert β-catenin (ABC), ble β-catenin og gsk3 β målt ved Western-blot i ulike cellelinjer (HOSE6-3, TOV21G (klar celle, Type I eggstokkreft), TOV112D ( endometrioid) og SKOV3 (serøs) Type II eggstokk-kreft) så vel som i (C) ascites prøver fra høy grad av serøse eggstokkkreftpasienter med chemoresistance, samlet ved to etterfølgende tidspunkter under sykdomsprogresjon (TP, tidspunktet vist som Western-blot ; B2M, beta-2-mikroglobulin ble brukt som lasting kontroll). (D) Resultater for SFRP4, aktivert β-catenin (ABC), β-catenin, gsk3 β presenteres kvantitativt ved hjelp av densitometrisk analyse fra et eksperiment på pasient ascites prøver.
Korrelasjonen av SFRP4 vev uttrykk med forskjellige clinicopathological parametre
SFRP4 lokalisering ble deretter målt på proteinnivået på grunn av den foreslåtte funksjon i membranen, cytoplasma og av og til også i kjernen av celler (figur 2) ved hjelp av IHC i en stor kohort av 721 pasienter med microarray knyttet til omfattende oppfølgingsdata (tabell 1). Membranøs farging kan identifiseres ved celle-celle-grensen, og på den apikale membran, som er i overensstemmelse med dens foreslåtte sekretorisk funksjon. Vår kohort innlemmet 281 kontrollpasienter som var sunn eller hatt godartede tilstander som endometriose eller cystadenomas /-fibromas. Kreften gruppen også besto av 440 pasienter med borderline tumorer eller invasiv kreft hovedsakelig i eggstokkene (69,8%), men også endometrial (11,3%) og andre opprinnelse (18,9%). Gjennomsnittsalderen ved diagnose var 57.1 år (19-88 år) for hele kohorten, med gjennomsnittet for kontrollgruppen er fem år yngre enn kreft kohorten (53.7
vs.
58,9 år). Vår omfattende database innlemmet oppfølgingsdata fra en periode på maksimum 29 år (gjennomsnitt for begge kohorter 48,4 måneder (1-348 måneder)).
IHC demonstrere representant SFRP4 protein uttrykk ved to forstørrelser (× 10 venstre kolonne , x 40 høyre kolonne) i normale vev (ovarie flate epitel (A) og eggleder epitel (B)), og forskjellige typer av eggstokk-kreft (endometrioid (C), serøs (D) og klar celle (E)).
SFRP4 ble positivt uttrykt i vev i 296 av 721 pasient vev (41,1%) og i 128 av 142 plasmaprøver (90,1%). Innenfor kreft årsklasse, 279 pasienter (86,4%) hadde svulster høy klasse (klasse 3) og 221 pasienter (55,3%) presenteres med avansert (FIGO III /IV) stadium sykdommen. Den fem år dødelighet i hele kreft /Type I /Type II-kullet var 29,5 /20,6 /41,3%, henholdsvis. De fem års anfallsfrekvens i samme kohort undergruppene var 20,5 /15,3 /27,5%, henholdsvis, og dermed gjenspeiler en representant kreft kohort.
Mulige sammenhenger mellom SFRP4 uttrykk bestemmes både i vev og plasma, med clinicopathological parametere avledet fra vår in-house clinicopathological database (PEROHU database; tilgang (Microsoft, Seattle USA)) ble vurdert ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient, r. Clinicopathological parametre som var tilgjengelig innen vår kohort inkludert aborter, alder diagnose, BMI, CA125 nivåer, CA72-4 nivåer, HE4 nivåer, klasse og stadium av kreft, restsykdom, ascites på diagnose, størrelse og bilaterality av ovarietumorer, ytelse status ved diagnose, lengden på oppfølging, sykdomsspesifikke og tilbakefall overlevelse, platina kjemoterapi, oral contraceptive eller hormonerstatningsterapi, svangerskap /leveranser, alder menarche og overgangsalder, tilstedeværelse av akne, polycystisk eggstokker, overflødig hår, infertilitet , infeksjoner, diabetes, høyt blodtrykk, alkohol /narkotika inntak, røyking, inntak av ikke-steroide medisiner, tidligere historie av sykehusinnleggelser, bryst sykdom, endometriose, muskelknuter, cyster på eggstokkene, og tidligere historie med kreft eller familiær kreft.
den eneste moderat sterk korrelasjon funnet for SFRP4 uttrykk både i vev og plasma ble påvist i tilfelle av ascites er tilstede i det første diagnose (SFRP4 IHC: r = 0,55, p = 0,01; SFRP4 ELISA: r = -0,60, p = 0,03 ). En annen moderat sterk sammenheng var til stede for amming når korrelert til SFRP4 plasma uttrykk (r = -0,79, p = 0,06). Men dette er på grensen til signifikant som utvalgsstørrelsen for amming var ganske små. Svake korrelasjoner ble funnet for BMI (SFRP4 IHC: r = 0,19, p = 0,003) og den nye tumor-markør HE4 (SFRP4 ELISA: r = -0,25, p = 0,02) [34]. En marginalt signifikant sammenheng kunne påvises for tidligere historie med gynekologiske operasjoner (IHC: p = 0,038, ELISA: p = 0,099), hormonbehandling (ELISA: p = 0,097) og alkoholinntak. (IHC: p = 0,098)
SFRP4 uttrykk blir stadig tapt under malign transformasjon
som ville ha blitt forutsett fra sin antatte funksjon, SFRP4 uttrykk presenteres spesielt som membran og cytoplasma farging. Fra alle undersøkte vev, er det bare fimbrial enden av fallopianrøret uttrykt atom SFRP4 farging, som var en ganske uventet funn (figur 2 B). Ovarian overflaten epitel, som ble inntil nylig foreslått å være uniform opprinnelsessted for de fleste eggstokkreft, vises bare minimal cytoplasma og ingen membran flekker, slik tilfellet var for inkludering cyster, plasseringen av metaplastiske endringer i eggstokken. Den høyeste SFRP4 uttrykk innen alle undersøkte vev ble funnet i tubal epitel, som er konsistent med våre funn på RNA-nivå i grunnskolen tubal kulturer (figur 1 A). Den nylig foreslåtte Type II kreft blir stadig antatt å ha sin opprinnelse i fimbrial enden av egglederen, som skal da heller være normal kontroll for de fleste kreftformer (38). Ja, vi fant en nedgang i kumulativ SFRP4 uttrykk fra tubal epitel, godartet vev (inkludert eggstokkreft overflaten epitel og inkluderings cyster), endometriose til Borderline svulster og kreft (figur 3.1 A, B), igjen i samsvar med trenden vi fant ved RT -qPCR i cellelinjer (figur 1 A). Tap av SFRP4 uttrykk fra godartet kreft var statistisk signifikant både målt som membran uttrykk alene (p 0,0001 samlet, figur 3.2, Benign
vs
Cancer, p = 0,07;. Border
vs.
Kreft, p 0,0001), og når membranen, cytoplasma og kjernekraft uttrykk ble målt i kombinasjon (p = 0,0004 samlet, figur 3.1 A; Benign
vs
Cancer, p = 0,039;. Border
vs.
Cancer, p = 0,002). Mens en underavdeling av membranfarging var vanskelig å måle på grunn av små utvalgsstørrelser i membran-uttrykke vev, det høyeste uttrykk i godartet gruppe for den totale SFRP4 uttrykket var i tubal epitel, etterfulgt av endometriose og lavest i eggstokkene overflaten epitel og inkludering cyster (figur 3.1 B; Tube vs. OSE, p 0,0001, Tube vs. Endometriose, p = 0,014).
boksplott som representerer kumulativ SFRP4 uttrykk (vilkårlige enheter) i cytoplasma, membran og kjerne (SFRP4 Expression in
