Abstract
Bakgrunn
Nylig har det vært en økt interesse for farmakologisk aktive naturlige produkter knyttet til rettsmidler av ulike typer sykdommer, inkludert kreft. Fucoidan er et polysakkarid avledet fra brunalger og har lenge vært brukt som en ingrediens i enkelte kosttilskuddsprodukter. Selv om fukoidan har vært kjent for å ha anti-kreft-aktivitet, har anti-metastatiske virkninger og dets detaljerte mekanisme av handlinger vært dårlig forstått. Derfor er målet med denne studien var å demonstrere anti-metastatiske funksjoner av fucoidan og dens virkningsmekanisme som bruker A549, en svært metastatisk human lungekreft cellelinje.
Metoder og hovedfunnene
fucoidan hemmer veksten av A549-celler ved en konsentrasjon på 400 ug /ml. Fukoidan behandling av ikke-toksisk dose (0-200 pg /ml) oppviser en konsentrasjonsavhengig hemmende effekt på invasjon og migrering av kreftcellen via avtagende sin MMP-2 aktivitet. For å vite mekanismen av disse hemmende effekter, ble Western blotting utført. Fucoidan behandlingen nedregulerer ekstracellulære signal-relaterte kinase 1 og 2 (ERK1 /2) og fosfoinositid 3-kinase (PI3K) -Akt-pattedyr målet for rapamycin (PI3K-Akt-mTOR) veier. Videre Fucoidan reduserer cytosoliske og atomnivå Nuclear Factor-kappa B (p65).
Konklusjon /Betydning
Denne studien antyder at fucoidan viser anti-metastatisk effekt på A549 lungekreftceller via den nedregulering av ERK1 /2 og Akt-mTOR samt NF-kB signalveier. Derfor kan Fucoidan betraktes som en potensiell terapeutisk reagens mot metastasering av invasive humane lungekreftceller
Citation. Lee H, Kim JS, Kim E (2012) Fucoidan fra Seaweed
Blæretang
hemmer migrasjon og invasjon av menneskelige Lung Cancer Cell via PI3K-Akt-mTOR Pathways. PLoS ONE 7 (11): e50624. doi: 10,1371 /journal.pone.0050624
Redaktør: Renping Zhou, Rutgers University, USA
mottatt: 30 august 2012; Akseptert: 23. oktober 2012; Publisert: 30.11.2012
Copyright: © 2012 Lee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastaser er en ledende årsak (opp til 90%. ) av kreftrelaterte dødsfall. Utviklingen av kreft metastase består av flere prosesser, hvor kreftcellene først løsner fra den primære svulsten, invaderer omkringliggende vev og intravasate til blod og /eller lymfesystemet og ekstravasere fra blodkar og deretter bosette og kolonisere på målorganene. Matriks-metalloproteinaser (MMP) spiller en nøkkelrolle i tumor metastase, hvor MMP’er nedbryter ekstracellulær matriks (ECM) proteiner som kollagen, proteoglykan, elastin, laminin og fibronektin [1], [2]. Blant dem, er MMP-2 (gelatinase A) og MMP-9 (gelatinase B) uttrykkes rikelig i forskjellige ondartede kreftformer og degradere type IV kollagen, som er en viktig komponent av basalmembranen. Generelt er MMP-2-over-uttrykkes konstitutivt i svært metastatiske kreftformer, mens MMP-9 er indusert av noen stimulerende faktorer, så som inflammatoriske cytokiner, epidermal vekstfaktor og forbol-12-myristat-13-acetat [3]. Derfor kan MMP-2 spiller en viktigere rolle i kreftceller migrasjon og invasjon.
Lungekreft er en av de vanligste kreftformene i verden og en ledende årsak til kreft død, sto for mer enn en million dødsfall årlig på verdensbasis [4]. Spesielt er det en meget aggressiv og metastatisk tumor sannsynligvis på grunn av sekresjon høyere nivåer av MMP sammenligner med andre kreftformer. Derfor er inhibering av MMP-2 i kreftceller ser ut til å være en interessant terapeutisk mål for høyt metastatiske lungekreftceller. MMP uttrykk reguleres av transkripsjonsfaktorer (AP-1 og NF-kB) gjennom oppstrøms trasé inkludert mitogen aktivert kinaser (MAPK) og PI3K-Akt trasé [5]. MAPK består av tre kinaser, inkludert ekstracellulære signal-relaterte kinase 1 og 2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal kinase /spenning aktivert protein kinase (JNK /SAPK), og p38. MAPK er implisert i en rekke cellulære funksjoner som proliferasjon, migrering og invasjon [3]. Aktivering av PI3K kan stimulere sin nedstrøms mål, Akt, og deretter regulere cellevekst, adhesjon og invasjon [6].
Det har vært mange rapporter som undersøker kreft chemopreventive eller terapeutiske midler fra naturlige produkter. Mange arter av marine alger har lenge vært brukt i mat diett og også dokumentert som blir brukt i tradisjonell orientalsk medisin i over 1000 år [7], [8]. De inneholder ulike funksjonelle komponenter, slik som porphyran, gepsin, alginsyre, og oligosakkarid. Fucoidan, hvis molekylvekt gjennomsnittet er ca 20 000, er et sulfatert polysakkarid ekstrahert fra brunt marine alger og består av L-fucose og sulfat estergrupper. Det har tidligere vært foreslått at fukoidan har forskjellige biologiske aktiviteter som antibakterielle [9], antioksidant [10], anti-inflammatorisk [11], antikoagulant [12], og anti-tumor aktivitet [2]. I C57BL /6 mus transplantert med Lewis lunge adenokarcinomceller, fucoidan fra
Fucus evanescens
produsert moderat antitumor og anti-metastatiske effekter og forsterket anti-metastatisk, men ikke antitumor aktiviteter cyklofosfamid [13]. I tillegg, fukoidan hemmet MMP-2/9 aktiviteter og invasivitet av HT-1080-celler og dannelse av vaskulære rørelementene via undertrykke ekspresjon og sekresjon av et angiogenese faktor [14]. Imidlertid har molekylære mekanismen til dets virkning sjelden blitt forstått enda.
(A) Subkonfluente A549 celler ble inkubert i 48 timer i fravær eller nærvær av fukoidan (0, 12,5, 25, 50, 100 og 200 ug /ml) i serumfritt RPMI-medium. De kondisjonerte media ble samlet inn, og deres MMP-2 aktivitet ble beregnet ved hjelp av gelatin zymografi. (B) MMP-2 aktivitet ved analyse av zymografi ble kvantifisert ved å måle de båndintensitetene ved hjelp av Image J programvare. (C) Totalt cellelysatene ble underkastet Western blot-analyse probet med anti-MMP-2-antistoff. (D) Uttrykk for MMP-2 ved analyse av western blot ble kvantifisert ved å måle bandet intensiteter ved hjelp av Image J programvare. Dataene som vises, er gjennomsnitt ± SD av seks eksperimenter. Signifikant forskjell fra kontrollgruppen, * p 0,05 og ** p. 0,01
I denne studien ble det undersøkt effekten av fucoidan om migrasjon, invasjon og MMP-2 uttrykk for A549 menneskelig lungekreft celler og dens underliggende anti-metastatiske virkningsmekanismer.
Materialer og Metoder
Utarbeidelse av Fucoidan og reagenser
Fucoidan ekstrakt fra tang
Blæretang
ble hentet fra Sigma (Sigma, St. Louis, Mo, USA). Fukoidan pulver ble oppløst i PBS, deretter ble den sterilisert ved bruk av et 0,45 pm pore-filter (Sartorius Biotech GmbH, Gottingen, Tyskland) og lagres som «fukoidan ekstrakt (20 mg /ml) «ved 4 ° C inntil bruk. MTT reagenser og gelatin (G8150) ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). RPMI 1640 medium uten fenolrødt, Trypsin-EDTA, penicillin-streptomycin-amfotericin B-løsning (10.000 U /ml, 10 mg /ml og 25 ug /ml), føtalt bovint serum (FBS), og fosfatbufferoppløsning (PBS) var fra Gibco BRL, Life Technologies (USA). LY294002 (PI3K-hemmer), ble U0126 (ERK1 /2-hemmer), og rapamycin (mTOR-hemmer) hentet fra Tocris Cookson Ltd. (Bristol, UK). For ERK1 /2, p38, JNK, Akt, mTOR (Ser2448) og NF-kB, totalt og /eller fosforylerte proteinspesifikke antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Invasjon analysesett var fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA).
(A) A549-celler ble sådd ut på 12-brønn og dyrket til 90% konfluens i RPMI inneholdende 10% FBS. Cellene ble skrapet med en pipettespiss og deretter behandlet med fukoidan (0, 50, 100, og 200 ug /ml). (B) Cellemigrering avstand ble bestemt ved å måle bredden av såret. Dataene som vises, er gjennomsnitt ± SD av seks eksperimenter. Signifikant forskjell fra kontrollgruppen, * p 0,05 og ** p. 0,01
(A) Effekter av fucoidan på kreftceller invasjonen ble undersøkt ved hjelp av Cell Invasion Assay kit (BD Biovitenskap, San Jose, CA, USA). For dette ble A549-celler sådd ut på det øvre kammer av Matrigel-belagte filter og inkubert i fravær eller nærvær av fukoidan (0, 50, 100, og 200 ug /ml) i 48 timer. Invaderende celler på den nedre overflate av membranen ble visualisert ved krystallfiolett farging og observert med lysmikroskop. (B) Mengden av invaderende celler ble kvantifisert ved hjelp av Image J programvare. Dataene som vises, er gjennomsnitt ± SD av tre eksperimenter. Signifikant forskjell fra kontrollgruppen, * p 0,05 og ** p. 0,01
Cell Culture
A549 celler fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% FBS, 100 ug /ml penicillin-streptomycin-amfotericin B-løsning ved 37 ° C i en 5% CO
2 fuktet inkubator. Celler ble passert tre ganger i uken ved behandling med trypsin-EDTA, og de av etter fem passeringer ble anvendt for forsøkene.
(A) A549-celler ble behandlet med fukoidan 200 ug /ml i perioder med 0, 1 , 3, 6 og 9 timer, henholdsvis. (B) A549-celler ble inkubert i 6 timer med fukoidan ved forskjellige konsentrasjoner (0, 50, 100 og 200 ug /ml). Nivåene av fosfo-JNK 1/2, fosfo-ERK 1/2, og fosfo-p38 ble analysert ved Western blotting ved å bruke spesifikke monoklonale antistoffer. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (C og D) Fosforyleringen nivået av ERK1 /2 ble kvantifisert ved analyse med bilde J programvare. Dataene som vises, er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. Signifikant forskjell fra kontrollgruppen, * p 0,05 og ** p. 0,01
(A) A549 celler ble behandlet med Fucoidan 200 mikrogram /ml for perioder med 0, 1, 3, 6 og 9 timer, henholdsvis. (B) A549-celler ble inkubert i 6 timer med fukoidan ved forskjellige konsentrasjoner (0, 50, 100 og 200 ug /ml). Nivåene av fosfo-PI3K og fosfo-Akt ble analysert ved Western blotting ved å bruke spesifikke monoklonale antistoffer. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Fosforyleringen nivåene av PI3K (C og D) og Akt (E og F) ble kvantifisert ved analyse med bilde J programvare. Dataene som vises, er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. Signifikant forskjell fra kontrollgruppen, * p 0,05 og ** p. 0,01
(A) A549 celler ble inkubert i 24 timer med Fucoidan på ulike konsentrasjoner (0, 50, 100 og 200 mikrogram /ml). Fosforyleringen nivåer av mTOR, p70S6K og 4EBP1 ble kvantifisert ved analysen med bilde J programvare. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (B, C og D) Båndintensitetene (fosforylering nivå) av hver signalmolekyler ble kvantifisert ved analyse med bilde J programvare. Dataene som vises, er gjennomsnitt ± SD av tre eksperimenter. Signifikant forskjell fra kontrollgruppe, * p 0,05 og ** p. 0,01
(A) Celler ble forbehandlet med U0126 (10 eller 20 uM) (A), LY294002 (10 eller 20 pM ) (B), eller rapamycin (1 eller 2 uM) (C) i 2 timer og deretter inkubert i fravær eller nærvær av fukoidan (25 ug /ml) i 48 timer. De endringer av MMP-2 aktiviteter ble kvantifisert ved å måle bandet intensiteter ved hjelp av Image J programvare. Dataene som vises, er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. Signifikant forskjell fra kontrollgruppe, * p 0,05 og ** p 0,01
A549-celler ble inkubert i 24 timer med fukoidan ved forskjellige konsentrasjoner (0, 50, 100 og 200 ug /ml). . (A) cytosolisk ekstrakt ble fremstilt og analysert ved Western blotting med fosfo-ikb og fosfo og total-NF-kB (p65). (B, C og D) Nivået av fosfo-ikb og fos og total NF-kB ble kvantifisert ved analyse med bilde J programvare. GAPDH ble anvendt som en kontroll i laste cytosoliske fraksjon og Lamin B ble lasting kontroll i nukleær fraksjon. Båndintensitetene av hver signalmolekyler ble kvantifisert ved analyse med bilde J programvare. Dataene som vises, er gjennomsnitt ± SD av tre eksperimenter. Signifikant forskjell fra kontrollgruppen, * p 0,05 og ** p 0,01
MTT analyse for celleviabilitet
Celleviabilitet ble målt ved MTT (3- (4,5. -dimetyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) reduksjon assay som tidligere beskrevet [15]. Kort sagt ble A549-cellene inkubert ved en tetthet på 4 x 10
4 celler /brønn i 24-brønners plater i 24 timer. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av fukoidan til 48 timer. Deretter ble MTT-fargestoff (5 mg /ml) tilsatt til cellene, og de ble inkubert i ytterligere 3 timer. Etter at mediet var fjernet, ble DMSO tilsatt til cellene for oppløseliggjøring av genererte formazanfremstilling salter. Mengden av formazanet salt ble bestemt ved å måle den optiske tetthet (OD) ved 540 nm ved anvendelse av GENios® mikroplate-spektrofotometer (POWERWAVE
TMXS, BioTek Instruments, Inc., Winooski, USA). Relativ cellelevedyktigheten til behandling ble beregnet som en prosentandel av kjøretøy-behandlet kontroll ([OD av behandlede celler – OD av tomt /OD av kontroll – OD blank] x 100).
Sår Migration analysen
Cellemigrering migrering~~POS=HEADCOMP analysen ble utført ved anvendelse av 12-brønners plater som beskrevet [16]. A549-celler ble sådd på 12-brønners plater (1 x 10
5-celler /ml) og dyrket til 80~90% konfluens for eksperimentet. Etter å aspirere medium, ble cellene skrapet med en 200 mL steril pipette tips for å lage en rett scratch. De ble vasket to ganger med PBS for å fjerne cellulært avfall og deretter erstattet med fullstendig RPMI 1640. A549-celler ble behandlet med fukoidan (0, 50, 100, og 200 ug /ml) og inkubert i 48 timer. Cellemigrering inn i sårområdet ble fotografert ved stadier av 0 timer og 48 timer, henholdsvis for bildeanalyse for hver behandling. Nivået av cellemigrering ble bestemt ved anvendelse av en Hewlett-Packard skanner og NIH Image software (bilde J), og deretter ble uttrykt som en prosentandel av hver kontroll for middelverdien til lukking av sår-området.
celle invasjon Assay
invasiv oppførselen til A549 celler ble testet ved hjelp av celle invasjon kammer kit (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) [17]. A549-celler ble på nytt oppslemmet i et serumfritt RPMI 1640 medium (5 x 10
4 celler /200 ul) i fravær eller nærvær av fukoidan (0, 50, 100 og 200 ug /ml). Cellene ble sådd ut på det øvre kammer av Matrigel-belagt filter og et RPMI 1640 inneholdende 10% FBS ble tilsatt 500 ul i det nedre kammer. Etter 48 timers inkubasjon ble de ikke-invaderende celler fjernes fra den øvre overflate av filtermembranen. Invaderende celler på den nedre flate av filtermembranen ble farget med krystallfiolett i 1 time og renset med vann og tørket. Mengden av invaderende celler på den nedre overflate av filtermembranen ble bestemt ved anvendelse av et lysmikroskop og NIH Image software (bilde J).
Gelatin Zymografi
MMP-2 aktivitet ble bestemt ved gelatin zymografi [18]. Kort sagt ble A549-celler sådd (1 x 10
5-celler /brønn) og fikk vokse til sammenflytning i 24 timer og opprettholdt i RPMI 1640 med 10% FBS. Cellene ble vasket med PBS og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av fukoidan (0, 50, 100, og 200 ug /ml) i serumfritt RPMI 1640 i 48 timer. Supernatanten ble samlet opp og blandet med ikke-reduserende prøvebuffer, og deretter underkastet elektroforese på 10% polyakrylamidgel inneholdende 0,1% (w /v) gelatin. Etter elektroforese, ble gelen vasket i 30 minutter to ganger med 2,5% Triton X-100 og inkubert i ytterligere 18 timer ved 37 ° C for den enzymatiske reaksjon av MMP’er i zymografi reaksjonsbuffer (200 mM NaCl, 10 mM CaCl
2 , 50 mM Tris-HCl, pH 7,4). Gelen ble så farget med Coomassie blue R-250 (0,125% Coomassie-blå R-250, 50% metanol, 10% eddiksyre) og avfarget (metanol /eddiksyre /vann, 40/10/50, v /v /v ).
Fremstilling av cellelysater
Etter fukoidan behandlinger, A549 celler ble skylt to ganger med iskald PBS, og deretter tilsatt med 100 ul lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,25% natrium-deoksycholat, 150 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM natriumortovanadat, 1 mM NaF, 1 mM Na
3VO
4, 1 ug /ml aprotinin, 1 pg /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin). Lyserings Reaksjonen ble utført på is med gynge i 3 min, og cellene ble skrapet av ved hjelp av gummistav inn i Eppendorf-mikrosentrifugerør. De avskrapede celler ble tillatt å lysere i ytterligere 30 minutter på is med periodevis risting. Celleavfall ble fjernet ved sentrifugering (22.000 x
g
, ved 4 ° C i 30 minutter) og den resulterende supernatanten ble oppsamlet og bestemt for dets proteinkonsentrasjon ved anvendelse av en Bio-Rad proteinanalyse-reagens (Bio-Rad, CA USA). Prøvene ble kokt med SDS prøvebuffer i kokende vann i 5 min.
Western blotting
proteinkomponentene (50 pg) ble separert på 12% SDS-polyakrylamidgel, overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Bio-Rad, CA USA), og deretter underkastet immunoblotanalyse ved hjelp av spesifikke primære antistoffer for over natten ved 4 ° C. Etter vasking ble membranene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) i 1 time ved romtemperatur. Blottene ble deretter visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence metoden (ECL, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) på blå lysømfintlig film (Fujifilm Corporation, Tokyo, Japan). Om nødvendig, ble blottet membraner strippet og reprobed bruker andre primære antistoffer. Densitometry analyse ble utført med en Hewlett-Packard-skanner og NIH Image programvare (Bilde J).
Statistical Analysis
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (S.D.). Én-veis analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å vurdere betydningen av forskjellen mellom de to middelverdier. *
P
0,05 og **
P
. 0,01 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Fucoidan hemmer aktiviteten til MMP -2 i A549 humane lungekreftceller
for å bestemme ikke-cytotoksiske konsentrasjon av fukoidan, A549 celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av fukoidan (0-1000 ug /ml) i 24 timer eller 48 timer, og da cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av MTT-analyse (data ikke vist). Fukoidan viste ingen signifikant toksisk effekt på A549-celler i konsentrasjonsområdet 0-200 ug /ml. Ved høyere konsentrasjoner (400-1000 ug /ml), men fukoidan hemmet celleproliferasjon og redusert cellelevedyktighet i en konsentrasjonsavhengig måte. Derfor er den foreliggende undersøkelsen anvendes ved behandling av fukoidan, ved konsentrasjoner lik eller lavere enn 200 pg /ml, på hvilket ble observert noen signifikant cytotoksisk effekt på A549-celler.
degradering av ekstracellulær matriks (ECM) er avgjørende for cellulær invasjon, noe som indikerer den uunngåelige involvering av matrisenedbrytende proteinaser for prosessen. Derfor ble det vurdert effekten av fukoidan på MMP-2 aktivitet, som en nøkkel molekyl av ECM nedbrytning, av gelatin zymografi. Som vist i figur 1A, fukoidan trykkes MMP-2 aktivitet på en konsentrasjonsavhengig måte. På den annen side er virkningen av fukoidan på MMP-9 aktivitet var mangelfulle, da det kun er et ekstremt lavt nivå av indre MMP-9-aktivitet påvises i A549-celler (data ikke vist). MMP-2 aktivitet ble redusert med 36%, 53% og 72% ved 50, 100, og 200 ug /ml, henholdsvis, etter behandling med fukoidan i 48 timer (fig. 1B). De som oppnås ved zymografi resultater ble ytterligere bekreftet ved Western blot-analyse. MMP-2-ekspresjon ble gradvis redusert med økende konsentrasjoner av fukoidan (Fig. 1C). Proteininnholdet ble redusert med 38%, 48% og 60% ved 50, 100, og 200 ug /ml, henholdsvis. Reduksjonen av MMP-2 aktivitet var sannsynligvis på grunn av reduksjon i MMP-2 uttrykk (Fig. 1B og 1D).
Fucoidan Undertrykker Migration til A549-celler
Cell migrasjon er et mål av metastatisk potensial av kreftceller. Effekter av fucoidan på cellemigrasjon ble undersøkt ved hjelp av en sårtilheling analysen. A549-celler ble behandlet med fukoidan viste reduksjon av migreringen (fig. 2A). Som vist i figur 2B, ble cellemigrasjon inhibert av opp til 25%, 46% og 57% ved 48 timer i nærvær av 50, 100, og 200 ug /ml av fukoidan, respektivt. Sammen er disse dataene viste at fucoidan kan undertrykke den vandrende eiendom lungekreftceller.
Fucoidan Hemmer invasjon av A549-celler
For å belyse hemmende effekt av fucoidan på invasjon av A549 celler, det var testet ved bruk av invasjon kammeret kit (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), i hvilke celler invadere tvers ekstracellulær matriks, så som Matrigel-belagt filter i kammeret. Som illustrert i figur 3A, antall celler med invasjon (krystall-fiolett farging) reduseres bemerkelsesverdig på en konsentrasjonsavhengig måte, noe som tyder på fukoidan kan hemme invasjon av A549-celler. De inhiberende virkninger av fukoidan på kreftcelle invasjon var 35%, 68% og 86% ved konsentrasjoner på 50, 100 og 200 ug /ml fukoidan, henholdsvis (fig. 3B). Resultatene indikerte at fucoidan kan direkte hemme invasiv potensial for lungekreft celle.
Fucoidan Hemmer MMP-2 aktivitet ved å blokkere ERK1 /2 og PI3K-Akt Pathways i A549 celler
Våre funn viste at fucoidan dramatisk hemmer migrasjon, invasjon og MMP-2 aktivitet i A549 celler. Imidlertid signal mekanismer som er ansvarlig for den inhiberende virkning av fukoidan på metastasering gjenstår å bli belyst. Flere bevis tyder på at MAPK (JNK 1/2, 1/2 ERK, og p38) spiller viktige roller i kreftcellemigrering, invasjon, og MMP-2 aktivitet [5]. Tatt i betraktning den sterke anti-metastatisk potensial for Fucoidan, ble det testet om det kan regulere signal transductions av MAPKs i metastatiske lungekreftceller. Resultatene av figur 4 viser at fukoidan redusert fosforylering av ERK1 /2 i en treringstrinnet og tidsavhengig måte, mens det hadde nesten ingen eller marginal, om noen, effekt på p38 og JNK1 /2. Som vist i figur 4A og 4C, er en tidsavhengig studien viste at fukoidan gradvis redusert fosforylering av ERK1 /2 fra 1 time til 9 timer etter behandlingen. Figur 4B og 4D viste at fukoidan inhiberte signifikant fosfo-ERK1 /2 på en konsentrasjonsavhengig måte med en maksimal hemmende effekt ved den høyeste konsentrasjon (200 ug /ml). I tillegg til MAPKs har cellesignalisering av PI3K /Akt også blitt foreslått som en sentral aktør i reguleringen av MMP-2 aktivitet [19]. Vår nåværende studie viste at fukoidan markert hemmet de phosphorylations av PI3K og dens nedstrøms mål, Akt, i en treringstrinnet og tidsavhengig måte (fig. 5). Basert på disse resultatene, Fucoidan potent hemmet metastatisk aktivitet av humane lungekreftceller, muligens av undertrykkelse av ERK1 /2 og PI3K-Akt veier.
Fucoidan undertrykker mTOR Signa
Det har vært rapporterte at PI3K er forbundet med en rekke cellulære prosesser som proliferasjon, differensiering, apoptose, celle motilitet, invasjon og angiogenese [20], [21]. Den signalisering av mTOR har dukket opp spesielt som en kritisk effecter av PI3K signaltransduksjonsbane i ulike menneske kreft [22]. Basert på våre funn at fucoidan undertrykker PI3K-Akt veien i humane lungekreftceller, ble det undersøkt om fucoidan modulerer mTOR og nedstrøms signalmolekyler. Som vist i figur 6A og 6B, fukoidan hemmet fosforylering av mTOR på en konsentrasjonsavhengig måte. I tillegg 4E-BP1 og p70S6K, to umiddelbare nedstrøms mål av mTOR og indikatorer av mTOR-aktivitet, ble også betydelig undertrykt (Fig. 6C og 6D).
Fucoidan Hemmer MMP-2 aktivitet ved å blokkere ERK1 /2 og PI3K-Akt-mTOR pathways i A549-celler
for å bekrefte hvorvidt hemming av MMP-2 aktivitet ved Fucoidan hovedsak stole på sin undertrykkelse av ERK1 /2 og PI3K-Akt-mTOR trasé, ble A549 celler forbehandlet i tilstedeværelse eller fravær av U0126 (en ERK-inhibitor), LY294002 (en inhibitor PI3K) eller rapamycin (en mTOR-inhibitor) i 2 timer, deretter kontrollert for effektene av fukoidan behandling (fig. 7). Sammenlignet med de respektive bærerkontroller, individuelle behandlinger med U0126 (Fig. 7A, kolonne 3 og 4), LY294002 (fig. 7B, felt 3 og 4) eller rapamycin (fig. 7C, spor 3 og 4) ga en signifikant reduksjon av MMP-2 aktivitet. Resultatene er i tråd med de av fucoidan eksperimenter av denne studien i at MMP-2 hemming kan være mediert av modulasjoner av ERK1 /2, PI3K-Akt og /eller mTOR veier. Beskriver i detalj, cotreatment av U0126 (10 uM og 20 uM) og fukoidan redusert ytterligere MMP-2 aktivitet ved 66% og 75% sammenlignet med U0126 alene (46% og 65%) (fig. 7A). På samme måte, de kombinerte behandlinger av LY294002 og fukoidan i tillegg undertrykkes MMP-2 aktivitet ved 65% og 86% i sammenligning med LY294002 alene (27% og 43%) (fig. 7B). Imidlertid, i motsetning til andre, rapamycin og fukoidan cotreatment ikke gi en ytterligere reduksjon av MMP-2 aktivitet sammenlignet med rapamycin alene (figur 7C.). Det er ennå ikke klart forstått hvorfor det var verken additive eller synergistiske effekter av rapamycin med Fucoidan. I sammendrag, er inhiberingen av MMP2 med fukoidan behandling muligens oppvises av modulasjonene av ERK1 /2 og /eller PI3K-Akt-mTOR veier. Disse resultatene foreslår det terapeutiske potensialet av fukoidan som et antimetastatisk middel i humane lungekreftpasienter.
fucoidan Reduserer Nuclear translokasjon av NF-kB
NF-kB reaksjonsvei er blitt demonstrert å stole upon sekvensielt aktivert kinasekaskader [23]. Ved aktivering, NF-kB translocates fra cytoplasma til kjernen og regulerer ekspresjonen av et bredt utvalg av målgener, inkludert MMP’er [5]. Siden NF-kB kan spille en nøkkelrolle i MMP-2 genekspresjon, ble effekten av fucoidan vurderes IκBα og NF-kB signaltransduksjon. Som vist i figur 8A og 8B, fukoidan hemmet fosforylering av IκBα på en konsentrasjonsavhengig måte, mens det totale IκBα ble inverst økt med fukoidan. Å være i overensstemmelse med dette ble det fosfo-p65, en indikator for NF-kB-aktivering gjennom IκBα degradering, ble redusert ved behandling av fucoidan (Fig. 8A og 8C), som er ledsaget av en økning i total p65 i den cytosoliske fraksjonen og dens reduksjon i kjernefraksjonen (fig. 8A og 8D). Resultatene viste at fukoidan signifikant inhiberte aktiveringen av NF-kB i A549-celler.
diskusjon
Det er vel kjent at MMP tilveiebringe en tilgang for tumorceller til vaskulære og lymfekar, hvilken støtte tumorvekst og utgjør en rømningsvei for videre formidling [24]. Videre MMP fremme malign transformasjon i tidlige stadier av kreft og undertrykke kreftcelle apoptose og forbedre angiogenese samt ødelegge chemokiner balanse etter vert anti-tumor forsvarssystem [25]. Følgelig, blokkering av MMP-aktivitet, og ekspresjon kan føre til utvikling av effektiv terapi i metastatiske kreftpasienter. Selv om mange forskere har gjort store anstrengelser for å utvikle potensielle legemidler mot kreft av MMP-hemmere, de fleste kliniske studier har ikke blitt gjennomført ennå [26].
På jakt etter effektive metastatisk dempere, et bredt utvalg av naturlige produkter og deres farmakologiske ingredienser kan være en god kilde til å finne lovende kandidater, som har flere fordeler fremfor syntetiske kjemikalier på bivirkninger og pharmacophore mangfold. Noen av dem fra ulike naturressurser er allerede karakterisert som potensielle legemiddelselskap med anti-metastatisk aktivitet [27]. Blant dem har Fucoidan blitt avslørt for å ha anti-proliferative og cytotoksiske effekter på MCF-7 brystkreft celler, men ikke menneskelige mammary epitelceller (HMECs) [28]. Nylig har fukoidan blitt demonstrert å hemme metastase via MMP-2 /-9 undertrykkelse samt undertrykke ekspresjon og sekresjon av en vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [14]. Den anti-metastatisk aktivitet av fukoidan ble også påvist i dyremodellen for eksperimentell transplantert Lewis lungekarsinom (LLC) [13]. Men den hemmende mekanisme på kreftmetastase har ikke vært tydelig klarlagt i detalj, men. For første gang, i denne studien, er det i det minste delvis er identifisert anti-metastatisk molekylære mekanisme av fucoidan.
status av cellelevedyktigheten ble bedømt ved hjelp av MTT-analysen i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av fukoidan . Fukoidan hemmet celleveksten ved 400 ug /ml, men ikke på mellom 0 og 200 pg /ml, ved hvilken den effektivt hemmet migrering og invasjon, uten signifikant cytotoksisk effekt. Derfor anti-invasive og anti-trekkende effekter av fucoidan observert fra denne undersøkelsen var ikke avhengig av sin anti-spredning effekt. Forbedring av MMP-2 aktivitet er blitt godt karakterisert i høyt metastatiske humane lungekreftceller [29]. Imidlertid er MMP-9 fremdeles mangelfulle, da det kun er et ekstremt lavt nivå av MMP-9 påvist i A549 humane lungekreftceller. Basert på vår nåværende studie, anti-metastatiske effekten av fucoidan synes å være mediert av sin hemmende aktivitet på MMP-2. (Fig. 1, 2 og 3). Våre resultater viser at fukoidan effekt er mer som undertrykkelse av MMP-2 sekresjon og /eller ekspresjon i stedet for direkte inhibering av dets aktivitet.
ERK1 /2 pathway er involvert i invasiv eller vandringsadferd av et antall av ondartede sykdommer, for eksempel kolonkreft, melanom, brystkreft og prostatakreft og dette er godt etablert i tidligere studier [30] – [32]. Videre ERK1 /2 regulerer fokal adhesjon og cytoskeletal omstilling via phosphorylations av spesifikk cytoskeletal og fokal adhesjonsproteiner, inkludert paxillin, FAK, myosin-lettkjede-kinase [33]. Som vist i figur 4, er den anti-metastatisk virkning av fukoidan på grunn av dets inaktivering av ERK1 /2 pathway i A549 humane lungekreftceller. I tillegg til ERK1 /2, har den PI3K-Akt signalveien blitt vist å regulere invasjon og metastasering av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), så vel som utvikling og progresjon av forskjellige andre tumorer. Det vil si, PI3K over-uttrykk er sterkt korrelert med utviklingen, invasjon og metastasering av NSCLC [34]. Flere andre studier har også vist at målretting av PI3K-Akt signalveien med antisens, siRNA eller lavmolekylære inhibitorer resulterer i nedregulering av tumorinvasjon og tumorgenese i maligne cancerceller [6], [35].
