Abstract
ADAM15 er medlem av en familie av katalytisk aktive disintegrin membran metalloproteinaser som fungerer som molekylære signal brytere, bod membranbundne vekstfaktorer og /eller spalte og inaktivere celleadhesjonsmolekyler. Avvikende metalloproteinase funksjon ADAM15 kan bidra til tumorprogresjon gjennom utgivelsen av vekstfaktorer eller forstyrrelse av celle adhesjon. I denne studien, benyttet vi humane blærecancer vev og cellelinjer for å vurdere ekspresjon og funksjon av ADAM15 i progresjonen av human blærekreft. Undersøkelse av genom og transkriptom databaser avdekket at ADAM15 rangert på topp 5% av forsterkede gener og dens mRNA ble betydelig overuttrykt i invasiv og metastatisk blærekreft sammenlignet med ikke-invasiv sykdom. Farging av en blære svulstvev rekke utformet for å evaluere sykdomsprogresjon avslørte økt ADAM15 immunoreaktivitets forbundet med økende kreft scenen og viste signifikant sterkere farging i metastatisk prøver. Omtrent halvparten av de invasive svulster og flertallet av de metastatiske tilfeller utstilt høy ADAM15 flekker indeksen, mens alle lav karakter og ikke-invasiv tilfeller viste negativ eller lav farging. Knockdown av ADAM15 mRNA uttrykk betydelig hemmet blære svulst celle migrasjon og redusert invasiv kapasitet på blæren kreftceller gjennom Matrigel
TM og monolag av vaskulær endotel. Knockdown av ADAM15 i en human xenograft modell av blærekreft inhiberte tumorvekst med 45% sammenlignet med kontroller. Strukturell modellering av det katalytiske domenet førte til konstruksjonen av en ny ADAM15 spesifikk sulfonamid-inhibitor som vist bioaktivitet og betydelig redusert levedyktighet blærekreftceller
in vitro
og i humane blærecancer xenografter. Til sammen resultatene viste en ubeskrevet rolle ADAM15 i invasjonen av human blærekreft og foreslo at ADAM15 katalytiske domenet kan representere en levedyktig terapeutisk mål hos pasienter med avansert sykdom
Citation. Lorenzatti Hiles G, Bucheit A, Rubin JR, Hayward A, Cates AL, dag KC, et al. (2016) ADAM15 er funksjonelt Assosiert med metastatisk progresjon av menneskelige blærekreft. PLoS ONE 11 (3): e0150138. doi: 10,1371 /journal.pone.0150138
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 23 juli 2015; Godkjent: 09.02.2016; Publisert: 01.03.2016
Copyright: © 2016 Lorenzatti Hiles et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne forskningen støttes delvis av R01CA154252 (MLD), University of Michigan Cancer Center Support Grant (P30 CA46592) og blære forskningsmidler fra generøse givere til Universitetet Michigan Urology Department. Dette arbeidet ble også støttet delvis av de europeiske egyptiske Pharmaceutical Industries. GLH er støttet av UL1TR000433 (Postdoktor Translasjonell Scholars Program, Michigan Institutt for klinisk og helseforskning) og University of Michigan. Den Funder EEPI gitt støtte i form av konsulenthonorar for forfattere [MLD og LE], men hadde ikke noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og forfatterne av dette manuskriptet har følgende konkurrerende interesser: MLD er en betalt konsulent European egyptiske Pharmaceuticals, Alexandria, Egypt. Forfatterne erklærer også at støtten fra EEPI ikke endrer sin tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer
Forkortelser. ADAM, A disintegrin Og Metalloproteinase; DMEM, Dulbeccos modifiserte Eagle-medium; EGF, epidermal vekstfaktor; EGFR, epidermal vekstfaktor reseptor; FBS, føtalt bovint serum; FRET, Fluorescence Resonance Transfer; GAPDH, glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase; GPCR, G-protein koblet reseptor; HB-EGF, heparinbindende epidermal vekstfaktor; HUV-EC-C, Human navleveneendotel Cells; MTS, 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium; OD, optisk tetthet; PBS, Fosfatbufret saltvann; PMS, fenazin metosulfatkvaternære; RFLP, fragment lengde polymorfisme; SCID, alvorlig kombinert immunsvikt; SD, standardavvik; SE-cad, løselig E-cadherin; SEM, standardfeil for Mean; shRNA, kort hårnål RNA; TBST, Tris-bufret saltvann plus Tween; TEM, Trans-endotel Migration; TGFa, Transforming Growth Factor Alpha; TGFfi, er transformerende vekstfaktor beta
Innledning
Blærekreft den fjerde vanligste årsaken til kreft, og den åttende vanligste årsaken til kreftdød i menn. Anslagsvis 74.000 menn og kvinner vil bli diagnostisert og 16.000 mennesker vil dø av blærekreft ved utgangen av 2015 [1]. Mens flertallet av blære kreft er tilstede som ikke-invasiv tidlig stadium svulster, opp til en tredjedel av ikke-muskel invasiv sykdom vil utvikle seg til muskel invasiv sykdom og metastaserer over tid [2]. Til tross for effektiviteten av cisplatin-kjemoterapi for lokalt fremskreden eller metastatisk kreft i blære, mangel på holdbarhet av svar og fravær av andrelinjeterapi punkt på behovet for mer effektive behandlings [3, 4]. Kritisk til nye terapeutiske utviklingen er identifisering av spesifikke onkogene trasé med lovende terapeutiske intervensjoner, og riktig identifisering av pasienter som er sannsynlig å dra nytte av en gitt behandling (individuell kreftbehandling).
De fleste blære kreft uttrykkelig forhøyede nivåer av den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) [5,6,7]. EGFR modulerer cellevekst og proliferasjon, så vel som regulering av genekspresjon, angiogenese, motilitet og apoptose som resulterer i økt malignitetspotensiale [8,9,10]. Forhøyet EGFR er vanlig i grunnskolen blære kreft med om lag 50% av tilfellene stiller overekspresjon [8]. I tillegg er et flertall av metastatiske blæretumorer er blitt vist å uttrykke EGFR [11]. Videre synes EGFR overekspresjon å være en betydelig negativ prediktor for overlevelse [5]. Dermed biologiske pathways som øker vekstfaktor signaliserer gjennom EGFR vil trolig bidra til blærekreft progresjon og metastasering. Cell-bound EGFR-ligander, slik som heparin-bindende epidermal vekstfaktor (HB-EGF), amfiregulin, transformerende vekstfaktor alfa (TGFa), og betacellulin er kjent for å bli sluppet gjennom virkningen av membranbundne proteaser, inkludert medlemmer av ADAM (A disintegrin Og Metalloproteinase) familie [12-14].
ADAM familien består av ca 40 proteiner, men bare et fåtall utstillings proteolytisk aktivitet [15-17]. Det proteolytisk aktive Adams, eller sheddases, trafikk til membranen i en latent form som kan aktiveres ved den proteolytiske avgivelse av en N-terminal hemmende prodomene [12,13]. De enzymatisk aktive protein spaltes og frigjør flere fysiologiske celleoverflateproteiner inkludert membran forankret vekstfaktorer og deres reseptorer, ecto-enzymer, og celleadhesjonsmolekyler som E-cadherin og N-cadherin. Disse funksjonene plassere bestemt Adams i grunnleggende roller for celle signalisering og regulering av celle adhesjon og cellular motilitet [12,15]. Flere Adams har også vært innblandet i menneske tumorigenesis [13,14,16,18,19] og økt uttrykk og funksjon av disse Adams ofte korrelerer med tumorprogresjon og aggressivitet av sykdom [18,20].
En av det katalytisk aktive Adams, ADAM15, har blitt rapportert å være overuttrykt i mange maligniteter, inkludert melanom, prostatakreft og brystkreft [20,21]. Listen av underlag for ADAM15 omfatter flere nøkkelcelle regulatoriske molekyler inkludert E-cadherin og N-cadherin, desmoglein og EGFR-ligander, transformerende vekstfaktor beta (TGFfi), amfiregulin, epiregulin og HB-EGF [16,21,22]. Nivået av overekspresjon av ADAM15 i bryst- og prostatakreft har vært korrelert med tumor aggressivitet og metastatisk progresjon [20]. Vi har vist at inhibering av ADAM15 ekspresjon i PC-3 prostata kreftceller redusert tumorvekst og metastaser forhindres [23]. En kobling mellom ADAM15 og angiogenese har også blitt bemerket [24,25].
De biologiske og molekylære profiler av blærekreft antydet at overekspresjon og aktivering av ADAM15 kan være relevant for utviklingen av denne sykdommen. Først blærekreft uttrykke høye nivåer av EGFR, der lokal frigjøring av EGFR-ligander ville fremme blærekreft vekst [5-7,11]. For det andre, E-cadherin, et annet substrat for ADAM15, har blitt funnet i den enzymatisk behandlet form i både serum og urinprøver fra pasienter med blærekreft som også korrelert med dårlig klinisk resultat [26,27]. Tredje, blærekreft progresjon er nært knyttet til angiogenese [9,28-30], som også kan påvirkes av den biologiske aktiviteten av ADAM15 [24,25].
ADAM15 fremstår som en potensiell regulator av svulstens mikromiljø og sitt løfte for terapeutisk målretting er økende. Foreløpig undersøkelse av ADAM15 ekspresjon i vev, cellelinjer og xenograft-modeller av human kreft (histologisk ligner den primære svulsten) foreslo funksjonell rolle i progresjonen av human blærekreft. Men lite var kjent om uttrykket nivåer av ADAM15 i human blærekreft eller hvordan ADAM15 kan funksjonelt megle invasjonen og metastasering av blære kreft celler. I denne studien har vi satt ut for å validere foreningen av ADAM15 uttrykk med avansert menneskelig blærekreft og etablere funksjonelle deltakelse ADAM15 i utviklingen av denne sykdommen.
Materialer og metoder
Cell Kultur
Menneskelig blære kreft cellelinjer UM-UC-6 [31,32] og UM-UC-9 [32] ble oppnådd fra opphavsmannen (HB Grossman, The University of Texas-MD Anderson Cancer Center, Houston, TX). SV-40 udødeliggjort Menneskelig Uroepithelial Cells (SV-HUC-1) [33] var en slags gave fra CA. Reznikoft (University of Wisconsin, Madison, WI). Etablerte menneske navleveneendotel Cells (HUV-EC-C) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Celler ble benyttet innen kortsiktig passasje og testet av rflp (RFLP) for autentisering (Research Animal Diagnostic Laboratory, Columbia, MO). Celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY), med høy glukose, supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies). De HUV-EC-C-celler ble holdt i endotelcelle vekstmedium EBM-2
TM (Lonza Inc., Allendale, NJ) supplert med EGF ™ -2 BulletKit ™ (Lonza Inc.) og 10% FBS.
Generering av ADAM15 Knockdown cellelinjer
UM-UC-6 og UM-UC-9 ADAM15-knockdown blære kreft celler ble generert ved hjelp av et lentivirus bærer ADAM15 spesifikke knockdown kort hårnål RNA (shRNA) ( shA15), eller tom vektor kontroll sekvens og /eller kryptert shRNA sekvens utformet som en kontroll for off-target effekter (ctlA15) som vi tidligere rapportert [22,23]. Termin og komplementære målsekvenser for ADAM15 var 5′-AACCCAGCTGTCACCCTCGAA-3 «og 5′-TTCGAGGGTGACAGCTGGGTT-3».
Pasientprøver
tumorprøver for dette arbeidet ble oppnådd bevare pasientens konfidensialitet etter skriftlig informert samtykke ved University of Michigan blærekreft Tissue Bank. Hver kilde i samsvar med Medical School Institutional Review Board godkjent protokollen (IRBMED HUM00042401). Vevet microarray besto av 110 kjerner på 37 pasienter med blærekreft, og inkludert prøver fra normal blære samt overfladiske, invasive og metastatisk blærekreft.
Protein Isolering og immunoblotting
Cellene ble høstet etter skraping og den resulterende cellepellet ble vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS), og frosset ved -80 ° C før ekstraksjon. Cellepelletene ble lysert i lyseringsbuffer (50 mM Tris [pH 7,6], 120 mM NaCl, 0,5% NP40, 1 mM EGTA, 100 ug /ml phenylmethysulfonyl fluor, 50 ug /ml aprotinin). Ekstraktene ble fjernet ved sentrifugering ved 10 000 rpm i 10 minutter, og supernatantene ble samlet opp og protein ble kvantifisert ved anvendelse av Bradford-proteinanalysen (Bio-Rad, Hercules, CA). Cellulære ekstrakter (20 ug /felt) ble deretter separert på pre-støpt gradient 4-20% Tris-glysin SDS-polyakrylamid-geler (Novex, Life Technologies, Carlsbad, CA) og overført til en forsterket 0,2 pm nitrocellulosemembran (EMD Millipore, Billerica, MA). Membranene ble deretter blokkert, undersøkt, og utviklet. Blokkering buffer besto av 10% fettfri tørrmelk i TBST (Tris bufret saltvann med 0,1% Tween 20, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Primære og sekundære antistoff inkubering ble utført i 2,5% fettfri tørrmelk i TBST. Primære antistoffer mot GAPDH (mus monoklonalt MAB374 antistoff, mye 2.322.571, EMD Millipore, Billerica, MA) og ADAM15 (kanin polyklonale AB19036 antistoff, Lot 2316790, EMD Millipore) ble benyttet ved siste fortynning 1: henholdsvis 2000,: 10 000 og 1. De sekundære antistoffer ble geit anti-mus IRDye
TM 680RD 1: 5000 (926-68070, mye C30502-01, Li-Cor, Lincoln, NE) og geit anti-kanin IRDye
TM 800CW 1: 10000 ( C30521-01, mye C30521-01, Li-Cor). Membraner ble fotografert med Li-Cor Odyssey CLX
TM (Li-Cor, Lincoln, NE) etter produsentens anvisninger.
Immunohistochemistry
Parafin vevssnitt ble deparaffinized og behandlet med peroksyd i metanol for å blokkere endogen peroksyd aktivitet. Antigen henting ble utført ved hjelp av citratbuffer antigen gjenfinning følge produsentens prosedyre (Citra, Biogenex, San Ramon, California). Immunfarging ble utført ved anvendelse av avidin-biotin-kompleks farging (ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Primært kanin-polyklonalt antistoff mot ADAM15 (AB19035, mye 0603024760, EMD Millipore) ble fortynnet 1:50 i 5% FBS i PBS. En pre-fortynnet kanin isotype-oppløsning (Life Technologies, Carlsbad, CA) ble anvendt som en negativ kontroll. Reaksjonen ble fullført ved utvikling i 5 minutter med substrat (3,3′-diaminobenzidin pluss peroksyd). Glassene ble deretter kontra med hematoksylin. Lysbilder ble evaluert av en patolog (LPK) og gradert til farging intensitet (på en 1-4 skala, 1 = negativ, 2 = svak, 3 = middels, 4 = sterk) og prosentandel av tumorceller farging. En «intensitet» (fargeintensitet multiplisert med prosentandelen av celler flekker) ble brukt til å sammenligne resultatene.
Wound Healing analysen
UM-UC-9 og UM-UC-6 celler sådd ut i 6-brønns vevskulturskåler og tillatt å nå konfluens. Monolaget av celler ble skrapet med en ny 5 ml pipette over midten av brønnene for å danne et kors. Etter riper, ble brønnene forsiktig vasket to ganger med medium for å fjerne de frigjorte celler og deretter etterfylt med frisk DMEM supplert med 10% FBS. Bildene ble tatt og digitalisert for å dokumentere den første sprekken. UM-UC-9 og UM-UC-6-celler ble deretter inkubert i 18-20 og 12 timer henholdsvis. Bildene ble tatt og digitalisert for å dokumentere migrasjon. Den helbredende gapet ble målt av Image Analysis Software
TM fra Olympus (Olympus Corporation, Center Valley, PA).
Matrigel
TM Invasion Chamber analysen
BD BioCoat
TM Matrigel
TM Invasion Chambers (BD Biosciences, Bedford, MA) ble benyttet. De 24-brønns kamre ble rehydrert med PBS og ctlA15 og sh15 UM-UC-9 eller UM-UC-6-celler ble sådd ut på kamrene, i henhold til produsentens prosedyre (BD Biosciences). Et volum på 0,2 ml cellesuspensjon inneholdende 1×10
5 celler /ml i serumfritt medium ble tilsatt til hver pakning. Et volum på 0,5 ml DMEM pluss 10% FBS ble tilsatt til den mindreverdige brønnen. Chambers ble inkubert ved 37 ° C, ble 5% CO
2 atmosfære og UM-UC-9 og UM-UC-6 cellene tillatt å migrere mot en serum-gradient i en periode på 24 eller 12 timer henholdsvis. Etter inkubasjon ble ikke-invaderende celler fjernes fra den øvre overflaten av innsatsen membran med bomulls tippet applikatorer. Cellene på den nedre overflate av membranen ble fiksert med 10% formalin og farget med krystallfiolett (BD Bioscience). Celletelling ble utført fra photomicrographs av 3-5 felt per innsats. Hver av cellelinjer ble analysert minst tre ganger.
Transendothelial Migration analysen
BD BioCoat
TM innstikk og 24-brønners plater (BD Biosciences) ble benyttet for transendothelial migrasjon analysen. Fibronektin ble tilsatt for å belegge hver innsats (Sigma-Aldrich Co.) ved en konsentrasjon på 50 ug /ml. HUV-EC-C-endoteliale celler ble deretter sådd ut på innsatsen i en konsentrasjon på 1×10
5 celler /250 ul EBM-2-medium pluss kosttilskudd. HUV-EC-C-celler ble inkubert i 48 timer for å danne et monolag. UM-UC-9 og UM-UC-6, ctlA15 og shA15, cellene ble opprettholdt i 24 timer og sådd ut på invasjonen setter inn ved en densitet på 1×10
5 celler /250 ul i serumfritt medium. Kontroll innskudd ble lastet med medium for å vurdere den vandrende bakgrunn av endotelcellene. Det nedre kammer ble fylt med 300 ul av EBM-2 pluss 10% FBS. Kamrene ble deretter inkubert for å tillate tumorcellene til å migrere gjennom den endoteliale lag mot et serum-gradient. UM-UC-9-celler ble inkubert i 24 og UM-UC-6 i en periode på 12 timer. Non-transmigratory celler ble fjernet med en bomullspinne. Deretter ble den vandrende tumorceller fiksert med 10% formalin og farget med krystallfiolett og fotografert for å kvantifisere tumorcellemigrering. Tre felt per innsats ble fotografert og cellene telles med hjelp av ImageJ [34]. Hver tilstand ble kjørt i tre eksemplarer.
Struktur basert design av en ny kjemisk Inhibitor Målrette Catalytic Domain of ADAM15
Den katalytiske stedet av ADAM15 er unik og antyder muligheten for å designe nye kjemiske sonder som er selektive for ADAM15-metalloproteinase-aktivitet. Denne tilnærmingen førte til tidlig identifisering og validering av den ikke-spesifikke inhibitor, marimastat, som en strukturell sonde med utmerket forutsagte bindings og hemmende potensiale mot det aktive sete av ADAM15. Ytterligere strukturell modellering førte til identifisering av den bifenylsulfonamid-metalloproteinase-inhibitor, PD166793 [35], som er utstyrt med en rekke egenskaper som gjør det til et attraktivt utgangspunkt for analog syntese av ADAM15 prober. Foreløpig struktur-basert design, tar hensyn til de unike amphipathic egenskapene til ADAM15 S1 «lomme, tillot oss å designe og syntetisere en ny lead compound, adamastat, som er utformet som en selektiv probe for ADAM15. Optimale bindende moduser og relative bindende energier av vår ADAM15 metalloproteinaseinhibitor inhibitor ble beregnet ved hjelp av allment akseptert Autodock Vina program for molekylær docking og virtuelle screening [36] som er representert i S1 tabell. Disse beregningene, spår at adamastat bør binde selektivt og med høy affinitet til det katalytiske sete av ADAM15.
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Analyse
Aktiviteten av rekombinant ADAM15 katalytisk domene (A15cat) ble bestemt ved å bruke FRET baserte analyser som måler spaltning av et fluorogent substrat ADAM15 peptid. Inhibering av den katalytiske aktiviteten til A15cat ved marimastat, PD166793 og adamastat ble bestemt ved anvendelse av et fluorogent peptid (dabcyl-HGDQMAQKSK (5FAM-NH2) avledet fra ADAM15 spaltingssete i lav-affinitets IgE-reseptoren (CD23) [37]. I disse forsøk substratet ved en konsentrasjon på 1 uM ble inkubert med rekombinant A15cat (0,5 ug /ml) i 24 timer ved 24 ° C i 384-brønners plater (Corning, Corning, NY) med inhibitoren i fosfatbufrede saltløsninger. Fluorescens ble målt ved anvendelse av en PHERAstar (BMG LABTECH Inc., Cary, NC) fluorescens plateleser (eksitasjon ved 485 nm og emisjon ved 530 nm).
Cell Proliferation Analyse
for å studere effekten av våre ADAM15 knockdowns på celleproliferasjon, ctlA15 og shA15 UM-UC-9 og UM-UC-6, celler ble sådd i 96-brønns plater ved en densitet på 1,000 og 500 celler /henholdsvis brønn i 200 ul medium. Endepunktene punktene~~POS=HEADCOMP ble vurdert etter 12, 24, 48 og 72 timers inkubering.
på en lignende måte, den anti-proliferative effekt av adamastat ble analysert ved utsåing SV-HUC-1, UM-UC-9 og UM-UC-6 celler ved en konsentrasjon på 2000, 1000 og 500 celler /brønn henholdsvis i 100 ul medium. Cellene ble latt bli tilkoblet over natt og behandlet med 100 ul /brønn av en 2X adamastat løsning (ved 5 uM sluttkonsentrasjon) eller tilsvarende konsentrasjon av DMSO som vehikkelkontroll. Følgelig ble cellene plassert i inkubator i 12, 24, 48, 72, 96 og 120 timer.
celle proliferasjon ble bestemt på hvert tidspunkt ved bioreduction av en vannoppløselig MTS tetrazolium (3- (4,5 -dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium) salt til dens formazanprodukt av metabolsk aktive celler [38]. Etter tilsetning av 40 ul av MTS /fenazin metosulfat (PMS) (20: 1) oppløsning (Promega, Madison, WI), ble cellene inkubert i 2 timer ved 37 ° C og absorbansen til formazan-produkt ble målt ved 490 nm .
celleviabilitet analyse
SV-HUC-en, ble UM-UC-9 og UM-UC-6 celler sådd ut i 96-brønners plater i en konsentrasjon på 2000, 1000 eller 500 celler /henholdsvis brønn i 100 ul DMEM pluss 10% FBS (uten fenolrødt). Etter inkubering i 24 timer, ble cellene behandlet med en sluttkonsentrasjon på 0,1% DMSO (bærerkontroll), 0,1, 1, 10 eller 100 uM adamastat i 100 ul medium og inkubert i 96 timer. Deretter ble 40 ul av MTS /PMS-oppløsning tilsatt til hver brønn og absorbansen ved 490 nm ble målt etter 2 timers inkubering ved 37 ° C [38]. Analysen ble utført i triplikate brønner. Tomme brønner, kun medium og 2,5 uM staurosporin (Sigma-Aldrich) ble inkludert som kontroller. Celleviabilitet (%) var vurderer som: (OD sample-OD staurosporin) /(OD mellom OD staurosporin) × 100.
tumorvekst i alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) Mus
Å studere effekten av stanse ADAM15 på blærekreft vekst, ctlA15 og shA15 UM-UC-6-celler ble subkutant inokulert ved en konsentrasjon på 1×10
6 celler i C57BL /6 SCID-mus, i to grupper på 10 mus. For å bestemme prøvestørrelse for adamastat
in vivo eksperimenter
vi brukte formelen: (n = log 0,10 sannsynlighet for type II feil dividert med 95% sannsynlighet for å detektere en vektforskjell på 40% eller mer Tilkopling 0,10 delt. ved log 0.6 = 4.5 mus pr gruppe), og dermed de 5 mus pr gruppe anvendt i forsøket. Etter 3 uker ble musene avlivet og tumorene veies.
In vivo
effekten av adamastat ble også bestemt i UM-UC-6 transplantater, der 1×10
6 UM-UC-6 blære tumorceller ble injisert subkutant i flanken av SCID-mus. I lys av den forutsagte adamastat oral tilgjengelighet, ble dyrene behandlet ved gavage med adamastat etter tumorstart (10 dager etter injeksjon). Musene ble delt i to grupper på 5 dyr og behandlet daglig med adamastat (100 mg /kg /dose) eller bærerkontroll (PBS) i 3 uker før nekropsi. Hver tumor ble resekterte og veide samtidig post mortem. Den eksperimentelle enheten var en svulst per mus og alle svulster (100%) ble inkludert i analysen.
Antall dyr inkludert ble tidligere utledet ved observasjon av det minste beløpet som kunne presentere statistisk signifikans under eksperimentelle forhold. Alle gruppene ble tilfeldig isolert av buret. Kreftcelle inokulering eller adamastat behandling ble startet på samme tid. Musene viste ikke vekttap og ingen bivirkninger på grunn adamastast eller sonde teknikken ble observert.
De SCID mus brukt i denne studien var menn og kvinner, 8 til 10 uker gamle, oppdrettet av den Ulam Avl Kjerne. Dyrene ble plassert i et patogen gratis anlegget i ventilerte bur. Deres velferd ble vurdert daglig av forfatterne og veterinær ansatte ved University of Michigan.
Etikk erklæringen.
Omsorg og behandling av musene ble anmeldt av Universitetet komité for bruk og vedlikehold av Dyr (UCUCA) og ble funnet å være i overensstemmelse med University of Michigan institusjonelle retningslinjer. University of Michigan UCUCA godkjent disse dyrestudier ved protokollen PRO00004867. Inokulering av tumorceller ble utført under bedøvelse isofluorane for å minimere lidelse. Alle prosedyrer følge de ankommer retningslinjer for rapportering av dyreforsøk som beskrevet i S1 ANKOMMER sjekkliste.
Statistical Analysis
I vev microarray analyse, score en fargeindeks (intensitet multiplisert med prosentandelen av kreftceller farging) ble beregnet for hver kjerne. Flere kjerner av samme klinisk stadium fra den samme pasient ble slått sammen til et sammendrag poengsum som representerer middelverdien av kjernene. Dette sammendraget resulterte i 48 datapunkter (tilsvarende unike pasient-diagnose kombinasjoner) for ADAM15 farging evaluering. En enveis ANOVA ble brukt til å sammenligne flekker indeksen sammendraget poengsum scenen. Alle parvise sammenligninger ble gjort mellom grupper som bruker Tukey-Kramer metode for å korrigere for multiple sammenligninger. Svakheten til ANOVA modellen er at det kan være sammenheng i pasient som ikke er regnskapsført med denne metoden. En gjentatt tiltak modell ved hjelp av farging indeks for hver kjerne individuelt med korrelasjons strukturer for å redegjøre for de gjentatte kjerner innenfor pasient og diagnose ble brukt til å kontrollere resultatene av ANOVA sammendraget poengsum modell. Denne modellen brøt normalitet forutsetninger, men hadde lignende resultater og de samme konklusjonene. For enkelhets skyld er ANOVA resultatene vises. Uparet, 2-tailed t-tester ble benyttet for å bestemme om statistisk signifikante forskjeller ble observert i sårheling, invasjon, migrasjon, og
in vivo
mus xenograft eksperimenter. Spredning og celleviabilitet resultatene ble evaluert ved to-veis ANOVA og tyrkiske multiple sammenligningstester. Analysene ble utført ved hjelp GraphPad Prism 6 programvare (La Jolla, California). Data ble ansett som statistisk signifikant på
p
. 0,05
Resultater
ADAM15 Expression er assosiert med lokal invasjon og metastatisk progresjon av menneskelig blærekreft
Vi hadde tidligere rapportert at uttrykket av ADAM15 ble assosiert med metastatisk progresjon av bryst og prostata kreft [20]. Imidlertid er rollen til ADAM15 i progresjonen av blærekreft hadde ikke blitt undersøkt. Vi begynte denne studien ved kartlegging av Oncomine
TM (Compendia Bioscience, Ann Arbor, Michigan) genuttrykk database for å vurdere DNA kopiantall og mRNA nivåer av ADAM15 i humane blærekreft arrays. En analyse av 191 prøver avslørte at ADAM15 kopiantall er signifikant forhøyet i avansert N stadium (N1 +) invasiv blærekreft sammenlignet med ikke-invasiv (N0) sykdom. Av de 18,823 analyserte genene, ADAM15 rangert som den 45
th høyeste i kopiantall eller i topp 5% (fig 1A). Ved videre analyse av 3 uavhengige transkriptom studier i Oncomine
TM (Sanchez, Lee og Blaveri), fant vi betydelig overekspresjon av ADAM15 mRNA i infiltrere blærekreft sammenlignet med normalt vev (fig 1b).
Analyse utnytte Oncomine
TM (Compendia Bioscience) genet nettleser.
A)
boksplott oppsummere gjennomsnittlig kopiantall og standardavvik (SD) av en blærekreft genekspresjon datasett. ADAM15 kopiantall ble forhøyet i invasiv blærekreft (N1 +) sammenlignet med ikke-invasiv sykdom (N0).
B)
ADAM15 mRNA er overuttrykt i invasiv blærekreft sammenlignet med ikke-invasiv blærekreft. Barer representerer ADAM15 mRNA nivåer i tre forskjellige publiserte mRNA uttrykk studier.
C)
microphotographs av ADAM15 immuno-farging av en blærekreft progresjon vev arrays. Tre patologiske stadier er representert (normalt vev, ikke-invasiv og invasiv blærekreft).
D)
boksplott, er ADAM15 flekker indeksen i denne TMA som gjennomsnitt ± SD. Invasive og metastatisk blærekreft prøvene viste signifikant økning farging indeks sammenlignet med ikke-invasiv sykdom.
Betydningen av disse observasjonene til blærekreft progresjon ble validert ved evaluering av ADAM15 protein uttrykk i kliniske prøver. Farging av blærekreft vev microarray ble utført, viser spesifikt fokus overekspresjon av ADAM15 i flertallet av avansert (invasive og metastatisk) blærekreft prøver. Til sammenligning, alle av den lave grad og ikke-invasiv blærekreft prøver (27/27), oppviste lav ADAM15 farging indeks (0-2), mens 48% (27/56) av invasiv og 72% (13/18) av metastatisk tilfeller viste moderat til høy flekker indeks (2-4) (tabell 1). En nærmere histologisk evaluering viste at ADAM15 lokaliserer i normal urothelium med en svært organisert flekker på celle veikryss, og økt positivitet på paraplyen celle luminal overflaten (Fig 1 C). I kontrast, invasive kreftprøver viste en mer uorganisert og cytoplasma farging av ADAM15. Den ADAM15 immuno-positivitet økt i avansert stadium (figur 1D) og var betydelig større som svulstene gått fra ikke-invasiv til invasiv og metastatisk sykdom. Samlet utgjør disse resultatene viste at ADAM15 overekspresjon er nært knyttet til det lokale invasjon og metastatisk progresjon av menneskelig blærekreft.
knockdown av ADAM15 Reduserer Migration av blærekreft Cells
Cellular motilitet er nødvendig for tumorinvasjon og metastase. Vi undersøkte den endogene uttrykk for ADAM15 i to blærekreft cellemodeller og analysert hvorvidt reduksjonen i ADAM15 uttrykk hemmer blære svulst cellemotilitet. Utnytte overgangscellekreft linjer UM-UC-9 og UM-UC-6 [31,32], vurdert vi ADAM15 protein nivå ved immunoblot analyse ved hjelp av et cytoplasma-spesifikt antistoff mot ADAM15. UM-UC-9 og UM-UC-6 blærekreftceller uttrykte moderate nivåer av ADAM15 protein når normalisert til GAPDH lasting kontroller (figur 2A, S1 Fig og S2 Fig).
