Abstract
HSP90-hemmere er for tiden under klinisk evaluering i kombinasjon med antimitotiske narkotika i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), men lite er kjent om den cellulære virkningene av denne romanen legemiddelkombinasjonen. Derfor, undersøkte vi den molekylære virkningsmekanismen til IPI-504 (retaspimycin HCl), en potent og selektiv inhibitor av HSP90, i kombinasjon med mikrotubuli målsøkende middel (MTA) docetaxel, i prekliniske modeller for NSCLC. Vi identifiserte en undergruppe av NSCLC cellelinjer der disse stoffene virker i synergi for å forbedre celledød. Xenograft-modeller av NSCLC viste tumorvekst-inhibering, og i noen tilfeller, regresjon i respons til kombinasjonsbehandling. Behandling med IPI-504 forbedret antimitotiske virkninger av docetaxel som fører til den hypotese at den mitotiske sjekkpunktet er nødvendig for respons til medikamentkombinasjon. Støtte denne hypotesen, og overstyrer sjekkpunkt med en Aurora kinase inhibitor redusert celledød synergi av IPI-504 og docetaxel. For å undersøke molekylære grunnlaget for synergi, en objektiv stabile isotoper merking av aminosyrer i cellekultur (SILAC) proteomikk tilnærmingen ble ansatt. Flere mitotiske regulatorer, herunder komponenter i ubiquitin ligase, anafase fremme kompleks (APC /C), ble spesifikt nedregulert i respons til kombinasjonsbehandling. Tap av APC /C ved RNAi lysfølsomt celler til docetaxel og forbedret sine antimitotiske effekter. Behandling med en PLK1 inhibitor (BI2536) også sensibilisert celler til IPI-504, noe som indikerer at kombinasjonseffekter kan være bredt aktuelt for andre klasser av mitotiske inhibitorer. Våre data gir et preklinisk begrunnelsen for å teste kombinasjonen av IPI-504 og docetaxel i NSCLC
Citation. O’Connell BC, O’Callaghan K, Tillotson B, Douglas M, Hafeez N, West KA, et al. (2014) HSP90 Hemming Forbedrer antimitosemekanisme Drug-Induced mitotisk stopp og celledød i prekliniske modeller for ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 9 (12): e115228. doi: 10,1371 /journal.pone.0115228
Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 23 juli 2014; Godkjent: 20 november 2014; Publisert: 26.12.2014
Copyright: © 2014 O’Connell et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser: Forfatterne ønsker videre å avklare at på tid arbeidet ble gjort forfatterne var ansatte og aksjonærene i Infinity Pharmaceuticals, Inc. Dette endrer ikke sin tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
mitotisk, eller spindelenheten sjekkpunkt hjelper opprettholde genomisk integritet ved å hindre missegregation av kromosomer. Et sterkt orkestrert overvåkningssystem som består av en rekke proteiner oppdager fristilt kinetochores, eller mangel på riktig spenning over mitotisk spindel, utløser den såkalte «sjekkpunkt svar», noe som fører til mitotisk arrest. Normal celledeling krever vellykket passasje gjennom den mitotiske sjekkpunkt. Unnlatelse av å tilfredsstille sjekkpunkt krav innenfor en relativt kort tidsramme (1-2 dager) kan resultere i Aneuploidy, mitotisk katastrofe, eller mitotisk glidning etterfulgt av en rekke celle skjebner inkludert celledød, senescence, eller endoreduplication [1]. Mens de mekanismer som langvarig mitose fører til celledød er uklare, en rolle for de anti-apoptotiske BCL2 familiemedlemmer har blitt rapportert [2]. Under langvarig mitotisk arrest, cyclin-cyclin avhengig kinase (CDK) proteiner phosphorylate
BCL2
familiemedlemmer, inkludert BCL2, BCL-XL, og MCL1. Fosforylering av BCL2 og BCL-XL resulterer i utslipp av pro-apoptotiske proteiner BAX /BAK; mens fosforylering av MCL1 skaper et gjenkjenningssete for E3 ligase, APC /CDC20, rettet det for proteasomal degradering. Funksjonell redundans er sannsynlig å eksistere mellom
BCL2
familiemedlemmer i å formidle celledød respons på langvarig mitose.
antimitosemekanisme medikamenter som mål mikrotubulidynamikk (MTAS) er mye brukt i klinikken for å behandle et bredt spekter av kreft. Disse inkluderer mikrotubulidynamikk stabiliseringsmidler, (taxaner, inkludert docetaxel og paclitaxel og epotiloner) og mikrotubulidynamikk destabiliserende midler (inkludert vinka alkaloider som vinkristin og vinblastin) [3]. I tillegg Maytansines (DM1, DM4) og Auristatins (MMAE, MMAF) kommuniserer med vinca bindingssetet på tubulin, og blir ofte brukt som toksinet er festet til antistoffet medikamentkonjugater [4]. Mens delende tumorceller er utsatt for MTAer, andre mikrotubul-avhengige cellulære prosesser som vesikkel trafikk, neuronal transport, og cytoskeletal integritet også forstyrret, noe som fører til uønskede bivirkninger, inkludert nevrotoksisitet og myeloid toksisitet [5]. I et forsøk på å overvinne disse bivirkningene, antimitotiske legemidler som er rettet mot spindel motor proteiner (KSP, EG5) eller mitotiske kinaser (PLK1, Aurora Kinase A, Aurora kinase) er under utvikling, men har møtt med begrenset suksess så langt i klinikk [6]. HSP90 er en molekylær anstand som er ansvarlig for riktig folding av mange klient proteiner, inkludert mange onkogener og muterte kreftdempere [7]. Den HSP90-inhibitor IPI-504 har vist antineoplastisk aktivitet i flere prekliniske modeller for kreft, gir begrunnelse for sin videre klinisk utvikling [7], [8], [9], [10], [11]. Interessant nok har synergistisk aktivitet mellom HSP90 hemming og taxaner blitt observert i prekliniske modeller for NSCLC [12] og HSP90-hemmere har blitt evaluert i kombinasjon med docetaxel i kliniske studier av NSCLC (NCT01646125, NCT01348126, NCT01798485, NCT01362400). Vi identifiserte en undergruppe av NSCLC cellelinjer som IPI-504 og docetaxel handle i synergi for å forbedre celledød in vitro og hemme tumorvekst in vivo. Fordi det nøyaktige molekylære grunnlaget for denne synergi ikke er fastsatt, undersøkte vi den molekylære virkningsmekanismen (MOA) av IPI-504 i kombinasjon med docetaxel og andre antimitotics. Våre studier avdekket en MOA involverer et sjekkpunkt avhengig forlengelse av mitose. Videre har vi identifisert APC /C komponenter som potensielle nye HSP90 klient proteiner, delvis ansvarlig for stoffet synergi.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne undersøkelsen ble gjennomført i tråd med anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr skrevet ut av National Research Council of National Akademik. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) på Infinity Pharmaceuticals, ble Inc. Dyr avlivet av CO
2 innånding ifølge IACUC retningslinjer. Hver innsats ble gjort for å minimalisere dyrs lidelse.
Cellelinjer
Menneske NSCLC cellelinjer H292, A549, H522, H1993, H1793 hentet fra American Type Culture Collection ble opprettholdt i flere passasjer under 5% CO
2 ved 37 ° C i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich).
Dyreforsøk
fem til seks uker gamle nu NCR /nu atymiske mus ble kjøpt fra Taconic Farms. Xenotransplantater ble samlet ved subkutan implantasjon av fra 1 til 5 x 10
6 celler i høyre flanke av mus, og behandlingen ble startet når tumorene nådde et gjennomsnittlig volum på 120 til 300 mm
3. IPI-504 ble gitt intra-peritonealt to ganger per uke i en dose på 50 mg /kg. Docetaxel (McKeeson Pharmaceuticals) ble dosert en gang per uke ved 15 mg /kg (H1993, A549 og H292-xenograft-modeller) eller 5 mg /kg (H292 xenograft modell) ved intraperitoneal injeksjon.
Tumorene ble målt tre ganger per uke ved hjelp av digitale calipers og tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen: (lengde x bredde
2) /2. Resultatene er presentert som gjennomsnittlig tumorvolum ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM).
Celleproliferasjon
Celler ble sådd i 96-brønns plater ved en densitet på 5000 celler /brønn 24 timer før til behandling med kombinasjoner av IPI-504 og docetaxel som angitt. Celleproliferasjon ble målt ved Alamar Blå (Life Technologies) eller Cell Titer Glo (Promega). Celledød ble målt ved prosentandelen av positive celler (7AAD Guava Viacount Flex) eller ved prosentandelen av spaltede kaspase 3-positive celler i en luminescens basert assay (Promega; Caspase-Glo3 /7)
synergi studier
Kombinasjon indekser (CI) ble bestemt ved metoden Chou og Talalay [13] med faste og ikke-faste legemiddel forholdstall og CalcuSyn programvare (Biosoft). CI-verdier mindre enn 1 indikerer synergi, med verdier. 0,5 indikerer robust synergi
Immunoblotting /Immunpresipitasjon
For immunoblotting ble cellene lysert i RIPA lysebuffer (Sigma-Aldrich) supplert med protease hemmere (Roche) og fosfatase hemmere (stans; Thermo Fisher Scientific). For HSP90 immunoutfellinger, ble cellepelletene høstet etterbehandlingsapparatet i ikke-detergent lyseringsbuffer (50 mM Tris pH 7,4, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl
2, 1 mM EDTA, 10% glycerol, protease-inhibitor tablett (Roche) og fosfatase hemmere (Thermo Fisher Scientific)) etterfulgt av tre sekvensielle fryse tine sykluser for lysering. Immunoutfellinger ble utført over natten ved 4 ° C ved hjelp av en HSP90 monoklonalt antistoff (Santa Cruz) og Sepharose GammaBind G perler (GE Healthcare).
stabile isotoper Merking av aminosyrer i kultur (SILAC) merking og massespektrometri
Metabolsk merking av H292-celler ble utført med normal arginin og lysin eller tyngre isotoper varianter av de to aminosyrene L-lysin-HCl [
13C
6], L-arginin-HCI [
13C
6
15N
4] med Invitrogen sin SILAC-Flex Media kit og tung arginin kjøpt fra Thermo Fisher Scientific. For å redusere kompleksiteten prøven, ble HSP90 immunoutfellinger utført på legemiddelbehandlede celler, og proteinene ble separert ved 1D-SDS-PAGE. Proteiner fra gel Skivene ble spaltet ved hjelp av svine-trypsin og analysert ved LC-MS /MS. Peptider ble ryddet opp og konsentreres ved hjelp av C18 scenen tips (Proxeon) og separert ved hjelp av online C18 revers-fase nanoskala væskekromatografi tandem massespektrometri på en Surveyor MS pumpe koblet til en LTQ-Orbitrap XL (Thermo Fischer Scientific) med en 2 h lineær gradient . Fragmentering av de 10 beste peptider i hver prøve ble utført ved kollisjon indusert dissosiasjon. Raw MS-filer fra LTQ-orbitrap ble analysert ved hjelp MaxQuant (versjon 1.2.2.4) [14]. MS /MS spektra ble søkt mot lokkefugl IPI-menneskelig database versjon 3.68 med Andromeda søkemotor. En falsk funnrate på 0,01 ble brukt på begge peptid og protein nivå.
RNAi studier
H292-celler ble transfektert med 30 nM siRNA hjelp RNAimax (Invitrogen). sirnas ble kjøpt fra Thermo Fisher Scientific som på målet pluss SMART bassenger (blanding av 4 individuelle siRNAs per genet). SMART basseng siRNA sekvenser er: ikke-targeting (kryptert) kontroll: UGGUUUACAUGUCGACUAA, UGGUUUACAUGUUGUGUGA, UGGUUUACAUGUUUUCUGA, UGGUUUACAUGUUUUCCUA; ANAPC3: GGAAAUAGCCGAGAGGUAA, CAAAAGAGCCUUAGUUUAA, AAUGAUAGCCUGGAAAUUA, GCAUAUAGACUCUUGAAAG; og ANAPC4: GCCAGAAAGUUUACUCAUA, GAUGAACAGUGUAGUGCUA, ACACGUAGAUUGUUCAAAU, CGCUUUAGCUCCAGAGAUA. Fire timer etter transfeksjon ble cellene sådd ut i 96-brønners plater, ble behandlet med en dose titrering av docetaxel og høstet for flowcytometri (pH 3) eller celleformering (7AAD) 30 timer eller 72 timer etter behandling, henholdsvis.
Strømningscytometri
Cellepelleter ble oppsamlet ved trypsinering, fiksert i 4% paraformaldehyd ved 37 ° C i 15 minutter og plassert på is i 5 minutter, og deretter pelletert og resuspendert i iskald metanol i 30 min videre is. Deretter ble cellepelletene ble vasket i 1% bovint serum albumin (BSA) i PBS to ganger etterfulgt av inkubering med FITC-konjugert pH 3 antistoff i 2 timer RT. Cellepelletene ble vasket to ganger med 1% BSA /PBS og resuspendert i 2 ug /ml Hoechst (Molecular Probes) /PBS ved 37 ° C i 15 min. Fargede celler ble analysert ved hjelp av en BD LSRII Fortessa strømningscytometer. FITC-positive celler ble målt ved en bølgelengde på 488 nm, og DNA-innhold ble målt ved Hoechst farging ved anvendelse av en UV-laser. Dataanalyse ble utført ved hjelp FlowJo programvare (V7.6.3).
Mikros
fasekontrast bildene ble tatt med et Nikon Eclipse TE2000-S mikroskop og Spot programvare for bildeopptak (v4.7) .
Mitotisk riste-off
mitotiske celler ble høstet ved manuell tapping av kolben for å fjerne mitotiske celler i suspensjon. Mitotiske celler ble isolert fra mediet ved sentrifugering (1500 rpm, 5 min), lysert i RIPA-buffer og inkubert i nærvær eller fravær av alkalisk fosfatase (Sigma-Aldrich).
Antistoffer og reagenser
Antistoffer for HSP90 (Santa Cruz), HSP70 (Santa Cruz), cyclin B (BD Biosciences), Securin (Abcam), ANAPC3 (Bethyl Laboratories), ANAPC4 (Bethyl Laboratories), Aurora kinase B (Bethyl Laboratories), MCL1 ( Cell Signaling Technology), GAPDH (Cell Signaling Technology), Glukokortikoid Receptor (Cell Signaling Technology), og FITC-S10 fosfor-Histone H3 (Cell Signaling Technology) ble brukt for immunpresipitering, immunoblotting og flowcytometri. Aurora A /B-hemmer (ZM447439) ble kjøpt fra EMD Millipore og PLK1 inhibitor (BI2536) ble kjøpt fra SelleckChem. IPI-504 ble syntetisert på Infinity Pharmaceuticals, Inc.
Resultater
IPI-504 og docetaxel i kombinasjon undertrykke tumorvekst i NSCLC svulst xenograft modeller
For å identifisere NSCLC cellelinjer demonstrere in vivo følsomhet for kombinasjonen av IPI-504 og docetaxel, mus med xenografttumorer (H1993, A549, H522 og H292) ble behandlet med kjøretøy, 50 mg /kg IPI-504 alene, 5 eller 15 mg /kg docetaxel alene, eller en kombinasjon av 50 mg /kg IPI-504 og 5 eller 15 mg /kg docetaxel. Behandling med IPI-504 alene hemmet tumorvekst i forhold til kjøretøy i H1993, A549, og H292 xenografter (22-48%), men hadde ingen aktivitet i H522 xenografter (Fig. 1). Mono aktivitet ble observert etter behandling med docetaxel, hvilket resulterer i veksthemning sammenlignet med vehikkel i H1993, A549 og H292-xenotransplantater (56-69%) (fig. 1 A-C). I motsetning til den mono aktivitet, ble tumor regresjon observert i respons til kombinert IPI-504 og docetaxel i H1993 og A549 xenograft modeller (Fig.s. 1A og B). Tumorvekst-hemming ble forsterket ved kombinasjonen sammenlignet med hvert enkelt middel alene i H292-xenograft tumorer (Fig. 1C). På grunn av den sterke mono aktivitet i H522 xenograft modell, ble docetakseldosen redusert fra 15 til 5 mg /kg for kombinasjonsstudie. Kombinasjonen av 5 mg /kg docetaxel og 50 mg /kg IPI-504 resulterte i 71% hemning av tumorvekst i forhold til kjøretøy (fig. 1 D). Disse data indikerer potensielle synergistiske effekter av IPI-504 og docetaxel på veksthemming i prekliniske modeller for NSCLC.
NCR nu /nu homozygote hann-mus ble subkutant implantert med (A) H1993, (B) A549, (C ) H292 og (D) H522 celler og behandlet med DMSO kjøretøy (svarte sirkler), IPI-504 (grønne firkanter), DTX (blå diamanter), eller en kombinasjon av IPI-504 og DTX (røde trekanter). IPI-504 ble administrert ved intraperitoneal injeksjon i en dose på 50 mg /kg, to ganger i uken i totalt 6 doser. DTX ble administrert ved 5 mg /kg (H522) eller 15 mg /kg (H1993, A549, H292) ved IP-injeksjon, ukentlig for totalt 3 doser. Tallene på grafene representerer gjennomsnittlig prosent tumorvekstinhibitering forhold til bilens behandlet arm. Hvor indikert, * angir statistisk signifikans (p 0,05) mellom kombinasjonsbehandling og DTX behandlingsarmene målt på dag 30 (H1993, H549, H522) ved hjelp av t-test
IPI-504 og docetaxel. i kombinasjon viser in vitro synergi i NSCLC cellelinjer
for å undersøke MOA av forbedret in vivo tumor hemming med kombinert IPI-504 og docetaxel ble effekten av kombinasjonen på celledød og celleproliferasjon in vitro. For celledød studier i H292-celler, ble kombinasjons indeksene beregnes ved hjelp av ikke-faste stoffet forholdet metode for Chou og Talalay, med CI-verdier lt; 1,0 indikerer synergi [13]. Doser på IPI-504 (75-125 nM) effektive for veksthemming (S1 A Fig.) Var stort sett ineffektive i noe som gir en cytotoksisk respons over kontrollen i H292-celler (fig. 2A, venstre panel). Men å kombinere IPI-504 (75-125 nM) med 50 nM docetaxel økte H292 celledød fra 24% (docetaxel alene) til 61-68% (kombinasjon) med CI-verdier indikerer sterk synergi (CI 0,2). På samme måte, ved å kombinere docetaxel (1 til 4 nM) med 2 uM IPI-504 økte H292 celledød fra 37% (IPI-504 alene) til 63 til 71% (kombinasjon) med CI-verdier som indikerer synergi (CI 0,5) ( fig. 2A, panel til høyre).
(A) Celledød ble målt 48 timer etter behandling med ikke-faste stoffet ratio kombinasjoner av IPI-504 og docetaxel (DTX) ved 7AAD i H292-celler. Kombinasjon indekser (CI) verdiene ble beregnet ved bruk CalcuSyn programvare (Biosoft) med verdiene 0,5 indikerer sterk synergi. Feilfelt representerer standardavvik (n = 4). Verdier for alle kombinasjonsbehandlinger var statistisk signifikant sammenlignet med monoterapi behandlinger som bestemmes av t-test (p 0,01). (B) Celledød ble målt 30 timer etter behandling i H1993 celler ved hjelp av caspase-Glo3 /7 luminescens analysen. Representative data er vist (n = 2). (C) Cellene ble behandlet med faste stoffet forhold mellom IPI-504 og DTX i 72 timer; celleproliferasjon ble målt med Alamar blå. Vist er normaliserte isobologrammer. D = dose, ED
50 = dose som er nødvendig for å oppnå 50% veksthemning. Punkter på kurven refererer til forholdet mellom D /ED
50 for DTX på x-aksen vs D /ED
50 for IPI-504 på y-aksen. Datapunkter som faller på diagonalen representerer additivity; over diagonalen, antagonisme; under diagonalen, synergi. (D) Behandling med PLK1 inhibitor (BI2436) sensitizes H292-celler til IPI-504. H292-celler ble behandlet i 72 timer med en dosetitrering av IPI-504 alene (hvite diamanter) eller i kombinasjon med 5 nM BI2536 (røde firkanter) etterfulgt av celledød assay (7AAD). Feilfelt representerer standardavvik (n = 2).
I H1993 celler, kombinasjoner av lav (2 nM) eller høy (20 nm) doser av docetaxel med doser av IPI-504 representerer EF
20 (14 nM), EC
50 (59 nM), eller EC
80 (255 nM) for veksthemming (S1A fig.) ble undersøkt med hensyn til celledød ved hjelp av en Caspase-Glo3 /7-assay. Økning av 2- til 4-fold i caspase aktivitet ble observert med stoffet kombinasjonen i forhold til monoterapi svar for alle, men den laveste dose kombinasjon av 14 nM IPI-504 og 2 nM docetaxel (Fig. 2B).
for celleproliferasjonsprosesser studier, ble et panel av cellelinjer behandlet med narkotikaforhold faste. En synergistisk respons på legemiddelkombinasjonen ble observert i alle fire cellelinjer som kombinasjonseffekter ble tidligere observert in vivo (Fig 2C,. A549, H1993, H292 og H522). Det var ingen indikasjon på en synergistisk effekt av legemiddelkombinasjonen i H1793-celler, noe som tyder på at visse cellelinjer kan være mottakelig for denne spesifikke kombinasjonen (Fig. 2C). Dessverre er bekreftende xenograft studiene var ikke mulig med H1793, når cellene ikke vokse i enten immunkompromitterte NCR nu /nu eller NOD /SCID-mus. H292-celler ble valgt for de fleste av de etterfølgende mekanistiske undersøkelser, fordi de viste den sterkeste og mest konsekvente synergistisk respons til medikamentkombinasjon in vitro, men andre cellelinjer ble også undersøkt i spesielle tilfeller. Samlet er disse funnene tyder på at noen NSCLC cellelinjer viser markert nedgang i celleproliferasjon og økning i apoptotisk celledød med kombinert IPI-504 og docetaxel behandling sammenlignet med enkle midler alene.
hemmere utformet for å målrette mitotiske kinaser, slik som PLK1, representerer en alternativ klasse av antimitotics til MTAer. PLK1 er en viktig regulator av mitose og en kjent HSP90 samspill protein [15]. En PLK inhibitor (BI2536) stiller ut 10 ganger høyere selektivitet for PLK1 forhold til PLK2 eller PLK3 ble brukt til å undersøke kombinasjonseffekter med IPI-504. Behandling av H292-celler med et EF
50 dose av IPI-504 for veksthemming (175 nM) økt celledød fra 24% når den kombineres med bilen til 45% når den kombineres med en EC
50 dose av BI2536 for vekst hemming (5 nM) (fig. 2D og S1B fig.). Disse dataene er konsistent med hypotesen om at IPI-504 kombinerer med ulike klasser av antimitotics å fremme celledød av uavhengige mekanismer.
IPI-504 og docetaxel kombinasjonsbehandling resulterer i akkumulering av mitotiske celler
gitt at antimitotiske effekten av docetaxel er det molekylære grunnlaget for sin giftighet, testet vi prediksjon at IPI-504 forbedrer antimitotiske effekten av docetaxel. Den mitotiske befolkning, også kjent som mitotisk indeks, målt i H292-celler behandlet ved forskjellige tidspunkter og dose kombinasjoner av IPI-504 og docetaxel. Kombinasjonen av lav dose (2 nM) docetaxel med IPI-504 resulterte i en forbigående økning i mitotisk indeks (10% på 8 timer til 26% ved 30 timer) før retur til basalnivåer (4% ved 48 h) (fig. 3A). I motsetning til dette ble den mitotiske indeksen ikke stige over grunnlinjen i løpet av varigheten av forsøket i celler behandlet med enten IPI-504 eller docetaxel som enkle midler (Fig. 3A). En tilsvarende forbigående økning i mitotisk indeks, etterfulgt av en nedgang ble observert ved behandling av H292-celler med en høy dose av docetaxel (20 nM) som en monoterapi (fig. 3B, venstre panel). Tilsetning av IPI-504 for høy-dose docetaxel økes amplituden og varigheten av mitotisk stopp (fig. 3B, venstre panel). I motsetning til H292-celler, ikke ble observert en økning i mitotisk indeks ved behandling av A549-celler med lav dose (2 nM) docetaxel og IPI-504 kombinasjon (data ikke vist), noe som indikerer at reaksjonen på dette medikamentkombinasjon kan være celle typespesifikk. Imidlertid ble det observert en økning i amplitude og varighet av mitotisk arrest i A549 celler behandlet med høye doser docetaxel (20 nM) og IPI-504 kombinasjoner i forhold til docetaxel alene, kan sammenlignes med det som ble observert i H292-celler (fig. 3B, ikke sant panel). Siden mitotiske effekter observert i kombinasjon med IPI-504 var konsistente på tvers av flere celletyper, ble høydose docetaxel valgt for påfølgende MOA studier.
EF
50 doser for IPI-504 ble bestemt etter 72 timer Cell Titer Glo (S1A fig.). H292 (A, B venstre panel) og A549 (B, panel høyre) celler ble behandlet med DMSO (blå diamanter), IPI-504 (røde firkanter), DTX (grønne trekanter) eller IPI-504 /DTX kombinasjon (lilla sirkler) og høstet på angitte tidspunkter for nærvær av mitotisk markør, pH 3. Representative data vises (n = 2).
Den mitotiske sjekkpunkt er delvis ansvarlig for celledød effektene av IPI-504 og docetaxel
mitotisk arrest foregående celledød i IPI -504 og docetaksel-behandlede celler antydet at aktivering av den mitotiske sjekkpunktet er en viktig determinant for celledød respons. For å teste denne hypotese, ble en selektiv Aurora A /B Aurora-kinase-inhibitor (ZM447439) som benyttes for å overstyre den mitotiske sjekkpunktet i H292-celler behandlet med den IPI-504 og docetaxel kombinasjon. Behandling av H292 celler med ZM447439 resulterte i opphør av IPI-504 og docetaxel-indusert mitotisk sjekkpunkt arrest som bestemmes av en markert nedgang i mitotisk indeks (Fig. 4A, venstre panel). Fase kontrast gitt visuell bekreftelse av rundet opp (mitotiske) celler, fremtredende omtalt i kulturer fra IPI-504 og docetaxel behandlede celler sammenlignet med mer utflatet morfologi av IPI-504, docetaxel, og ZM447439 behandlede celler (fig. 4A, rett panel). For å evaluere effekten av mitotisk sjekkpunkt overstyring, ble celledød målt etter behandling av H292-celler med IPI-504 og docetaxel i nærvær eller fravær av ZM447439 (Fig. 4B). Mens effekten av Aurora kinase hemming på celledød viste variable effekter når de kombineres med enten IPI-504 eller docetaxel som enkle midler (S2 fig.), Behandling med ZM447439 delvis reddet celledød synergi av IPI-504 og docetaxel, redusere andelen av døde celler fra 40% til 22% (fig. 4B). Dette er i overensstemmelse med hypotesen om at den mitotiske sjekkpunktet er delvis ansvarlig for den synergistiske virkning.
H292-celler ble behandlet i 30 timer (A, C) eller 48 timer (b) med den angitte dose kombinasjoner av IPI-504 (175 nM), DTX (20 nM) og Aurora-kinase inhibitor ZM447439 (9 uM). Cellene ble høstet for (A) flowcytometri (pH 3) og fasekontrast-imaging, (B) celledød (7AAD), og (C) immunoblotanalyse. En pil angir en langsom migrerende, fosforylert form av Securin. Feilfelt for mitotisk indeks og celledød representerer standardavvik replikater fra to uavhengige forsøk.
Samtidig med mitotisk arrest, IPI-504 og docetakseldosen kombinasjoner førte til en opphopning av mitotiske proteiner Securin, cyclin B, og AURKB (fig. 4C). Utseendet til en langsom migrerende form for Securin, antas å representere den aktive, fosforylert form [16] ble observert spesielt i celler behandlet med IPI-504 og docetaxel kombinasjon (fig. 4C, pil). Den langsomme migrerende form ble omdannet til fast migrere skjemaet på fosfatase behandling, bekrefter at den langsomme migrerende skjemaet representerer fosforylert form (S3 fig.). Oppheving av den IPI-504 og docetaxel indusert oppregulering av mitotiske proteiner Securin, syklin B, og AURKB ble observert ved samtidig behandling med ZM447439 (fig. 4C). I kontrast, hadde samtidig behandling med ZM447439 ikke oppheve IPI-504 indusert oppregulering av HSP70, en surrogatmarkør for HSP90 hemming [17], noe som indikerer at IPI-504 er fortsatt aktiv i disse cellene.
Det har blitt rapportert at ved langvarig mitotisk stopp, fosforylering av anti-apoptotiske protein MCL1 av syklin B-CDK1 setter i gang sin APC /C-avhengige ødeleggelse, noe som fører til celledød under mitose [18]. Interessant nok var nedregulering av MCL1 protein observert spesielt i H292-celler behandlet med den IPI-504 og docetaxel kombinasjon, en effekt som ble opphevet ved samtidig behandling med en Aurora-kinase-inhibitor (fig. 4C).
anaphase fremme i komplekset (APC /C) komponenter er spesielt utarmet fra HSP90 interactome i IPI-504 og docetaxel behandlede celler
Ved hemming av HSP90, misfoldede klient proteiner tar avstand fra HSP90 og senere er målrettet for proteasome-mediert degradering [19]. For å identifisere potensielle kunde proteiner som bidrar til synergien av IPI-504 og docetaxel ble SILAC utføres og HSP90 samspill proteiner som utgjør «interactome» ble identifisert under forhold med medikamentell behandling ved massespektrometri. Den HSP90 interactome for forover eksperiment hvor H292-celler merket med tunge isotoper av lysin og arginin ble behandlet med en kombinasjon av IPI-504 og docetaksel og H292-celler merket med normal lysin og arginin ble behandlet med vehikkel alene ble undersøkt og sammenlignet med data oppnådd fra det motsatte forsøk hvor H292-celler merket med tunge isotoper ble behandlet med bærer alene og H292-celler merket med de normale isotoper ble behandlet med en kombinasjon av IPI-504 og docetaxel (fig. 5A). Som forventet, Hsp70 ble sterkt oppregulert i HSP90 interactome ved IPI-504 og docetaxel behandling (Fig. 5B) [17]. Likeledes Glucocortocoid reseptor (GR), en kjent HSP90 klient-protein, var sterkt nedregulert fra HSP90 interactome ved kombinasjons-behandling (fig. 5B) [20]. Flere mulige nye HSP90-klient proteiner ble identifisert som ble nedregulert som reaksjon på kombinasjonen, et antall som spiller en rolle i den mitotiske sjekkpunkt respons (S1 tabell). Disse inkluderte to komponenter i APC /C, ANAPC3 og ANAPC4 (Fig. 5B). For å bekrefte SILAC data, ble protein overflod bestemt av western blot analyse av lysates samlet inn fra H292 celler behandlet med IPI-504 og docetaxel i kombinasjon (Fig 5C,.. S4 fig). I likhet med GR, nedregulering av både ANAPC3 og ANAPC4 ble observert ved behandling av H292 med kombinasjonen av IPI-504 og docetaxel i forhold til kjøretøyet (fig. 5C). Oppreguleringen av Hsp70 ble bekreftet ved behandling med IPI-504 alene eller i kombinasjon med docetaxel (fig. 5C) sikret bidraget fra APC /C til celledød synergi med kombinasjoner av IPI-504 og docetaxel ble bedømt ved å undersøke hvorvidt tap av APC /C-komponenter kan erstatte IPI-504 i sensibiliserende celler til docetaxel. APC /C komponenter ANAPC3 og ANAPC4 ble slått ned med siRNA enkeltvis eller i kombinasjon, og effektene på celleproliferasjon ble målt etter docetaxel behandling. Ved konsentrasjoner av docetaxel er større enn 5 nM, platået av celledød økte fra 63% i det forvrengte siRNA kontroll, til 73% ved ANAPC4 knockdown, og 80% ved ANAPC3 knockdown alene eller i kombinasjon med ANAPC4 knockdown (fig. 5D, venstre panel). Tap av APC /C-komponenter forbedret antimitotiske effekten av docetaxel, økt mitotisk indeks fra 17% med docetaxel (10 nM) alene til 33% når den kombineres med ANAPC3 /ANAPC4 tap (Fig. 5D, panel til høyre). Western blot-analyse bekreftet effektiv knockdown av APC /C-komponentene (fig. 5E).
(A) stabil isotop merking av aminosyrer i kultur (SILAC) skjematisk. Metabolsk merket H292-celler ble behandlet i 24 timer med en kombinasjon av 300 nM IPI-504 og 10 nM DTX eller bærer (DMSO), etterfulgt av identifikasjon av HSP90 interactome ved massespektrometri. (B) Rådata fra SILAC studien. Datapunkter i øvre høyre og nedre venstre kvadrant representerer proteiner som er oppregulert og ned-regulert, henholdsvis i HSP90 interactome ved behandling med kombinasjonen i forhold til bilen. De to pilene i øvre høyre kvadrant representerer uavhengige peptidfragmenter med unike sekvenser rettet mot HSP70. (C) Immun analyse bekrefter uttømming av ANAPC3 og ANAPC4 på 24 timers behandling av H292-celler med 300 nM IPI-504 og 10 nM DTX kombinasjon. GR = Glukokortikoid Receptor. (D) Tap av APC /C deler av RNAi sensitizes H292-celler til DTX mediert celledød (72 h, 7AAD) (venstre panel) og øker mitotisk indeks (30 t, pH 3) (høyre panel). H292-celler ble transfektert med nontargeting egge siRNA (blå diamanter) eller siRNA sin målgruppe ANAPC3 (røde firkanter), ANAPC4 (grønne trekanter), eller ANAPC3 /ANAPC4 kombinasjon (lilla sirkler). (E) Immunoblot-analyse viser knockdown effektivitet. Representative data vises (n = 2).
Diskusjoner
MTAer som forstyrrer mikrotubulidynamikk er blant de mest effektive antimitotiske behandlinger for et bredt spekter av kreft. Dessverre, MTA-relaterte toksisitet og resistens er fortsatt store utfordringer.
