Abstract
Ved å bruke vårt datasett (GSE50760) tidligere etablert av RNA sekvensering, denne studien forsøkte å identifisere oppregulert gener assosiert med kolorektal cancer (CRC) levermetastaser (CLM) og bekrefte sin biologiske oppførsel. De potensielle roller kandidat gener i svulstene ble vurdert ved hjelp av celleproliferasjon og invasjon analyser. Vevsprøver ble samlet inn fra 18 CRC pasienter med synkron CLM og to CRC cellelinjer (SW480 og SW620) ble brukt for transfeksjon og kloning. Rollene av genene identifisert i CLM ble bekreftet ved hjelp immunhistokjemi i 48 hårløse mus etter intrasplenic transplantasjon av CRC celler. mRNA og protein-ekspresjon ble bestemt ved kvantitativ sanntids revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon, og western blot, respektivt. Ni gener ble opprinnelig valgt i henhold til relevansen av deres molekylær funksjon og biologisk prosess, og til slutt,
ALDH1A1 Hotell og
IGFBP1
ble valgt basert på differensial mRNA uttrykk og en positiv korrelasjon med protein uttrykk. Overekspresjon av ALDH1A1 og IGFBP1 betydelig og tidsavhengig redusert celleproliferasjon (
p
≤ 0,001 til 0,003) og undertrykt invasivitet av ≥3 ganger i løpet av kontrollceller (
p
0,001) i SW480 cellelinje, mens de hadde en svak effekt på å redusere SW620 celleproliferasjon. De protein ekspresjonsnivåene av E-cadherin, N-cadherin, claudin-1, og vimentin var signifikant høyere i CLM enn i primær tumorvev (
p
0,05). Imidlertid cadherin bryter, nemlig N-cadherin overekspresjon med redusert E-cadherin ekspresjon, ble ikke observert i CLM vev og transfekterte celler CRC. Uavhengig av redusert spredning og invasjon funnet på
in vitro
celleanalyser, vedvarende overekspresjon av β-catenin, vimentin, og ZO-1 i IGFBP1-overekspresjon SW480 celler muligens bidratt til CLM utvikling i mus implantert med IGFBP1-overekspresjon SW480 celler (CLM forekomster. SW480 /
IGFBP1
-transfected mus
vs
SW480 /vektor- og SW480 /
ALDH1A1
-transfected mus, 4/8
vs
. 0/10,
p
= 0,023). I konklusjonen, er ALDH1A1 og IGFBP1 forskjellig overexpressed i CLM og kan spille en dobbeltrolle, som fungerer som både tumor suppressors og metastase arrangører i CRC
Citation. Kim JC, Ha YJ, Tak KH, Roh SA, Kim CW, Kim TW, et al. (2016) kompleks oppførsel av ALDH1A1 og IGFBP1 i levermetastaser fra et tykktarmskreft. PLoS ONE 11 (5): e0155160. doi: 10,1371 /journal.pone.0155160
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES
mottatt: 13 desember 2015; Godkjent: 25 april 2016; Publisert: 06.05.2016
Copyright: © 2016 Kim et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. En data set tidligere generert av RNA-Seq og tilgjengelig i NCBI Gene Expression Omnibus offentlig database under sjonsnummer GSE50760 ble brukt
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Korea Research Foundation (2013R1A2A1A03070986), Departementet Science, IKT, og fremtidig planlegging, og Korea Helse 21 R D Project (HI06C0868 og HI13C1750), Helsedepartementet, velferd og familiedepartementet, republikken Korea
Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
levermetastaser oppstår ofte i kolorektal kreft (CRC), noe som resulterer i overlevelse av disseminert tumorceller i leveren. Tumorceller som rømmer fra den primære svulsten og nå en metastatisk nettstedet samhandle med mikromiljøet [1]. I levermetastaser fra CRC (CLM), er skjebnen til kreftceller i hovedsak bestemt av deres samspill med leversinus /ekstra-sinusformet celler [2]. Leverstel celler spiller en viktig rolle i CLM ved avgassing av ulike faktorer som fremmer CLM, inkludert vekstfaktorer [transformerende vekstfaktor-β (TGF-β), epidermal vekstfaktor, vaskulær endotelial vekstfaktor og insulin-lignende vekstfaktor (IGF) -Jeg] og metalloproteinaser [3]. De seks medlemmer av IGF-bindende protein (IGFBP) familie ble først karakterisert som passive reservoar av sirkulerende IGF men ble senere vist seg å spille forskjellige roller i intracellulære og pericellulær kamrene i regulering av cellevekst og overlevelse [4]. Imidlertid tidligere studier som undersøkte forholdet mellom endrede serumnivåer og IGFBP nærvær eller risikoen for ulike kreftformer har hatt mangelfulle og motstridende resultater [4,5].
På den annen side, aldehyd dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1), en av 19 ALDH isoformer, påvirker ALDH-aktivitet av kreft stamceller (cscs). ALDH1A1 nivåer synes å være positivt korrelert med prognose av forskjellige krefttyper, selv om en samlet vurdering kan bedre forbedre deres prognostisk potensial [6]. Samtidig fordi ALDH1A1 spiller en spesiell rolle i avgifte cyklofosfamid klasse kjemoterapeutika, ALDH1A1 undertrykkelse muligens sensitizes kolon cscs til disse regimene.
RNA-Seq-teknologi gir rikelig kvalitativ transkriptom informasjon. Imidlertid verdifulle datasettene må være maksimalt brukes til å trekke kandidatmolekyler i henhold til spesifikke biologiske sluttpunkter ved hjelp av tilstrekkelig stratifiserte beregnings og eksperimentelle verktøy. Ettersom mRNA og protein ekspresjon data er komplementære, samtidig måling av både gir en bedre forståelse av biologien til komplekse systemer [7]. I mellomtiden, biologiske replikater er viktig i RNA-Seq eksperimenter for å trekke gener konklusjoner om forskjellene mellom to eller flere grupper [8].
Fordi noen gener har doble funksjoner, som både er kreftframkall og tumor-undertrykkende, det må biologisk bekreftet hvorvidt kandidatmolekyler forbundet med CLM fremme eller hemme tumorprogresjon. For eksempel, den beskyttende natur autofagi har en dobbel effekt på kreft, fungerer som en tumor suppressor i de tidlige stadiene av tumorigenesis men støtter kreft progresjon i etablerte svulster [9]. På samme måte kan det oncoprotein c-Myc samtidig indusere tumorer med høy frekvens og massiv programmert celledød i de transgene musemodeller [10]. TGF-β signalering er et annet eksempel på et molekyl med en dobbel virkning, som virker som både tumor-suppressor og promoter [11]. I musemodeller, flere solide kreftformer, inkludert CRC, avslørte en bifasisk funksjon for TGF-β, der det hemmer den innledende fasen av tumordannelse, men senere øker ondartet progresjon og metastasering.
Hovedmålet med vår denne studien var å bruke RNA sekvensering for å velge betydelig oppregulert gener assosiert med CLM. Vi bekreftet deres biologiske atferd og fastslått om de utvalgte gener ble innblandet i CLM hjelp matchet vevsprøver (normal colonic epitel, primær tumor, og levermetastaser) fra samme emne og en
in vivo
dyremodell.
Materialer og metoder
Første screening av CLM-relaterte gener fra datasettet
studien protokollen ble godkjent av Institutional Review Board for menneskets genetiske og genomforskning av Asan Medical center, Seoul, Korea (registreringsnr. 2014-0150). Alle deltakerne gitt sitt skriftlige samtykke. Denne studien ble også gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité for Asan Institute for miljø- og biovitenskap, Seoul, Korea (registreringsnr. 2014-03-055). Utvalget retter seg etter institute of Forsøksdyr Resources (ILAR) guide. Et datasett tidligere generert av RNA-Seq og tilgjengelig i NCBI Gene Expression Omnibus offentlig database under sjonsnummer GSE50760 ble brukt [12]. Vevsprøver ble samlet inn fra 18 CRC pasienter med synkron CLM løpet av RNA-Seq analysen og fra ytterligere 10 pasienter for denne studien (S1 tabell). Alle pasientene hadde CRC med synkron levermetastaser. Pasienter ble ekskludert hvis de hadde en tidligere historie av noen kreft, samtidig kreft, arvelig CRC, eller inflammatorisk tarmsykdom. Individuelle vevsprøver besto av matchet normal kolonepitelet (NCE; 5 cm fra svulsten grensen), primær CRC (PCC), og levermetastaser (CLM) histologisk identifisert som adenokarsinom. MRNA uttrykk ble sammenlignet mellom PCC og CLM av RNA-Seq å velge 998 gener med ≥2-fold endringer i uttrykk basert på en GLM likelihood ratio test (
p
0,001) (S2 Table) [13 ]. Etter eksklusjon av 309 lever-spesifikke gener basert på Tiger databasen [14], ble 689 gener videre filtrert ut til å velge 97 gener som konsekvent ble oppregulert i 50% av CRC pasienter undersøkes (S3 tabell). Disse genene ble til slutt redusert til ni gener i henhold til relevansen av deres molekyl funksjon og biologisk prosess [15], nemlig cellevekst og proliferasjon, ekstracellulær matrise, epitelial-mesenchymale overgang (EMT), og /eller kreft stamcelle, angiogenese , chemotaxis, og apoptose, som bestemmes av Gene Ontologi Consortium (https://geneontology.org):
IGFBP1
, hepatocyte vekstfaktor aktivator (
HGFAC
), chemokine ligand 16 (
CCL16
), inhibin beta E (
INHBE
), aktivere transkripsjonsfaktor 5 (
ATF5
), proteoglykan 4 (
PRG4
), cadherin 2 type 1 (
CDH2
),
ALDH1A1
, og erbB reseptor tilbakemeldinger hemmer en (
ERRFI1
) (fig 1).
Seks gener viste forskjeller i uttrykk nivå på mer enn 1 ganger i PCC (2
ΔCtPCC-ΔCtNCE) sammenlignet med CLM (2
ΔCtCLM-ΔCtNCE) (indikerer oppregulering av relevante gener). *
p
≤ 0.001 mellom PCC og CLM. CLM, tykktarmskreft levermetastaser; PCC, primære kolorektal kreft.
RNA isolering og sanntid revers transkripsjon-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra pasientprøver og cellelinjer ved hjelp TRIzol
® Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. CDNA ble syntetisert fra total RNA ved amplifikasjon ved anvendelse av tilfeldige primere og Superscript II RT (Invitrogen). Primere for målgener er oppført i S4 tabell. Glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
) ble anvendt som en intern kontroll. Kvantitativ sanntid revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ble utført på en LightCycler 96 ved hjelp av SYBR grønn I Master Mix (Roche, Mannheim, Tyskland). Sykkel Reaksjonen ble startet med pre-inkubering ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 45 sykluser med amplifikasjon (95 ° C i 10 sek, er Tm i 10 sek, og 72 ° C i 10 sek). Smeltefremgangsmåten omfattet tre betingelser (95 ° C, 65 ° C, og 97 ° C i 10 sek), og avkjøling ble endelig utført ved 37 ° C i 30 sek. Den relative nivået av genekspresjon ble bestemt ved hjelp av -ΔΔCt metoden [16]. Den Ct verdien ble definert som terskelen PCR syklus når det forsterkede produktet først ble oppdaget.
Colorectal cellelinjer, transfeksjon, og kloning
De 10 CRC cellelinjer (DLD-en, HCT116, HCT15, HT29, LoVo, LS174T, RKO, SW480, SW620, og WiDr), to normale colonic cellelinjer (CCD-18Co og CCD841), og 3T3 fibroblaster ble kjøpt fra American Type Tissue Culture Collection (Manassas, Virginia) og kultivert i RPMI-1640 supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum og 1% (vekt /volum) penicillin og streptomycin følge leverandørens anbefalinger. De relative mRNA uttrykk for
ALDH1A1 Hotell og
IGFBP1
var ubetydelig sammenlignet med
GAPDH
uttrykk i SW480 celler (klonet fra primær CRC) og SW620 celler (klonet fra metastatisk lymfe noder av samme motiv) (S1 A Fig).
ALDH1A1 Hotell og
IGFBP1
cDNA (Origene, Rockville, MD) ble forsterket ved PCR og subklonet inn DDK-merket pCMV6-Entry for stabil transfeksjon (Origene). Transient transfeksjon ble utført i SW480 og SW620 CRC celler ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Kontrollcellelinjer ble etablert av tom vektor transfeksjon. ALDH1A1- eller IGFBP1-uttrykkende celler ble samlet ved G418-seleksjon i 10 dager, velge minst to kloner for hver cellelinje. Stabile uttrykk for ALDH1A1 og IGFBP1 ble bekreftet ved western blot-analyse, som tidligere beskrevet [17].
Western blotting og immunhistokjemi (IHC)
Proteiner ble ekstrahert fra dyrkede celler ved bruk av cellelyseringsbuffer ( Cell Signaling, Beverly, MA, USA). Like mengder av proteiner ble separert ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA), som ble blokkert i 5% skummet melk i TBST. Membranene ble deretter inkubert med primært antistoff og HRP-konjugerte sekundære antistoffer [anti-ALDH1A1, anti-fosfo-FAK (Tyr397), anti-FAK, anti-Survivin, anti-β-catenin, anti-myc antistoff, og EMT-antistoff sampler kit (Cell Signaling); anti-IGFBP1, anti-IGFBP1, anti-CD44, og anti-CD166 antistoffer (Abcam, Cambridge, UK), anti-CD133 antistoff (MyBioSource, San Diego, California, USA)]. De spesifikke komplekser ble oppdaget ved hjelp av en SuperSignal West Pico kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Data ble kvantifisert og analysert ved hjelp av en GS-800 kalibrert densitometer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Relativ båndintensitetsverdier ble beregnet ved normalisering av den eksperimentelle absolutte intensitet til det tilsvarende β-actin bånd som en lasting kontroll. I tillegg fem CLM prøvene i parafinblokker ble tilfeldig valgt fra de 18 pasientene i den første RNA-Seq å undersøke graden av kontaminering av normale levervev ved IHC ved bruk Heppar-en og CK-7 (DAKO, Carpinteria, CA, USA) monoklonale antistoffer mot hepatocytter og gallegang celler, henholdsvis, som tidligere beskrevet [17] (S2 figur).
celleproliferasjon og cellesyklus distribusjon analyser
Kontroll og behandlet SW480 og SW620 CRC cellene sådd ut på 96-brønners plater. Formeringshastigheten ble målt daglig i 5 dager ved hjelp av en celleformering analysesett (CCK-8: Dojindo, Kumamoto, Japan) på en mikrotiterplateleser justeres for å måle absorbans ved 450 nm (Tecan, Melbourne, Australia). For strømningscytometri assays, 5 x 10
5-celler ble suspendert i is-kald fosfat-bufret saltvann (PBS), fiksert med 70% etanol i 1 time, og inkubert med propidiumjodid-løsning (50 ug /ml) (Sigma , St Louis, MO, USA) for 30 min. Etter vask med PBS, ble 10.000 fluorescerende celler for hver prøve analysert av FACSCalibur system (Becton Dickinson, Heidelberg, Tyskland) ved hjelp av flowcytometrisk systemprogramvaren (Becton Dickinson).
Invasion og gelatin Zymografi analyser
Kontroll og behandlet SW480 og SW620 CRC celler (2 × 10
5 celler hver) ble sådd på den øvre kammer av 24-brønners kulturplater for matrigel invasjon analyser (BD BioCoat
™: BD Biosciences, San Jose , CA, USA) i henhold til produsentens retningslinjer. 3T3-fibroblast-kondisjonert medium ble plassert i det nedre kammer som et kjemotiltrekkende. Etter inkubering ved 37 ° C i 24 timer, ble cellene på den øvre overflaten av filteret helt utryddet og filtre ble farget med 0,2% krystallfiolett i 10 min. Celler festet til tre forskjellige områder ble tellet under et lysmikroskop (x 100), og alle analyser ble utført i tre eksemplarer. Matriksmetalloprotease (MMP) -2 og MMP-9 aktiviteter i kulturmedier ble undersøkt av gelatin zymografi. Alikvoter av 10 x konsentrert kondisjonert medium ble blandet med prøvebuffer og underkastet elektroforese på en 10% natrium-dodecyl-sulfat-polyakrylamid-gel med 0,1% gelatin (Invitrogen), innlemmet som et substrat for gelatinolytisk proteaser under ikke-reduserende betingelser ved 125 V i 2 timer. Gelene ble inkubert ved 37 ° C i 16 timer i en ny utvikling av buffer og farget med 0,5% Coomassie brilliant blue R-250 (Bio-Rad). Band på de gels ble kvantifisert ved hjelp av et densitometer.
In vivo
transplantasjon, vekst og metastasering av CRC celler
Vi brukte åtte mus (6 uker gammelt BALB /c-SLC-nu.:. Japan SLC, Shizuoka, Japan) for hver av de seks grupper med ulik CRC celletransplantasjon,
i
e
, SW480 /vektor, SW480 /ALDH1A1 , SW480 /IGFBP1, SW620 /vektor, SW620 /ALDH1A1, og SW620 /IGFBP1. En total av 5 x 10
6 CRC-celler ble transplantert inn i milten, og musene ble avlet i 12 uker, hvoretter levermetastaser ble identifisert ved PET-MRI-avbildning ved anvendelse av en sekvensiell dyr avbildningssystem (NanoScan PET /MRI: Mediso , Budapest, Ungarn). Dyrene ble ofret for å undersøke transplanterte og metastatiske svulster, samtidig målt ved hjelp av digitale calipers (Mitutoyo, Kanagawa, Japan). Alle prøver ble histologisk identifisert av hematoxylin og eosin (H E). Farging
Statistical Analysis
Demografiske og biologiske funksjoner mellom de to gruppene og CLM forekomster blant
in-vivo
transplantasjons grupper var hensiktsmessig i forhold hjelp Fishers eksakte test eller uparede Student
t
-test, som passer. Pearsons korrelasjon test ble brukt til å vurdere et forhold mellom mRNA og protein uttrykk. Differensial uttrykk for mRNA og cellulære aktivitetsanalyser mellom de to gruppene ble sammenlignet med Mann-Whitneys
u
-test. Statistisk signifikans ble tildelt da
p
-verdier var 0,05. Alle beregninger ble utført ved hjelp av SPSS programvare (ver.21, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
kandidatgener muligens assosiert med CLM
Den relative mRNA uttrykk av de ni kandidat gener ble undersøkt i 10 CRC pasienter med synkron CLM (fig 1). Den relative mRNA uttrykk var betydelig høyere i CLM (2
ΔCtCLM-ΔCtNCE) enn i PCC (2
ΔCtPCC-ΔCtNCE) prøver, og uttrykk for seks gener varierte med 1-fold (indikerer oppregulering av relevant gener) (
p
≤ 0,001 til 0,003). Blant disse seks gener, de mRNA uttrykk nivåer av
ALDH1A1 Hotell og
IGFBP1
var nært korrelert med sine protein expression verdier i PCC og CLM vev i den respektive pasient (
r
= 0,496 og
p
0,001, henholdsvis) og samtidig viste høyere uttrykk i CLM enn grunnfondsbevis vev (
p
0,001 til 0,05) (figur 2). Dermed ble ALDH1A1 og IGFBP1 valgt for ytterligere biologiske analyser. Våre CLM prøvene viste 97-99% tumorcelle homogenitet på IHC, og den midlere fold økning i ALDH1A1 og IGFBP1 etter normalisering til p-aktin ekspresjon var 6,2 og 3,1 henholdsvis, i forhold til de tilstøtende normale levervev (S2 fig) .
uttrykk nivåer av
ALDH1A1 product: (A) og
IGFBP1 product: (B) var høyere i CLM enn i PCC vev (spesielt i 4 pasienter: # 30, 38 , 43, 47). *
p
0,001 til 0,05 mellom PCC og CLM. NCE (N), normal kolikk epitel; PCC (P), primær kolorektal kreft; CLM (M), tykktarmskreft levermetastaser.
Overuttrykte ALDH1A1 og IGFBP1 hemmer CRC celleproliferasjon
ALDH1A1- og IGFBP1-overekspresjon CRC celler ble generert av cDNA transfeksjon å anskaffe minst to kloner og ble deretter anvendt for å måle effekten av disse proteiner på proliferasjonen av CRC-celler (Fig 3). Overekspresjon av
ALDH1A1 Hotell og
IGFBP1
dramatisk redusert spredning rate av SW480 celler i en tidsavhengig måte, noe som ble tydelig etter mellom 4 og 5 dager (
p
0,05 mellom vektor og klone # 1, og
p
0,05 ** mellom vektor og klon # 2, henholdsvis.
ALDH1A1 og IGFBP1 hemme invasjon og migrasjon av CRC celler
Invasivitet ble målt ved antall CRC celler invadere Transwell kammer og uttrykt som ganger endring mellom overekspresjon og kontrollcellene (fig 4a). IGFBP1-overekspresjon SW480 og SW620 celler viste en signifikant 3,0 til 5,7 ganger lavere antall invaderende celler enn kontrollcellene (
p
0,05). ALDH1A1-overekspresjon SW480 celler viste tilsvar a 2-fold reduksjon i invasivitet (
p
0,05), og ALDH1A1-overekspresjon SW620 celler viste en tendens mot redusert invasivitet sammenlignet med kontrollceller. Effekten av ALDH1A1 og IGFBP1 på MMP-aktivitet ble målt ved hjelp av gelatin zymografi (Fig 4B), som viste at de relative aktivitetene til MMP-2 og MMP-9 i ALDH1A1-overekspresjon SW480 og SW620 kloner ble signifikant redusert ved 1,4 til 3,9 gangers sammenlignet med sine respektive kontrollceller (
p
0,05). De relative tettheter av MMP-2 og MMP-9 aktivitet bånd ble signifikant redusert i IGFBP1-overekspresjon SW480-celler, men ikke i den SW620 cellelinje. Ellers ble både brennvidde heft kinase (FAK) og fosfor-FAK (p-FAK) underexpressed i IGFBP1-overekspresjon SW480 celler, og omvendt tendensen ble sett i SW620 celler (S3A Fig).
Invasivitet ble målt med antall celler CRC invadere inn i det nedre kammer i brønnen (A og C) og ved den gelatinolytisk aktiviteten av MMP-2 og MMP-9 (B og D). Alle behandlede celler viste signifikant redusert invasivitet i disse analysene, bortsett IGFBP1-overekspresjon SW620 celler på gelatin zymografi. *
p
0,05 * mellom vektor og klone # 1 og **
p
0,05 mellom vektor og klon # 2, henholdsvis.
Uttrykk av molekyler assosiert med epitelial-mesenchymale overgang og CRC stamceller
Vi evaluerte uttrykket av 12 epitelial-mesenchymale overgang (EMT ) /CSC-relaterte molekyler ved hjelp av tilgjengelige vevsprøver, vektor-behandlede celler og ALDH1A1- og IGFBP1-overekspresjon celler (fig 5). Uttrykket nivåer av E-cadherin, N-cadherin, claudin-en, og vimentin var signifikant høyere i CLM enn i PCC vev (
p
0,05), mens band som tilsvarer sneglen, slug, ZEB1, og CD133 ble ikke påvist i noen av de matchet vevsprøver. Uttrykk for β-catenin, vimentin, og ZO-en var signifikant større eller vedlikeholdes i IGFBP1-overekspresjon SW480 celler enn i ALDH1A1-overekspresjon og kontroll SW480 celler, henholdsvis (
p
0,05). Ellers ekspresjon av de fire markører inkludert claudin-1 ZO-1, og CD166 var signifikant større eller opprettholdt i IGFBP1-overuttrykkende celler enn i sine ALDH1A1-overekspresjon og kontroll SW620-celler, henholdsvis (
p
0,05). Uttrykk for CD44 ble ikke påvist i SW620 celler, mens CD133 uttrykk ikke ble identifisert i SW480 celler.
CRC pasienter med CLM (A), vektor, ALDH1A1- og IGFBP1-overekspresjon CRC-celler (B). *
p
0,05 mellom PCC og CLM eller mellom vektor og ALDH1A1- eller IGFBP1-overekspresjon kloner. NCE (N), normal kolikk epitel; PCC (P), primær kolorektal kreft; CLM (M), tykktarmskreft levermetastaser.
IGFBP1 fremmer levermetastaser i SW480-celletransplantasjon mus
Etter eksklusjon av 8 mus som døde av svulst-urelaterte årsaker, primær milt tumorer (transplantasjon språk) og levermetastaser ble identifisert grovt og histologisk i 40 mus (fig 6). Primære svulster ble vellykket implantert og vokste med 20-50% i alle grupper. Levermetastaser utelukkende skjedde i mus implantert med IGFBP1-overekspresjon SW480 celler, mens det ikke ble identifisert i kontroll mus eller mus implantert med ALDH1A1-overekspresjon SW480 celler (4/8 mus
vs
. 0/10 mus,
p
= 0,023). På den annen side forekom levermetastaser i mus behandlet med kontroll-SW620 celler (2/8 mus), mens det ikke ble identifisert i mus behandlet med ALDH1A1- eller IGFBP1-overekspresjon SW620 celler. Den lengste diameter av den CI MS var i området 2.0-16 mm. Uavhengig av om SW480 eller SW620-celler ble anvendt, ble vektor-transfiserte mus uttrykker ikke IGFBP1 i milt eller lever, mens det ble overuttrykt i milten og leveren
IGFBP1
-transfected SW480 xenopodet mus med CLM (S1B fig). Ellers ALDH1A1 ble overuttrykt i leveren, uavhengig av cellelinjer. Vi videre undersøkt β-catenin og dets mål molekyler som c-myc og survivin i våre xenografter av IGFBP1- og ALDH1A1-overekspresjon SW480 celler. Den tidligere xenograft med CLM viste samtidig overekspresjon av β-catenin og c-myc, og sistnevnte en uten CLM også uttrykt dem bortsett fra c-myc i milten (S3b figur).
piler indikert svulster (den milt og lever ble satt på øvre og nedre deler, henholdsvis) og histologiske utsikt (H E, × 100; photomicrographs i milten og leveren ble satt på venstre og høyre side, henholdsvis fra røde squared eksemplarer). CLM, tykktarmskreft levermetastaser. Musene med CLM var i orden (høyre og nedover) med lang diameter: A, ingen CLM; B, ingen CLM; C, # 2 (2,7 mm) # 3 (2 til 5,3 mm) # 5 (4.4 til 6.6 mm) # 7 (4,4 mm); D, # 1 (16,0 mm) # 2 (2,2 til 8,0 mm); E, ingen CLM; F, ingen CLM.
Diskusjoner
Ulike gensamlingene kan effektivt høstes fra en enkelt RNA-Seq datasett i henhold til de spesifikke mål og bioinformatikk verktøy som brukes. Vi valgte opprinnelig 998 gener som viser ≥2-fold differensial uttrykk i PCC og CLM vev. Reproduserbarheten av utvalgte gener ble på nytt undersøkt i henhold til deres RNA-Seq ranger med kvantitativ RT-PCR og western-blotting i en annen gruppe. Kjerne gener valgt i henhold til differensial uttrykk ved hjelp av RNA-Seq behov for å få den godkjent i en annen kohort etter strenge kriterier, som inkluderer deres reproduserbarhet og få endringer etter transkripsjons [18]. Vi utelatt lever-spesifikke gener, fordi deres uttrykk har en tendens til å være labil og påvirkes av metabolske endringer og toksiske skader i hepatocytter, uavhengig av tilstedeværelsen av CLM. Vi har videre begrenses ned punktet til ni gener på grunnlag av funksjonell forbindelse med den metastatiske prosess med CRC. To gener,
ALDH1A1 Hotell og
IGFBP1
, ble til slutt valgt å undersøke CLM relaterte biologiske interaksjoner fordi de var bemerkelsesverdig oppregulert i CLM vev og samtidig viste noen post-transkripsjon og posttranslasjonelle endringer. Når det gjelder spesifisitet av disse genene i metastatiske svulster, ble uttrykket nivåer av ALDH1A1 og IGFBP1 økte med 15,6% og 6,3%, sammenlignet med normale levervevet, vurderer en forurensning hastighet på 3%. Imidlertid ble det parakrint effekten av ALDH1A1 og IGFBP1 fra forurensede levervev vurderes, selv om det var svakt.
ALDH1A1 mRNA og proteinuttrykk var signifikant større i CLM enn grunnfondsbevis vev av våre pasienter med synkron CLM. En IHC studie rapporterte at et lavere forhold mellom ALDH1A1 nivå i tilstøtende mucosa som i tumorvevet (RA /C 1) positivt korrelert med tumorinvasjon og metastase evner [19]. Uventet, ALDH1A1 overekspresjon redusert spredning og invasjonen av CRC celler og redusert MMP-2 og MMP-9 aktivitet i vår studie. MMP-2 og MMP-9 spiller viktige roller i nedbrytningen av den ekstracellulære matrise og basalmembran, fremme tumorinvasjon og metastase [20]. Disse funnene antyder at ALDH1A1 overekspresjon i CLM kan virke som en metastase-inhibitor i stedet for en metastase inducer. Hvis vi ser ALDH aktivitet for å være et kjennetegn på cscs, inneha ubestemt spredning og metastatisk potensial [21], knapt vises overekspresjon i CLM vev for å forklare den reduserte spredning og invasjon av ALDH1A1-overekspresjon celler. ALDH1A1 kan enten være en årsak eller konsekvens av CLM og videre arbeid er nødvendig for å fastslå den eksakte rolle.
Til tross for mangel på lyd bevis som støtter stimulering av tumorvekst og migrasjon av IGFBP1, mRNA og proteinnivåer IGFBP1 var signifikant høyere i CLM enn PCC vev i vår studie. I kontrast, IGFBP1-overekspresjon SW480 celler viste lavere forekomst av spredning og invasjon enn ubehandlede celler i våre celleanalyser. IGFBP1 har selvstendige hemmende effekt på kreftcellevekst og metastasering i prekliniske studier, både direkte og gjennom lokal modulering av andre komponenter av IGF aksen [4,22]. Den andre observasjonsstudie rapportert at høyere nivåer av plasma C-peptid og lavere nivåer av plasma IGFBP-1 på prediagnosis var assosiert med økt dødelighet hos pasienter med ikke-metastatisk CRC [5].
EMT /CSC er en kritisk tidlig begivenhet i CRC-invasjon og metastase, og det er karakterisert ved tilstedeværelse av spesifikke markører for hver fenotype [23]. CD133, CD44, CD166, ALDH1A1, og Lgr5 er CRC stamcellemarkører [6]. EMT utløser hjemfall til en CSC-lignende fenotype. I de fire CRC pasienter med CLM inkludert i studien, uttrykk for E-cadherin, N-cadherin, claudin-en, og vimentin var signifikant høyere i CLM enn NCE og grunnfondsbevis vev, mens sneglen, slug, ZEB1, og CD133 viste ingen påvisbare uttrykk i CLM vev. I tillegg er den såkalte «cadherin bryter», som består av N-cadherin overekspresjon og redusert E-cadherin uttrykk, og er en integrert del av den EMT [24], ble ikke påvist i CLM vev eller CRC-celler. Markørene overuttrykt variert avhengig av genene transfekterte og cellene, selv om de klonene ble avledet fra den samme pasient (SW480 og SW620). Til sammen alle EMT /CSC markør uttrykk skilte seg i de respektive klone og dermed ut til å spille ulike roller i løpet av CRC progresjon. CD44 uttrykk ble betydelig redusert i SW620 celler, mens CD133 uttrykk ble redusert i SW480 celler. Knockdown av CD44 resultert i begrenset kolonidannelse og redusert tumordannelse i xenotransplantater, sterkt indikerer en funksjonell rolle i CD44 i CRC tumorigenesis [25]. CD133 har vært ansett som en markør for kolon cscs og en indikator for aggressivitet og metastase [20]. Nedregulering av disse CSC markører kan påvirke spredning og invasivitet av transfekterte SW480 og SW620 celler.
levermetastaser utelukkende skjedde i mus med intrasplenic injeksjon av IGFBP1-overekspresjon SW480 celler, som kan delvis forklares med den vedvarende uttrykk for
