Abstract
Vedvarende HPV-infeksjon spiller en stor rolle i livmorhalskreft. Denne undersøkelsen ble gjennomført for å identifisere HPV-typer i en kohort av indiske kvinner med lokalavansert livmorhalskreft, samt å bestemme den fysiske tilstand og /eller stedet av viral integrering i vertsgenomet. Forbehandling biopsier (n = 270) fra pasienter ble screenet for HPV-infeksjon av en høy gjennomstrømming HPV genotyping analyse basert på Luminex Xmap teknologi samt MY09 /11 PCR og spf1 /2 PCR. Samlet HPV positivitet ble observert å være 95%, med HPV16 er mest vanlige (63%) etterfulgt av infeksjon med HPV18. Integrering status av viruset ble identifisert ved hjelp av Amplifisering av papillomavirus Oncogene transkripsjoner (APOT) assay i et undersett av prøver som var positive for HPV16 og /eller HPV18 (n = 86) og med en tilstrekkelig oppfølging. Dataene ble korrelert med kliniske resultatet av pasientene. Integrering av det virale genomet ble observert i 79% av tilfellene, og en preferanse for integrering i kromosom loci 1p, 3Q, 6Q, 11q, 13q og 20Q ble sett. Kliniske data viser at den fysiske tilstand av viruset (integrert eller episomal) kan være et viktig prognostisk markør for livmorhalskreft
Citation. Das P, Thomas A, Mahantshetty U, Shrivastava SK, Deodhar K, Mulherkar R (2012) HPV Genotyping og Site of Viral Integrering i livmorhalskreft i indiske kvinner. PLoS ONE syv (7): e41012. doi: 10,1371 /journal.pone.0041012
Redaktør: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 17 februar 2012; Godkjent: 15 juni 2012; Publisert: 16.07.2012
Copyright: © 2012 Das et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne ønsker å uttrykke sin takknemlighet for den økonomiske støtten fra kvinner Cancer Initiative IRG # 634. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje vanligste kreftformen blant kvinner på verdensbasis, og den vanligste kreftformen som finnes i indiske kvinner. HPV-infeksjon har blitt vist å spille en viktig, men ikke tilstrekkelig, rolle i etiologien av livmorhalskreft. Inntil nå har blitt rapportert mer enn 200 HPV-typer, hvorav HPV16 er mest vanlig, etterfulgt vanligvis av HPV18, HPV45, HPV31 og HPV33 [1], [2]. Mesteparten av høy risiko HPV (HR-HPV) infeksjoner (90%) regress spontant og bare i ca 10% tilfeller infeksjonen vedvarer og utvikler seg til høygradig cervikal intraepitelial neoplasi. Dette skjer vanligvis ved integrering av HPV-genomet i vertskromosomet med tilhørende tap eller ødeleggelse av E2 [3]. Ifølge tilgjengelige rapporter, har viral E2-genet evnen til å undertrykke viral E6 og E7 onkogener i celler som integrert HPV DNA [4]. Derfor integrering av viruset med tap av transkripsjonen kontroll av E2 resulterer i overekspresjon av E6 og E7 som fører til immortalisering og transformasjon av celler [5]. I de fleste tilfellene integrering av HR-HPV-genomet gir opphav til fusjons transkripsjoner bestående av virale onkogener E6, E7 og tilstøtende cellulære sekvenser [6], [7], [8], [9]. In vitro studier har vist at virus-cellefusjons transkripter er mer stabile og meddele cellene med en selektiv vekst fordel i forhold til de episomale motstykker [10], [11].
studier rapporterer at integrasjonen arrangementet er tilfeldig involverer nesten alle kromosomene, og dermed flere virus-host Integration områder er kartlagt til dato [12]. Det er imidlertid visse soner f.eks skjøre områder, translokasjon bruddpunkter og transkripsjonelt aktive regioner [3], [13], [14], [15], som er foretrukket av den virus for integrering inn i det humane genomet. Ved integrering i eller i nærheten av et gen, kan viruset føre til en endring i dets ekspresjon som til slutt kan føre til forandringer i cellevekst og proliferasjon. Dessuten kan viral integrering gjengi både virale gener samt cellulære gener som er mottakelige for epigenetiske forandringer som kunne regulere sitt uttrykk. Derfor er integrering av HPV i det menneskelige genom ansett som en viktig begivenhet i livmorhalskreftutvikling.
Hensikten med denne studien var HPV genotyping og identifisering av stedet for integrering av to HR-HPV-typer (16 og 18) , sammen med evaluering av den prognostiske verdien av integrasjon området, i lokalavansert livmorhalskreft i indiske kvinner.
Materialer og metoder
kliniske prøver
Forbehandling livmorhalskreft biopsier, hovedsakelig fra FIGO stadium IIIB, ble innhentet fra pasienter (median alder, 50 år, aldersgruppe, 33-80 år) som gjennomgår strålebehandling alene eller samtidig chemo-stråling på Radiation Oncology Department, Tata Memorial Hospital, Mumbai, etter å ha innhentet IRB godkjennelse. Et generisk samtykke for grunnforskning ble innhentet før skaffe biopsier. Men for denne studien et samtykke waiver ble hentet fra sykehuset Ethics Committee. Biopsiene ble oppnådd fra histologisk verifisert, primær tumor cervikal, før starten av radikal strålebehandling og ble kodet for de-identifikasjon av legen før testing. Prøvene ble samlet opp i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse. Alle prøvene ble tildelt et laboratorium kode for å opprettholde konfidensialitet.
Behandling av tumorprøver
Frosne vev ble cryocut for utvinning av DNA og RNA. For DNA-ekstraksjon, ble fem 30 mikrometer seksjoner oppsamles i STE-buffer (0,1 M NaCl, 0,05 M Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 1% SDS) som inneholdt 10 mg /ml proteinase K (USB, Cleveland, OH, USA). DNA ble isolert ved standard fenol-kloroform-metoden. For isolering av total-RNA, ble RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) anvendt. Ti 30 mikrometer seksjoner ble samlet i RLT buffer som inneholder guanidintiocyanat i settet og behandlet følge produsentens instruksjoner. DNAse behandling av RNA prøver ble utført ved hjelp av DNA-free kit (Ambion, Austin, TX, USA).
HPV genotyping av høy gjennomstrømming Luminex rekke
Genotyping av 24 HPV-typer som inkluderte 15 høyrisikotyper (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,52, 56, 58, 59, 68, 73, og 82), 3 putative høyrisikotyper (26, 53, og 66 ), og 6 lav-risikotyper (6, 11, 42, 43, 44 og 70) [1], [2] ble utført ved hjelp av multiplex HPV genotyping array (MULTIMETRIX GmbH, Heidelberg, Tyskland) basert på Luminex Xmap teknologi . I henhold til produsentens anvisninger, ble PCR utført ved hjelp av sett av biotinylerte brede utvalg primere i et totalt volum på 50 mL inneholder 3,5 mM MgCl
2, 200 mM dNTP, 0,75 enhet av Taq DNA polymerase og 1 ul primer mix. Forsterkertrinn inkludert en første DNA-denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering i 20 s ved 94 ° C, gløding i 30 s ved 38 ° C, og forlengelse i 1 min 20 s ved 71 ° C , før en endelig forlengelse i 4 min ved 71 ° C. PCR-positive prøver ble deretter underkastet den Luminex løp. Ti mikroliter av PCR-produktet ble blandet med Luminex kuleblanding inneholdende forskjellige perle populasjoner som er koplet til 24 HPV-typer. Etter termisk denaturering, ble målet sekvenser hybridisert til perle-bundet sonder. De hybridiserte PCR-produktene ble merket ved binding til R-fykoerytrin-konjugert streptavidin. Den leses ut ble oppnådd i Luminex Bioanalyzer (Luminex Corporation, Austin, TX, USA). HPV-typer ble bedømmes i henhold til den unike signatur vulsten, mens nærværet av PCR-produkter ble bestemt ved fykoerytrin-fluorescens. En analytisk følsomhet cut-off ble beregnet på grunnlag av den negative kontrollen som ble trukket fra hver av de lese-out.
HPV genotyping ved PCR ved bruk av årsmodell 09/11 og spf1 /2 primere
Siden mengden av DNA som er tilgjengelig for studien var å begrense, β-aktin PCR ble utført bare i de prøver som ikke viste amplifisering av GP5
+ /6
+ primere (n = 92). Disse ble ytterligere screenet for HPV ved PCR ved anvendelse av årsmodell 09/11 L1-primere (tabell S1) og spf1 /2-primere [16]. PCR ble utført i et reaksjonsvolum på 25 pl inneholdende 1,5 mM MgCb
2, 10 uM av hver primer, 200 uM dNTP og 0,75 enhet av Taq DNA-polymerase. Prøvene som testet positivt for HPV enten ved MY09 /11 eller spf1 /2 eller begge ble ytterligere genotypede for de to vanligste HR-HPV typer-HPV16 og 18 ved hjelp av HPV16 /18 spesifikke primere (Tabell S1). Siden mengden av DNA ble begrensende, SPF 1/2 PCR kan ikke utføres i fire av de 92 prøvene.
Association of HPV16, HPV18 og HPV16 /18-infeksjon med klinisk utfall
de genotyping data for de to HR-HPV-typene, HPV16, HPV18 og HPV16 /18 sammen, der tilstrekkelige oppfølgingsdata var tilgjengelig ble sammenlignet med det kliniske utfallet av pasientene. Kaplan-Meier analyse (SPSS 15.0) ble gjort for å bestemme sammenhengen mellom infeksjon med disse HR-HPV-typer og tilbakefall av sykdom. Sykdomsfri overlevelse ble betraktet fra start av strålebehandling til den tiden da tilbakefall inntraff eller til siste oppfølging. Statistisk signifikans ble evaluert ved bruk av log-rank test (SPSS 15.0).
Identifikasjon av integrasjon nettstedet ved APOT assay
Samples (n = 86) positive for HPV16, HPV18 eller begge, og med en tilstrekkelig klinisk oppfølging (minimum 1 års eller til forekomst av første arrangement, avhengig av hva som var tidligere) ble tatt for å studere viral integrering hjelp Forsterkning av papillomavirus Oncogene transkripsjoner (APOT) assay, som beskrevet av Klaes
m.fl. product: [6 ]. I korthet total RNA (0,5 til 1 ug) ble reverstranskribert ved å bruke oligo (dT) 17-primeren er koplet til en linkersekvens [(dT) 17-p3] [17] og 50 enheter av Superscript II revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i 1 time ved 42 ° C. PCR med p-aktin-primere ble utført for å kontrollere integriteten av cDNA. Førstetråds-cDNA ble amplifisert ved bruk av HPV E7-spesifikk primer (p1-16 spesifikk for HPV16 og p1-18 spesifikk for HPV18) som forover primere og linker p3 som revers primer (tabell S1). PCR-amplifikasjon ble utført i et reaksjonsvolum på 50 pl inneholdende 2,5 mM MgCb
2, 200 uM dNTP, 25 pM av hver primer og en enhet av Taq DNA-polymerase. Reaksjonen består av en innledende denatureringstrinn ved 94 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 35 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 58 ° C i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 4 min. Dette ble etterfulgt av en endelig forlengelse ved 72 ° C i 20 min. Deretter ble 7 pl av PCR-produktet anvendt som templat for nestet PCR ved bruk av primere fremover p2-16 spesifikk for HPV16 eller p2-18 spesifikk for HPV18 og (dT) 17-p3 som revers primer (tabell S1). PCR-betingelsene var samme som den for første PCR med unntagelse av at glødetemperaturen var 66 ° C.
Kloning av fusjons transkripter
amplikonene annet enn de viktigste episomale transkriptene (~1050 bp for HPV16 og ~1000 bp for HPV18) ble mistenkt for å være avledet fra den integrerte HPV genomer. Disse ble fjernet fra gelen og DNA isolert ved hjelp av GFX PCR DNA og Gel Band Rensing Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Den isolerte DNA ble enten sekvensert direkte eller etter kloning i pTZ57R /T vektor bruke INSTA PCR Cloning Kit (Fermentas, Litauen, EU), på DNA sequencer (3100 Avant Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De kromosomintegrasjons loci ble bestemt med Nasjonalt senter for Bioteknologi Information (BLAST) og University of California, Santa Cruz (UCSC) hg19 (februar 2009) (BLAT) menneskelige genom forsamlinger. Videre integrerings nettsider ble sjekket for tilstedeværelse av sårbare områder og noen gener med kjent identitet ved hjelp NCBI skjøre site map viewer og UCSC Blat verktøyet henholdsvis.
Association of viral integrasjon med klinisk utfall
data oppnådd ble sammenlignet med det kliniske utfallet av pasientene. Kaplan-Meier analyse (SPSS 15.0) ble gjort for å fastslå foreningen av virus tilstand (episomal /integrert) med tilbakefall av sykdommen. Sykdomsfri overlevelse ble betraktet fra start av strålebehandling til den tiden da tilbakefall inntraff eller til siste oppfølging (median oppfølging for 86 tilfeller var 44 måneder). Statistisk signifikans ble evaluert ved bruk av log-rank test (SPSS 15.0).
Resultater
HPV genotyping av høy gjennomstrømming Luminex rekke
Selv om det er noen rapporter om forskjellige høy risiko HPV i indiske kvinner, her rapporterer vi 15 høyrisiko HPV, tre middels risiko og 6 lav risiko HPV-typer ved hjelp av høy gjennomstrømning Luminex array. Primerne gitt i Luminex rekke kit for HPV genotyping ble biotinylert, bredt spekter GP5
+ /GP6
+ primere. Ved hjelp av denne primersett for PCR, erholdt vi 178 ut av 270 prøver som var positive for HPV (figur 1). HPV-positive prøver ble ytterligere underkastet hybridisering til kule-bundet prober ved Luminex matrise, som beskrevet tidligere. Ett hundre sekstini prøver ble funnet å hybridisere til de forskjellige HPV-prober, mens 9 prøver var negative. Disse 9 prøver kan ha HPV-infeksjon er ikke inkludert i de 24 typer som ble detektert av settet. Ut av 169 HPV positive prøver, 168 prøvene var positive for ett eller flere HR-HPV typene som indikerer en høy sammenslutning av livmorhalskreft med HR-HPV-infeksjon. Blant disse, HPV16 og /eller HPV18 infeksjon var mest vanlig – 114 prøver å være positiv for HPV16 alene, 6 prøver for HPV18 alene og 16 prøver for både HPV16 og HPV18 (figur 2)
Genotyping ble utført på. 270 avansert stadium livmorhalskreftprøver av høy gjennomstrømming, GP5
+ /6
+ primere basert Luminex array-; konsensus MY09 /11 og spf1 /2 primere. HPV positivitet var 95% (257/270). APOT analysen ble gjort på 86 HPV16
+ og /eller HPV18
+ prøver, med god klinisk oppfølging og god kvalitet RNA. I 18 prøver ble bare episomal form for HPV identifisert, resten 68 hintet mot mulig integrering. Integrasjonsstedet kan forutsies med høy poengsum ved BLAST og /eller BLAT i 48 prøver.
Grafen viser hyppigheten av 24 HPV-typer i 178 livmorhalskreft biopsiprøver som ble funnet å være positive GP5
+ /6
+ primere. HPV16 infeksjon dominerte i prøvene. Hver søyle representerer ulike HPV-typene.
HPV genotyping ved PCR ved bruk av årsmodell 09/11 og spf1 /2 primere
For å estimere den sanne HPV positivitet i 270 tilfeller, 92 livmorhalskreft biopsier negative for HPV ved Luminex array, ble først utsatt for PCR ved bruk av p-aktin primere for å sjekke kvaliteten på DNA. Alle ble funnet å være positive for β-aktin. Neste de ble utsatt for PCR ved bruk av årsmodell 09/11 og spf1 /2 primere. Tjuefem ut av 92 prøver ble funnet å være positive for HPV av årsmodell 09/11 PCR. Siden mengden av DNA ble begrensende, kunne SPF 1/2 PCR ikke bli utført i 4 av de 92 prøvene. Screening med spf1 /2 primere avslørte 79 prøver å være HPV positive. Disse 79 prøver inkludert også de 25 prøvene som testet HPV positive ved MY09 /11 PCR. HPV positivitet ble derfor beregnet å ta hensyn til resultatene fra Luminex array og spf1 /2 PCR. Den samlede HPV positivitet i denne gruppen ble funnet å være 95% (257/270). Videre genotyping av de 79 prøvene, ved hjelp av HPV 16/18 spesifikke primere, viste 49 prøver å være positiv for HPV16. Ingen av disse 79 prøvene var positive for HPV18. Derfor utbredelsen av HPV16 og /eller HPV18 i dette kullet var 69% (185/270) (figur 1).
Association of HPV16, 18 og dobbel infeksjon med klinisk utfall
Kaplan -Meier overlevelsesanalysedata for 125 pasienter med HPV type16, 18 og dobbel infeksjon med tilstrekkelig klinisk oppfølging (median oppfølging for 125 tilfeller var 54 måneder), viste at det var ingen signifikant forskjell mellom infeksjon med disse to HR- HPV-typer i form av sykdom utfall (figur S1).
Fysisk form av virus og klinisk utfall
av 125 HPV16, HPV18 eller to HPV-positive prøver, en sub-set av 86 prøver med god kvalitet RNA, ble tatt for å studere fysiske tilstand og /eller området av viral integrering av APOT analysen. I de fleste tilfeller ble det virale genomet funnet å bli integrert (n = 68), mens i 21% (n = 18) bare episomale transkripter kunne identifiseres. I 12 tilfeller med integrert viral genom, ble episomal form for HPV også påvist (figur 1). Den fysiske tilstand av viruset (episomale /integrert) var assosiert med sykdommen utfallet. Overlevelsesdata viste at 16 av 18 pasienter med bare episomal form av HPV (16 og /eller 18), hadde sykdomsfri overlevelse sammenlignet med de med integrerte formen av viruset, noe som indikerer en god klinisk utfall (p = 0,067, noe som representerer en border betydning) (figur 3). Den kliniske effekten av alle de pasienter hvor det viral integrering ble undersøkt, er vist i Tabell S2.
Kaplan-Meier-overlevelseskurve for pasienter med episomal form av viruset (n = 18) sammenlignet med integrert form (n = 68 ) er vist. De fleste av pasientene med episomal form (16 av 18) hadde en sykdomsfri overlevelse sammenlignet med pasienter med integrert form, noe som indikerer en god klinisk resultat, selv med en border signifikans (p = 0,067).
Identifisering av viral integrering nettstedet
for å forstå om integrering hendelsen er tilfeldig eller det er noen preferanse for visse områder innenfor kromosomene, sekvenseringsdata for 68 tilfeller stammer fra APOT analysen ble undersøkt av Blast og /eller Blat. Stedet for integrering kan forutsies med en høy score i 48 tilfeller (Tabell S3A), for de resterende 20 tilfeller poengsummen var lav (tabell S3b). Bare de tilfeller hvor integreringen området ble spådd med høy poengsum (n = 48) ble analysert videre for ulike funksjoner knyttet til det samme. Nettstedene til integrering ble funnet å være fordelt over hele genomet. Imidlertid integrasjon var hyppigere ved det kromosomale loci 1 p (n = 7), 3Q (n = 8), 13q (n = 4), 6q (n = 4), 11q (n = 4) og 20Q (n = 4 ) (figur 4). Bare en prøve viste HPV integrasjon på to kromosom loci samtidig. Noen av de tilbakevendende integrasjonsseter ble også kontrollert ved det genomiske nivå ved å utføre genomisk DNA PCR med HPV E7-primere som foroverprimeren og primere som er spesifikke for en gitt kromosomal region som den omvendte en (figur S2).
integrasjonsstedet som bestemmes av APOT analyse i 48 tilfeller positive for HPV16, HPV18 eller begge, og med høy prediksjon ranger med BLAST /BLAT. Integrasjon hendelsen ble funnet å være mer vanlig i 1p og 3Q kromosom loci. Hver søyle representerer forskjellige kromosom locus.
Funksjoner assosiert med HPV integrering
Ved hjelp av Viewer NCBI Fragile reiser Kart det ble observert at 60% av integrasjoner (29/48) ble plassert i eller lukke til en felles eller sjeldne skjøre området. Resten av integrasjons områder som ikke var forbundet med noen skjøre områder (tabell 1). Ved hjelp av UCSC Blat verktøyet 58% av sekvensene (28/48) ble observert å være enten innenfor eller i nærheten proteinkodende gener. Disse genene tilhørte alt fra onkogener, transkripsjonsfaktorer, og tumorsuppressorgener (tabell 1) ulike kategorier.
Diskusjoner
Det er bevist hinsides tvil at infeksjon med HPV spiller en stor rolle i etiologien av livmorhalskreft. Rapporter fra ulike deler av sub-kontinentet viser en forekomst av HPV som strekker seg 73-99% [18] – [30]. I denne studien rapporterer vi 95% HPV positivitet ved hjelp av tre ulike primersett. Det fremgår av denne studien at et enkelt sett av primere er ikke tilstrekkelig til å estimere den virkelige HPV smittsomhet. Av de forskjellige HPV-genotyper HPV16 var mest vanlige (60%), etterfulgt av infeksjon med HPV18 alene (2%). Dobbel infeksjon med HPV16 /18 (6%) og HPV16 /45 (3%) ble også observert. Disse resultatene er i samsvar med andre studier fra det indiske subkontinent som rapporterer 57-65% HPV16 positivitet, etterfulgt av HPV18, 45, og 33 i cervikal neoplasi [19], [20], [29].
integrering av viruset er vanlig i sent stadium livmorhalskreft og regnes som en viktig begivenhet i utviklingen av sykdommen. Integrasjon vanligvis forekommer nedstrøms av de tidlige gener E6 og E7, ofte i E1 eller E2 regionen. E2-genet er transkripsjonelt inaktivert når viruset blir integrert på grunn av avbrudd av den åpne leseramme. Viral E2-genet er blitt grundig undersøkt, og er kjent for å spille en rolle i viral replikasjon, så vel som negativ regulering av E6 og E7 gener [31].
Ulike teknikker er blitt brukt til å studere integrering av viruset, f.eks som hemorroider-mediert PCR [32], Restriction site-PCR [15] og APOT assay [6]. For å begrense vår studie til integrering nettsteder med et transkripsjonelt aktiv viral genom, ble APOT analysen valgt. Dessuten gjør analysen APOT påvisning av integrerte virale genom i kliniske lesjoner selv i nærvær av et stort overskudd av ikke-integrerte episomal form av virale genomer [6], [33]. Hyppigheten av viral integrering i vertsgenomet i cervikale karsinomer har blitt rapportert å være så høy som 100% i HPV18
+ tumorer [34] og opp til 80% i HPV16
+ tumorer [35]. I vår studie fant vi fire HPV18
+ prøver der viruset ble integrert og en HPV18
+ prøve der viruset ble episomale. Forekomsten av integrering i HPV16
+ prøvene var høyere. Mekanismen av HR-HPV integrasjon er ikke fullt ut forstått. Det er spekulert i at integreringen kan representere en tilfeldig hendelse, er sannsynligheten for som øker med frekvensen for dobbelt-tråd pauser (DSB) i verten og viral DNA. Kromosom skjøre områder kan representere hotspots for HR-HPV integrasjon.
Den fysiske tilstand og /eller integrasjonsstedet ble undersøkt i 86 livmorhalskreftprøver infisert med en eller begge av to HR-HPV, HPV16 og HPV18, og med en tilstrekkelig klinisk oppfølging. Episomale form av HPV ble observert i 18 saker. Tilstedeværelse av bare episomal form i disse pasienter med avansert sykdom stadium (hovedsakelig FIGO stadium IIIB), kan tyde på at enten HPV integrering er ikke ansvarlig for utviklingen av sykdommen; eller det kan være en begrensning av den teknikk som resulterer i svikt av amplifisering av inte avledet transkripsjon. Nyere studier har bekreftet tilstedeværelsen av bare episomal form av viruset i avansert livmorhals plateepitelkarsinom [33], [36]. I tillegg, siden APOT arbeider på grunnlag av annealing av primeren Frohman til polyA hale, tilfeller hvor polyA halen ligger på stor avstand fra den fremre primer, kanskje ikke være mottakelig for amplifikasjon ved PCR.
i den foreliggende undersøkelse, ble det observert 12 prøver hvor begge integrerte samt episomale former av viruset var til stede. I slike tilfeller kan E2 være tilgjengelig i
trans
å modulere uttrykket nivåer av onkogene E6 og E7 [37]. Også i henhold til rapport fra Pett
et al
., Tap av episomer er så mye viktig som integrering av viruset i vertsgenomet for progresjon av lesjoner i livmorhalsen neoplasi [38]. Det ville være interessant å se uttrykket på E2 og E6 /E7 i tilfeller der HR-HPV er til stede i episomal samt integrert form eller i prøver hvor HPV er bare episomal.
Det er rapporter om at HR- andre enn E6 /E7 HPV proteiner indusere kromosom ustabilitet og transformasjon [39]. Det er rapportert at E2 stabiliserer Skp2, et onkogen og dette kan føre til aktivering av S-fase oppføring [39]. Hamid et. al., har [40] har også foreslått en rolle for E2 i celleproliferasjon. Siden celler i S-fasen er mer mottakelig for stråling, kan kreft med episomal E2 være mer lydhør overfor strålebehandling. Sammenligning av fysisk tilstand av viruset (episomale /integrert) med klinisk utfall etter radikal strålebehandling viste at pasienter med episomal form av viruset hadde økt sykdomsfri overlevelse sammenlignet med de med integrert form. Denne observasjonen er støttet av ulike rapporter som angir at integrasjonen arrangementet er forbundet med en redusert sykdomsfri overlevelse [41], [42]. Imidlertid er det kontrast rapporter også, i henhold til hvilke fysiske tilstand av viruset ikke korrelerer med sykdomsfri overlevelse [43], [44]. Dette må undersøkes videre.
Selv om integrerings steder ble fordelt over hele genomet i ulike prøver, var det en preferanse for visse kromosom loci som 1p, 3Q, 6Q, 11q, 13q, 6Q og 20Q. Visse bestemte regioner i noen av disse loci som 1p36.23, 1p36.33, 3q26, 3q28 og 20q11.21 viste gjentatte integrasjoner, noe som indikerer at integrering er kanskje ikke en tilfeldig hendelse. Rapporter fra studier med vestlige befolkninger viser at integrering av viruset skjer oftest ved 8q kromosomale locus [3], [45], [46]. Integrasjon på 8Q locus i vår studie ble observert i bare 1 av 48 tilfeller. Dette kan være på grunn av forskjellen i etnisitet av de to populasjonene.
3Q, 13q og 20Q loci foruten å være fortrinnsrett mål for HPV integrering har blitt rapportert å være områder for genomisk ustabilitet forbundet med livmorhalskreft. Gevinst av 3. kvartal og 20Q, mens tap av 13q har blitt rapportert i ulike stadier av sykdommen [47] – [49]. Også nyere rapporter viser at en signifikant sammenheng eksisterer mellom genomisk omorganisering og HPV integrering [46]. Det vil derfor være interessant å undersøke om fortrinnsrett integrering av viruset i disse loci har en rolle å spille i å indusere genomisk ustabilitet.
De fleste av integrasjoner (28/48) ble funnet å være plassert innenfor eller i nærheten av visse gener. Dette kan tyde på at viruset foretrekker transkripsjonelt aktive områder for integrering arrangementet. Slike gener inkludert onkogener som myc, transkripsjonsfaktorer som TP63, Mecom, etc. Denne observasjonen støttes av tidligere rapport fra Wentzensen
et al
der de har vist engasjement for kreftrelaterte gener (myc og TP63) i HPV integrasjonsprosessen [50]. Studier i vårt laboratorium har vist at noen av de gener innen hvilke integrasjon ble observert, for eksempel ABCB10, SLC25A36, IL8, COX4I2, HNF1B, myc, vist økte ekspresjon (upubliserte data), hvilket indikerer at ved integrering i eller i nærheten av et bestemt gen viruset kan føre til endringer i genuttrykk
Integrering av viruset nær eller innenfor skjøre områder har ofte blitt rapportert [15], [45], [50] -. [52]. Skjøre nettsteder er spesifikke regioner i kromosomene som nonrandomly gjennomgår bryte i respons til visse stress. Dette gjør gener i eller i nærheten av disse områdene er utsatt for fremmed DNA integrering. I vår studie 29/48 integrasjoner ble plassert i eller i nærheten av en vanlig eller sjelden skjøre området som er i samsvar med tidligere rapporter. En annen observasjon av vår studie var at pasienter med viral integrering på kromosom loci 3Q, 13q og 20Q viste den verste prognosen blant alle. Hvorvidt dette kan ha noen klinisk implikasjon i prognosen for livmorhalskreft ville være interessant og utfordrende å studere.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Kaplan-Meier analyse for to HR-HPV-typer – HPV16 og /eller HPV18 og sykdom utfallet. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse for HPV16 og /eller HPV18 i 125 pasienter som hadde en god klinisk oppfølging ble gjennomført. Pasienter med HPV16 infeksjon alene viste en trend mot bedre sykdomsfri overlevelse sammenlignet med HPV18 infeksjon alene og dobbel infeksjon med HPV16 /18
doi:. 10,1371 /journal.pone.0041012.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Genomisk DNA PCR av de tilbakevendende integrasjons nettsteder. Representative gel bilder (a, b) viser HPV-integrering på det genomiske nivå. Tilbakevendende integrasjoner på kromosom loci 1p36.23, 3q28, 6q23.3, 8p11.21 og 11q13.1 er avbildet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0041012.s002 plakater (TIF)
Tabell S1 .
Primer sekvenser.
doi: 10,1371 /journal.pone.0041012.s003 plakater (docx)
Tabell S2.
Clinicopathological data for alle tilfeller der viral integrering ble studert.
doi: 10,1371 /journal.pone.0041012.s004 plakater (docx)
tabell S3.
Sekvens av HPV integrasjons områder i genomet i 68 tilfeller. a) Integrasjon sider for 48 tilfeller med høy prediksjon poengsum. b) Integrasjon sider for 20 tilfeller med lav prognose poengsum
doi:. 10,1371 /journal.pone.0041012.s005 plakater (docx)
bekreftelser
Forfatterne ønsker å erkjenne sent Dr. KA Dinshaw og alle personer fra Gynecology Disease Management Group, Tata Memorial Hospital, som var involvert i judiciously kompilere anamnese og innsamling og lagring av biopsier fra livmorhalskreftpasienter. Hjelp fra Frøken Sadhana Kannan (ACTREC) i statistisk analyse og Ms Tabish Hussain (ACTREC) for hennes verdifulle innspill i utarbeidelsen av manuskriptet er takknemlig erkjent.
