Abstract
Cell overflate glycoconjugates presentere endringer i sine strukturer i kroniske sykdommer og distinkte oligo epitoper har blitt assosiert med kreft. Blant dem, avkortede glykaner nåværende terminal ikke-reduserende β-N-acetyl (GlcNAc) rester som er sjeldne på friskt vev. Lektiner fra ukonvensjonelle kilder som sopp eller ALGI gi nye markører som binder spesifikt til slike epitoper, men deres tilgjengelighet kan være utfordrende. En GlcNAc-bindende lektin fra fruiting kroppen av sopp
Psathyrella velutina plakater (PVL) har vært produsert i godt utbytte i bakteriekultur. En sterk spesifisitet for terminal GlcNAc rester ble dokumentert av sukker array. Affinity verdier oppnådd ved mikrokalorimetri og overflate plasmonresonans demonstrert en mikromol affinitet for GlcNAcβ1-3Gal epitoper og for dobbeltantenneformede N-glykaner med GlcNAcβ1-2Man avkortet grener. Krystallstruktur av pvl kompleksbundet med GlcNAcβ1-3Gal etablerte strukturelle grunnlag av spesifisiteten. Merking av flere typer kreftceller og anvendelse av inhibitorer av glykan metabolisme indikerte at rPVL binder seg til terminal GlcNAc men også for å sialinsyre (Neu5Ac). Analyse av glykosyltransferase uttrykk bekreftet den høyere mengden av GlcNAc til stede på kreftceller. rPVL binding er spesifikke for kreft vev og svak eller ingen merking er observert for sunt, bortsett fra magekjertler som presenterer unike αGlcNAc-presentere slimstoffer. I lunge, bryst og tykktarm karsinom, kan en klar avgrensning observeres mellom kreft regioner og omliggende friskt vev. PVL er derfor et nyttig verktøy for merking agalacto-glykaner i kreft eller andre sykdommer
Citation. Audfray A, Beldjoudi M, Breiman A, Hurbin A, Boos jeg, Unverzagt C, et al. (2015) et rekombinant Fungal lektin for merking avkortet Glykaner på humane kreftceller. PLoS ONE 10 (6): e0128190. doi: 10,1371 /journal.pone.0128190
Academic Redaktør: Els JM van Damme, Ghent University, BELGIA
mottatt: 28 januar 2015; Godkjent: 24 april 2015; Publisert: 04.06.2015
Copyright: © 2015 Audfray et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer. PVL /ligand-komplekset har blitt deponert i Protein Data Bank med kode 4UP4
Finansiering:. Agence Natioale de la Recherche: gir NeoLect-11-BSV5 og ANR-11-LabX-003 (http: //www .agence-nationale-recherche.fr /). European Cooperation in Science and Technology: COST Handling CM1102 (https://www.cost.eu/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
endringer i celleoverflate-glykosylering er kjent for å være forbundet med et stort antall kroniske sykdommer og kreft glykaner utgjør en meget lovende felt for biomarkører [1-3]. Korrelasjon av inflammasjon eller metastasering med overekspresjon av sialyserte og fucosylated epitoper, slik som sialyl Lewis x har vært gjenstand for intensiv forskning. Imidlertid, i andre tilfeller, kan det meget aktiv metabolisme og divisjon av kreftceller resulterer i unormal eksponering av kryptiske epitoper. Denne indre delen av glykokonjugater, som ville ha blitt dekorert av andre monosakkarider i normale celler, kan derfor bli eksponert på celleoverflaten og blir tilgjengelige for påvisning av antistoffer eller lektiner [4].
N-acetylglukosamin (GlcNAc ) er en karbohydratrest som er til stede i den indre delen av N-glykaner, som kjernen kitobiose knyttet til asparaginresten og mer sjelden så β1-4 bundet til kjernen forgrenet mannose i delt i to N-glykaner. GlcNAc er også til stede i de grener av disse glykokonjugater, enten β1-2-bundet til mannose (Man) på trimannose kjerne eller β1-3-bundet til galaktose (Gal) som en del av polylactosamine forlenget grenene (figur 1A). Ikke desto mindre, på grunn av aktiviteten av galactosyltransferases og sialyltransferaser, disse GlcNAc-rester er ikke på endestillinger i normale vev. Tilsvar glykosfingolipider inneholde GlcNAcβ1-3 eller β1-6 koblet til Gal, men ikke i utsatte endestillinger. Epitopene er like i slimstoffer med Gal, sialinsyre (Neu5Ac) eller fukose (Fuc) residuer lokking av de terminale epitoper. Det eneste unntaket er et sjeldent epitop bestående av α1-4 koblede GlcNAc-terminerte slimstoffer fra kjertel mukøse celler i magesekken [5] (figur 1A).
A. Eksempler på vanlige og avkortede oligosakkarider som kan bli funnet på normale eller kreft vev. Som koder for skjematisk fremstilling av monosakkarider er i den nedre del av figuren. Den heptasaccharide brukes i bindingsforsøk er vist som «hepta». B. Syntese av heptasaccharide azid to tilsvarende oligosakkarid «hepta» i panel A.
Forekomst av avvikende βGlcNAc-terminer epitoper har blitt observert i et begrenset antall kreftformer, inkludert menneskelige leukemiceller [6 ]. IgG med avkortede N-glykaner er blitt rapportert i serum hos pasienter med prostatakreft [7]. Endrede slimstoffer med terminale GlcNAc motiver ble foreslått å danne Tk epitop, et kolon tumorassosiert antigen [8]. Den mest presise karakteriseringen av de forandringer av glykosylering med eksponering av indre GlcNAc ble utført ved glycome analyse av forskjellige carcinoma, og peker på forekomsten av korte avkortede N-glykaner avsluttes av GlcNAβ1-2Man på både antenne og av GlcNAc-terminerte lineære og forgrenede glykosfingolipider , særlig i lunge small-cell carcinoma og adenokarsinom, men også i nyre, bryst og eggstokk-karsinom [9] (figur 1A).
Lektiner, vanligvis avledet fra planter, har vist seg å være meget effektiv for å detektere aberrant glykosylering i biologiske prøver. En ny teknologi er bruk av lektin matriser som kan inneholde lektiner med stor spektra av spesifisitet, og derfor karakterisere variasjonen av glykosylering [10]. Bruken av lektiner utvunnet fra naturlige organismer kan være tidkrevende og kan skape problemer med forurensning eller variasjoner fra parti til parti. Derfor er rekombinant teknologi lectin i ferd med å bli utviklet [11]. Lektiner som er klassisk brukes for GlcNAc-binding er utvunnet fra planter som hvete (WGA), tomat (SLT) og
Griffonia simplicifolia plakater (GSL-II). En ny GlcNAc-spesifikk lektin (PVL) ble renset fra fruiting organer og mycel av en sopp,
Psathyrella velutina product: [12] og deretter strukturelt preget [13]. En nært beslektet protein, lektin 2 fra sopp
Agrocybe aegerita plakater (AAL-2) har nylig blitt klonet og vist å binde seg til hepatomceller [14]. Den pvl struktur presenterer en ny fold mellom lektiner, med syv p-ark anordnet i en β-propell fold. Lektinet inntar derfor en smultringform med seks GlcNAc-bindingsseter, og er ventet å presentere sterk aviditet for celleoverflater presentere høy tetthet av terminale GlcNAc-rester.
Formålet med den foreliggende arbeidet var å fremstille en rekombinant form av pvl og å karakterisere den fine spesifisitet mot de forskjellige GlcNAc-terminerte epitoper som kan være til stede på patologi relaterte avkortede former av humane glykokonjugater. Den aviditet av lektin for GlcNAc-dekorerte flaten ble evaluert på arrays. Til slutt, evne til lektin å merke kreftceller og karsinom vev ble også beskrevet.
Materialer og metoder
Material
GlcNAc har blitt kjøpt fra Sigma-Aldrich. Disakkarid GlcNAcβ1-3Gal, lakto-N-tetraose (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc), lakto-N-triose (GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) kitobiose (GlcNAcβ1-4GlcNAc), kitopentaosen (GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc ) har blitt kjøpt fra Elicityl (Crolles, Frankrike). Sialidase fra
Clostridium perfringens
har blitt kjøpt fra Sigma-Aldrich (ref. N2876) eller New England Biolabs (Ipswich, MA). ß-D-N-acetyl-heksosaminidase
f fra
Streptomyces plicatus
ble kjøpt fra New England Biloabs. Den biotin-merket Sialinsyren spesifikke lektin Innehaveren ble kjøpt fra Vector Labs (Burlingame, California)
Syntese av N-glykan 2
Nonasaccharide azid 1 (fig 1B) ble fremstilt av eggeplomme fulgt av enzymatisk hydrolyse og azidering [15, 16]. 5,1 mg (3,1 umol) av nonasaccharide 1 ble oppløst i 203 pl fosfatbuffer (100 mM, pH 6,8, 1 mM MgCl
2). 10 enheter av lyofilisert β-galaktosidase (EC 3.2.1.23) ble tilsatt til løsningen. Blandingen ble inkubert ved 37 ° C i 3 dager (TLC: 2-propanol, 1 m ammonium-acetat, 2: 1). Etter lyofilisering, ble residuet renset ved gelfiltrering (Superdex 30, 1,6 x 60 cm, 0,1 m NH
4HCO
3, 0,9 ml min
-1). Toppen, eluering i 86 minutter, ble lyofilisert og avsaltet ved gelfiltrering (Sephadex G-25, 2,5 x 15,5 cm, 5% etanol i vann, 0,6 ml min
-1). Toppen, eluering i 75 min, ble lyofilisert, noe som ga 2,9 mg (2,2 umol) av heptasaccharide 2 (70%). [Α]
D
22 = -9,0 (c = 0,5, H
2o). Renheten ble bekreftet ved 360 MHz
1 H NMR in D
2O (S1 figur)
1H-NMR (360 MHz, d
2o): δ = 5,03 (d,
J
1,2 1 Hz, 1 H, H-1
4), 4,83 (d,
J
1,2 1 Hz, 1 H, H- 1
4′), 4,68 til 4,64 (m, 2H, H-1
1, H-1
3), 4,53 (d,
J
1,2 = 7,7 Hz, 1H, H-1
2), 4,47 (d,
J
1,2 = 8,3 Hz, 2H, H-1
5, H-1
5 «), 4.18 til 4.15 (m, 1H, H-2
3), 4,12 til 4,09 (m, 1H, H-2
4), 4.4 til 4.1 (m, 1H, H- 2
4 «), 1,99 (s, 3H, NAc), 1,97 (s, 9H, NAc). ESI-MS: m /z beregnet for C
50H
83n
7O
35: 1341,49; funnet 1342,62 (M + H)
+, 1365,86 (M + Na)
+
Produksjon av rekombinante PVL
En nukleotid-sekvensen som koder for peptidsekvensen av lektin fra fruktsettingen Liket av sopp
P
.
velutina plakater (GenBank, tiltredelse antall DQ232759) [13] supplert ved N-terminal posisjon med aminosyrer MSVVVIS ble syntetisert etter kodon optimalisering for uttrykk i
Escherichia coli plakater (GenScript, Piscataway, NJ). Den ble ført inn i ekspresjonsvektoren ved hjelp av pET25b Ndel og Xhol-restriksjonsseter. Den pET25-rPVL vektor ble forvandlet til
E
.
coli
BL21 (DE3) (Novagen), og celler som pET25-rPVL plasmid ble dyrket i LB-næringsløsning inneholdende 100 ug ml
-1 ampicillin ved 37 ° C inntil A600 nådde 0,7. Cellene ble deretter dyrket i 16 timer etter tilsetning av 0,5 mM isopropyl-β-D-tiogalaktopyranosid. Etter sentrifugering (7000 x g i 15 min), ble bakteriene resuspendert i ekvilibreringsbuffer (20 mM Tris /HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl) og brutt av celle-nedbrytning ved et trykk på 1,7 kilobars (Constant SYSTEMS LTD). Etter sentrifugering (50000 x g, 30 min ved 4 ° C) og filtrering, affinitetskromatografi på en GlcNAc-agarose-kolonne (EY laboratorier inc.) Ble utført på supernatanten. rPVL ble tillatt å binde til immobilisert GlcNAc i ekvilibreringsbuffer, og etter vasking (20 mMTris /HCl pH 7,5, 1 M NaCl), ble det eluert med 200 mM fri GlcNAc i ekvilibreringsbuffer. Rensede protein ble dialysert i utstrakt grad mot ultrarent vann i 7 dager, frysetørket og lagret ved 4 ° C.
Glycan matrise
renset rPVL ble merket med Alexa Fluor 488 (Invitrogen) ifølge produsentens instruksjoner og renset på nytt på en D-Salt polyakrylamid avsalting kolonne (Pierce). Alexa-merket rPVL ble brukt til sukker rekke screening med standard prosedyre for Protein-Glycan Interaksjon Kjerne (H) av Consortium for Funksjonelle glycomics.
Termisk shift analyse
Termiske skiftanalyser var utføres ved hjelp av en mini Opticon, real Time PCR maskin (Bio-Rad Laboratories) med 0,5 mg ml
-1 protein fortynnet i 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 100 mM CaCl
2, med eller uten oligosakkarid i et totalt reaksjonsvolum på 25 pl. SYPRO Orange (Molecular Probes, CA) ble brukt som en fluorescerende probe påvist ved 530 nm. Temperaturen ble hevet ved hjelp av 1 ° C /minutt trinn fra 25 ° C til 100 ° C og fluorescens-avlesninger ble tatt ved hvert intervall. En positiv verdi indikerer at ΔTm liganden stabiliserer proteinet fra denaturering, og derfor bindes til proteinet. Et minimum av to uavhengige målinger ble utført for hver tilstand
mikrokalorimetri
Rekombinant frysetørket rPVL ble oppløst i buffer (20 mM Tris /HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, 100 mM CaCl
2) og avgasset. Proteinkonsentrasjonen ble kontrollert ved måling av A280 ved hjelp av en teoretisk molar ekstinksjonskoeffisient på 65 890 M
-1 cm
-1. Karbohydrat ligander ble oppløst i den samme buffer, avgasset, og lastet inn i injeksjonssprøyten. ITC ble utført med en ITC200 microcalorimeter (GE Healthcare). Den rPVL løsning ble plassert i en 200 pl prøvecelle ved 25 ° C. Titrering ble utført med 20 injeksjoner av 2 pl karbohydrat ligander hver 120 s. De eksperimentelle data ble tilpasset til en teoretisk kurve titrering ved hjelp av Origin programvare levert av GE Healthcare, med AH = (entalpiendring), Ka (assosiasjonskonstanten) og n (antall bindingsseter per monomer) som justerbare parametere. Fri energi endring (ΔG) og entropi bidrag (TΔS) ble hentet fra ligningen ΔG = AH – TΔS = -RT ln Ka (med T som den absolutte temperaturen og R = 8,314 J mol
-1 K
– 1). To uavhengige titreringer ble utført for hver testet ligand.
overflate-plasmonresonans
Alle SPR-eksperimenter ble utført på en Biacore X100 instrument (GE Healthcare) ved 25 ° C i HBS (10 mM Hepes /NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) supplert med 100 pM av CaCl
2 ved en strømningshastighet på 30 mL min
-1. Binding ble målt som resonans enheter over tid etter blank subtraksjon, og data ble deretter evaluert ved hjelp av Biacore X100 evalueringsprogramvaren, versjon 2.0. Dissosiasjonskonstanter ble bestemt ved å plotte-respons ved likevekt (Req, 10 s før slutten av injeksjonen) mot analyttkonsentrasjon. For protein belagt chip, 3500 resonans enheter av rPVL (100 mikrogram ml
-1, 10 mM acetat buffer pH 6,2) er immobilisert på flyt kanal 2 av et forsknings grad CM5 chip ved hjelp av standard amin koblingsprosedyrer. Strømningskanalen 1 er blitt aktivert /deaktivert. Eksperimenter består av injeksjon (foreningen 360 s, dissosiasjon 400 s) av ulike konsentrasjoner av oligosakkarider (2 fold cascade fortynninger, fra 0 til 10 mm) på begge kanaler.
Protein krystallografi
Krystaller av rPVL kompleks med GlcNAcβ1-3Gal ble innhentet av hengende dråpe ved 20 ° C. Frysetørket protein ble oppløst ved 2,5 mg ml
-1 i 10 mM Hepes /NaOH-buffer, pH 7,5, NaCl 150 mM, 100 mM CaCl
2 og inkubert med 1 mM GlcNAcβ1-3Gal i løpet av 1 time ved romtemperatur før co-krystallisering. En stor rektangulær aktige krystaller ble oppnådd fra 20% PEG 3350 «0,2 M natriumformat og 0,1 M diammoniumfosfat etter flere måneder. Ett stykke ble montert direkte i en cryoloop og flash-fryse i flytende nitrogen. Diffraksjon data ble samlet på 100 K på European Synchrotron Radiation Facility (Grenoble, Frankrike) på stasjon BM30A bruker en ADSC Q315r CCD detektor [17]. Dataene ble behandlet ved hjelp av XDS [18]. All videre databehandling ble utført ved hjelp av CCP4 suite [19] Datakvalitet statistikk er oppsummert i S1 tabell. Den molekylære erstatnings teknikk som ble anvendt for å løse struktur med PHASER [20] og koordinatene for det native pvl (Protein databankkode 2C4D) [13]. Strukturen ble videreutviklet av behersket maximum likelihood raffinement hjelp REFMAC 5.8 [21] gjentok med manuell ombygging i Kvakk [22]. Inkorporering av ligand ble utført etter inspeksjon av MFO-DFC vektet kart. Vannmolekyler, innført automatisk ved hjelp av Kvakk, ble inspisert manuelt. Den stereokvalitet av modellene ble vurdert med programmet Molprobity [23], og koordinatene ble deponert i Protein Data Bank på kode 4UP4.
Cells linjer
Menneskelig ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) (H358, A549, H441 og H322), bronkiale epitel (HBEC-3KT), brystkreft (MCF-7, MDA-MB-231), kreft i eggstokkene (OVCAR3), prostatakreft (DU-145), hud squamous cell carcinoma (A431), melanom (A375, Colo829 og SKMel28), og tarmkreft (HT-29) cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Den M119 melanoma cellelinjen var en gave fra Dr. Nathalie Labarrière (Inserm U892, Nantes, Frankrike). Cellene ble holdt i RPMI-1640 medium (Gibco, Cergy Pontoise, Frankrike), med unntak av MDA-MB-231 og HT-29, som ble dyrket i DMEM 4,5 gl
-1 glukose (Gibco), og HBEC-3KT , som ble opprettholdt i keratinocytt-SFM-medium (Gibco). Alle dyrkningsmedier ble supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (5% for MDA-MB-231) og celler ble holdt i en fuktig atmosfære med 5% CO2, ved 37 ° C.
Flow cytometri
Celler ble trypsinert, porsjonert, deretter vasket to ganger i PBS (med Ca
2+ og Mg
2 +). Etter inkubasjon med rPVL-Alexa488 (5 og 10 ug ml
-1), Cellene ble vasket to ganger, og analyse ble utført på en Accuri C6 strømningscytometer ved bruk av CFLOW-Plus-programvare (BD Biosciences). Alternativt kan biotinylert rPVL eller MAH ble anvendt, fulgt av streptavidin-fykoerytrin (BD), og analyse ble utført på et FACSCalibur med Cellquest-programvare (BD). Hvor angitt, cellene ble pre-teated med sialidase (Sigma) eller ß-DN-acetyl-heksosaminidase i 4 timer ved 37 ° C.
Inhibering av glykosylering
A549-celler ble utsådd i seks godt plater og behandlet med forskjellige glycosyleringsinhibitorer: en fucosyl transferase-hemmer, 2-fluor-peracetyl fukose (2FF) og en sialyl-transferase-hemmer, 3-fluor-peracetyl-neuraminsyre (3F-Neu5Ac) som er blitt beskrevet nylig [24] . Behandlingen ble utført i 4 dager med 400 uM og 100 uM av 2FF og 3F-Neu5Ac respektivt. Medium ble erstattet og hemmere ble lagt igjen etter 2 dager.
For å undersøke hvilken type glykosylert ligander som er anerkjent av rPVL, brukte vi Kifunensin (Sigma) som blokkerer ER α-mannosidase jeg og dermed behandlingen av N-glykaner; benzyl-2-acetamido-2-deoksy-alfa-D-galaktopyranosid (benzyl-GalNAc; Sigma) som blokkerer O-glykosylering prosess og 1R, 2R – (+) – 1-fenyl-2-palmitoylamino-3-N-morpholine- 1-propanol (PPMP; Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA) som hemmer syntese av glykolipider. Celler ble behandlet med 5 uM Kifunensin i 4 dager som ovenfor. For benzyl-GalNAc og PPMP, ble cellene holdt i kontakt med inhibitorer, 6 mM og 10 pM henholdsvis, i løpet av en 24 timers periode, og deretter ble mediet forandret, og cellene ble inkubert i en mer dag før analyse. Som 2FF, 3F-Neu5Ac og PPMP fortynnes i DMSO, ble ren DMSO tilsatt til mediet for kontrollbrønnene for å få den samme DMSO-konsentrasjon i hver brønn.
Immunofluorescensanalyse
Celler ble sådd ut i fire-kammer kulturglass (4×10
4 celler pr kammer). Etter 24 timer ble cellene vasket med iskald PBS og fiksert med 2% paraformaldehyd i 10 minutter ved 4 ° C. Før og etter inkubasjon med 1% BSA /PBS (w /v), ble cellene vasket med kald PBS tre ganger i 5 minutter hver. Cellene ble deretter underkastet immunofluorescens farging med rPVL-Alexa488 i 1 time ved romtemperatur og deretter vasket med kald PBS tre ganger i 3 minutter hver. Celler ble undersøkt ved hjelp av en BX41 mikroskop utstyrt med en DP-70 digitalt kamerasystem (Olympus, Tokyo, Japan) og en pseudo-konfokalmikroskop ApoTome utstyrt med AxioCam MRM (N /B).
Tissue seksjoner
etanol-fikserte human trachea, spiserør, duodenal knutepunkt, jejunum, tykktarm, bukspyttkjertel, lever, ovarie, uterus og vagina prøver ble oppnådd fra organdonorer. 18 vevsprøver fra 10 forskjellige individer ble anvendt for å fremstille en vevet mikroarray (TMA) av friskt vev. Etanol-fikserte kolorektale tumorsnitt ble erholdt etter kirurgi. Formalinfiksert parafin-embedded humane NSCLC prøver (n = 3 plateepitelkarsinom, n = 3 adenokarsinomer) ble også oppnådd. En bryst svulst og en lunge svulst TMA (formalinfiksert, 40 svulster, 10 paret metastaser og 10 sammen ved «normal» tissue) ble kjøpt fra SuperBiochip (Seoul, Sør-Korea). Formalinfiksert hjørnetann brystsvulster ble hentet fra «laboratorium dyr histopatologi av Nantes veterinærskole, ONIRIS) farging analyse ble utført på 3-mikrometer tykke vevssnitt.
histokjemi
Vevet deler var deparaffinized, deretter endogene peroksydaser ble blokkert ved inkubering av seksjonene med PBS inneholdende 3% hydrogenperoksyd (v /v), for 5 minutter. Snittene ble deretter blokkert med BSA 5% (vekt /volum) i 30 min ved romtemperatur , etterfulgt av inkubasjon med 0,7-1 ug ml
-1 biotinylert rPVL 1 time ved romtemperatur (etanol-fikserte seksjoner) eller 2 ug ml
-1 av biotinylert rPVL i PBS ved 4 ° C i 18 timer ( etter formalin-fikserte seksjoner). etter vasking av seksjonene to ganger med PBS, en indirekte biotin-streptavidin-systemet og DAB (Ventana Medical Systems) eller AEC (Vector Laboratories) deteksjonssett ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. de utviklede Objektglassene ble vasket to ganger med PBS og motfarget med hematoksylin. Etter vasking med vann, ble seksjonene dehydratisert og montert. Snittene ble observert under et BX41 mikroskop utstyrt med DP-70 digitalt kamerasystem (Olympus, Tokyo, Japan) eller avbildes med en NanoZoomer lysbilde-scanner (Hamamatsu, Hamamatsu City).
For behandling med glycosidases, seksjoner ble inkubert (etter deparaffination og hydrogenperoksyd blokkering) med 50 U av sialidase (New England Biolabs) eller 25 U av ß-DN-acetyl-heksosaminidase i 2 timer ved 37 ° C. Friske enzymer ble deretter tilsatt, og objektglassene ble ytterligere inkubert over natten ved 37 ° C. Kontrollglass ble fremstilt i parallell med de tilsvarende enzymbuffer (natriumcitrat pH 6 og 4,5 henholdsvis). Etter inkubering over natten, ble platene vasket to ganger i PBS, blokkert med PBS-5% BSA (w /v), farget med rPVL og avbildes som beskrevet ovenfor.
Etikk utsagn
Hele menneskelige etanol-fikserte vev vev ble samlet inn og lagret før loven 88-138 av 20 desember 1988 om reseksjon av menneskelig vev etter døden for vitenskapelige undersøkelser. Av denne grunn, gjelder ikke godkjenning av en forskningsetiske komité. Prøvene ble hentet fra Nantes universitetssykehus Senter for biologiske ressurser (https://relib.fr), under Cancerology program godkjent av departementet for forskning (godkjenning DC-2011-1399). Tissue bank og forskning gjennomføring av formalinfiksert menneskelig vev ble godkjent av departementet for forskning (godkjenning AC-2010-1129) og ved de regionale Institutional Review Board Comité de Protection de Personnes (CPP) 5-Sud Est (regionstyret) . Alle pasientene som deltok i denne studien gitt skriftlig informert samtykke. Disse spesielle prøver ble tidligere benyttet som beskrevet i litteraturen [25, 26]. Angående microarray hentet fra Superbiochips Laboratories Ltd (Seoul, Korea), bekrefter selskapet at «humant materiale er fjernet eller samlet med donor samtykke, og at ingen betaling overhodet har blitt gjort til latter». Formalinfiksert vev fra hjørnetann brystsvulster ble hentet fra «laboratorium dyr histopatologi» av Nantes veterinærskole (ONIRIS). Saker som kommer fra Pathology Laboratory of Veterinary Teaching Hospital of Oniris ble brukt i denne studien. Eiernes skriftlig samtykke og godkjenning fra Oniris College of Veterinary Medicine lokale Animal Welfare Committee ble innhentet før inkludering. dyret omsorg og brukte protokollen følges til EU-direktiv nummer 2010/063 og til den nasjonale franske regulering (Décret n ° 2013-118 du 1er février 2013 relatif à la beskyttelse des animaux Utnytter à des finnene Scientifiques).
Resultater
Produksjon og karakterisering av rPVL
PVL har blitt produsert rekombinant (rPVL) i
E
.
coli Hotell og renset i ett trinn på en GlcNAc-agarose kolonne med en endelig utbytte på 1 mg l
-1 av kultur. Når analysert på kanin erytrocytter, vises lektin sterk hemagglutination aktivitet ned til konsentrasjon på 2,3 nM. Det rekombinante proteinet er stabilt og viser en denatureringstemperatur på 56 ° C ved termisk skift analyse (S2 Fig). Ytterligere stabilisering av rPVL kan oppnås i nærvær av GlcNAc-holdige ligander som GlcNAcβ1-3Gal eller kitobiose, med en Tm på 60 ° C for begge, men ikke i nærvær av ikke-bindende karbohydrat slik som galaktose og sukrose, bekrefter GlcNAc bindingsaktivitet.
rPVL er spesifikk for oligosakkarider med å avslutte GlcNAc rester
spesifisiteten av rekombinant PVL ble analysert på pattedyr Printed Array versjon 5.1 med 610 glykaner, hovedsakelig fra opphav hos pattedyr. Den rPVL konsentrasjon ble varierende fra 0,2 mg ml
-1 til 0,2 mikrogram ml
-1 og de fire datasettene er tilgjengelig fra CFG nettsted med primscreen_codes 5693, 5695, 5696 og 4697 (http: //www.functionalglycomics .org). Fluorescenssignalet var utmerket, og den laveste konsentrasjonen var tilstrekkelig for bestemmelse av den sterke preferanse for oligosakkarider som bærer en GlcNAc ved sin ikke-reduserende ende (figur 2).
Hvert treff er blitt farget i henhold til terminalen disakkaridet . Representative oligosakkarider er skjematisk vist. Peaks angitt med en * tilsvarer mindre merking av sialinsyre-syre avsluttet oligosakkarider. Den fullstendige listen over oligosakkarider med fluorescensstyrkene er tilgjengelig fra CFG nettsiden (https://www.functionalglycomics.org).
lectin bundet effektivt å GlcNAc til stede i to forskjellige posisjoner i avkortet N- glykaner: GlcNAcβ1-2Man på kjernepenta og enda sterkere på GlcNAcβ1-3Gal på antenne som er forlenget med polylactosamine motiver. På grunn av multivalency virkning, signalet var maksimal etter multiantennary strukturer (2 til 5 antenne) med lactosamine gjentas, forekomsten av som er relatert til kreft progresjon [27]. Polylactosamine bi- eller multi antennary N-glykaner med terminal GlcNAcβ1-3Gal var bundet med fluorescens signaler høyere enn 1500 RU, mens de med terminal Galβ1-4GlcNAc er i bakgrunnsstøy, under 150 RU. Ingen binding observeres for den GlcNAcβ1-4Man motivet til stede i delt i to N-glykaner, men tilstedeværelsen av denne halverende GlcNAc ikke hindrer bindingen av pvl til nabo GlcNAc-terminerte antenne. Den lectin også bundet til mucin motiver som bærer βGlcNAc på posisjon 3 og 6 av et GalNAc rest (type 4). Det bindes svakt til kitobiose motiv (GlcNAcβ1-4GlcNAc) av kitin. Lektinet er ikke selektiv for den anomeriske konfigurasjon av GlcNAc og flere oligosakkarider med terminale αGlcNAc restene ble også merket. Slike epitoper er til stede i human heparansulfat (GlcNAc α1-4IdoA) og i slimstoffer av gastriske kjertler (GlcNAc α1-4Gal) [5], men også i klasse III mucin fra karsinom vev som uttrykker en gastrisk fenotype [28]. Sukker matrise inneholder en rekke oligosakkarider med terminal GalNAc men PVL binding ble observert bare til disaccharide GalNAcβ1-3GalNAc (# 97) med mindre intensitet.
Siden immobilisert villtype PVL ble rapportert å binde seg til sialyserte glykoproteiner [29], bindingen til oligosakkarider med sialyserte strukturer ble kontrollert. Faktisk en svak binding kan observeres for dobbeltantenneformede N-glykaner med terminer Neu5Acα2-3Gal epitoper (# 603 på figur 2). Nivået av fluorescens var nær støynivået (12% av maksimums). Likevel, når du sjekker ved sukker array-data innhentet med høyere konsentrasjon av PVL (0,1 mg ml
-1), bindingen til sialyl-oligosakkarider ble klart synlig.
affinitet rPVL for ulike GlcNAc holdig oligosakkarider ble testet for både frie og bundne overflateproteiner ved hjelp av titrering mikrokalorimetri og overflate-plasmonresonans, henholdsvis (tabell 1 og fig S3). Affiniteten for GlcNAc er i samme størrelsesorden som den som tidligere er målt ved ITC med opprinnelig pvl isolert fra sopp (Kd ≈200 uM) [13]. Kvantitative målinger bekreftet en sterkere tilhørighet til GlcNAcβ1-3Gal-avsluttet strukturer enn for GlcNAc og chitooligosaccharides, med dissosiasjonskonstant på ca 70 mikrometer for trisakkarid lakto-N-triose. Det ble observert en god overensstemmelse mellom verdiene målt ved begge metoder. Bare N-glykan heptasaccharide presentere to terminal GlcNAcβ1-2Man epitoper viste sterkere tilhørighet til rPVL i løsning (Kd på 34 mm) enn på SPR chip. Dette kan være på grunn av den bivalente karakteren av denne spesielle interaksjoner som kan være lettere etableres med proteinet i løsning enn fikseres på en chip. Bindingen av begge klem GlcNAc-rester av den dobbeltantenneformede heptasaccharide ble bekreftet ved å sammenligne støkiometrien av lineære GlcNAcβ1-3Gal (fem ligander pr rPVL) og av dobbeltantenneformede heptasaccharide (to ligander pr rPVL). Termodynamikken for binding var også forskjellig ettersom dobbeltantenneformede glykan er den eneste for å presentere en gunstig entropien av binding (tabell 1), som kan forklares ved den preorientation av de to GlcNAc-rester i verdensrommet.
Crystal struktur av rPVL /disakkarid
rPVL ble krystallisert i kompleks med GlcNAcβ1-3Gal, den disakkarid som caps avkortet polylactosamine N-glykaner. Strukturen ble løst ved 1,95 Ǻ oppløsning (S1 Table) og vises den forventede sju blader β-propell ganger (figur 3). To p-propellene er til stede i den asymmetriske enhet, men siden de er meget like, er bare kjede A beskrevet nedenfor. Den generelle strukturen til det rekombinante protein var meget lik den som er beskrevet tidligere for villtype-pvl [13]. Den største forskjellen var tilstedeværelsen av en ytterligere kalsiumioner ettersom rPVL presenterer kalsium i tre sløyfer. Klar elektrontettheten ble observert for GlcNAcβ1-3Gal i fem bindingsseter, mens området 2 ble bare okkupert av en GlcNAc rest (figur 3A og 3B).
A. β-propell fold av rPVL med peptidkjeden representert som bånd farge fra blått (N-terminal) til grønn (C-terminal). Disakkarider er representert som pinne med elektrontetthetskart 2mFo-DFC avrundede 1 σ (0,4 ε Å
-3). Kalsiumioner er representert som rosa sfære. B. Samme propell med oppløsningsmiddel tilgjengelige overflate av proteinet. C og D, detaljer om samspillet i stedet en med disakkarid og vannmolekyler.
