Abstract
Mål
LC-MS /MS fosfor-proteomikk er en viktig teknologi for å hjelpe løse de komplekse molekylære hendelser som fører til og forplante kreft. Vi har utviklet en global fosfor-proteomikk arbeidsflyt for å bestemme aktiviteten til signalveier og narkotika mål i kreft i bukspyttkjertelen vev for klinisk anvendelse.
Metoder
Peptider som følge av tryptisk fordøyelse av proteiner hentet fra frosset vev av pankreatisk duktus adenokarsinom og bakgrunn bukspyttkjertel (n = 12), ble merket med tandem masse tags (TMT 8-plex), atskilt med sterk kation-byttekromatografi, deretter ble analysert ved LC-MS /MS direkte eller først anriket for fosforpeptidene ved hjelp av IMAC og TiO
2, før analyse. In-house, ble kommersielle og freeware bioinformatiske plattformer brukes til å identifisere relevante biologiske hendelser fra komplekset datasett.
Resultater
Av 2,101 proteiner identifisert, 152 demonstrerte signifikant forskjell i overflod mellom svulst og ikke- svulstvev. De inkluderte proteiner som er kjent for å være oppregulert i bukspyttkjertelkreft (f.eks mucin-en), men de fleste var nye kandidatmarkører som HIPK1 MLCK. Av de 6,543 unike fosfor identifisert (6,284 unike fosforylering nettsteder), 635 viste betydelig regulering, særlig de fra proteiner involvert i celle migrasjon (Rho guanin nukleotid utvekslings faktorer og amp; MRCKα) og dannelse av fokale sammenvoksninger. Activator fosforyleringsseter på FYN, akt1, ERK2, HDAC1 og andre narkotika mål ble funnet å være svært modulert (≥2 ganger) i ulike tilfeller fremheve sin prediktiv kraft.
Konklusjon
Her er vi gitt kritisk informasjon slik at vi kan finne frem til felles og unike molekylære hendelser sannsynlig bidrar til kreft i hvert enkelt tilfelle. Slik informasjon kan brukes til å bidra til å forutsi mer skreddersydd behandling som passer for den enkelte sak
Citation. Britton D, Zen Y, Quaglia A, Selzer S, Mitra V, Lößner C, et al. (2014) Kvantifisering av kreft i bukspyttkjertelen Proteome og Phosphorylome: Indikerer Molecular begivenheter som vil Bidra til kreft og aktivitet av narkotika mål. PLoS ONE 9 (3): e90948. doi: 10,1371 /journal.pone.0090948
Redaktør: Jon CD. Houtman, Universitetet i Iowa, USA
mottatt: 6 august 2013; Godkjent: 05.02.2014; Publisert: 26 mars 2014
Copyright: © 2014 Britton et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Alle arbeidene gjennomført i denne studien ble finansiert av Institute of Liver Studies, Kings College Hospital og Proteome Sciences plc. Finansiører ansatt forskere og klinikere som spilte nøkkelroller i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, og utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Vi har følgende interesser. Denne studien ble delvis finansiert av Proteome Sciences plc, arbeidsgiver til David Britton, Stefan Selzer, Vikram Mitra, Christopher Lößner, Stephan Jung, Gitte Böhm, Peter Schmid, Petra Prefot, Claudia Hoehle, Sasa Koncarevic, Malcolm Ward, Hans Dieter Zucht og Ian Pike. Alle ansatte i Proteome Sciences plc (unntatt nylig rekruttert Vikram Mitra) holder aksje eller opsjoner i Proteome Sciences plc. Proteome Sciences også produsere TMT-reagenser som brukes i denne studien, og disse reagenser er nå lisensiert for distribusjon av Thermo Fisher Scientific. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke vår tilslutning til alle de PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Protein fosforylering er en felles prosess modulere aktiviteten av onkogene og tumor-suppressor-proteiner [1] – [3]. I mange tilfeller, fosforylering resulterer i bryterlignende forandringer i protein funksjon, på grunn av modulering av proteinfolding, substrat affinitet, stabilitet og aktivitet av dets substrater, i sin tur påvirker signalveier som kontrollerer cellevekst, migrasjon, differensiering og apoptose, feilregulering som bidrar til kreft fenotypen [4]. Kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest aggressive ondartede svulster med en median overlevelse på 6 måneder. En betydelig andel av pasientene er diagnostisert på et avansert stadium hvor behandlingsmuligheter er svært begrenset [5]. Som tilfellet er for andre kreftformer, er molekylær målretting terapi lovende for behandling av avansert eller tilbakevendende kreft i bukspyttkjertelen [6]. Selv om en rekke molekylære rettet mot narkotika har vært tilgjengelig i det siste tiåret, og mange andre er også ventet i de neste årene, er et gjennombrudd fortsatt nødvendig for prediksjon av narkotika effekter og narkotika utvalg. For eksempel, sorafenib, en multi-kinase-inhibitor som virker på hyperaktive vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor, blodplate-avledet vekstfaktor-reseptor og Raf, har vist effekt hos noen pasienter med fremskreden leverkreft [7], men vi kan for tiden ikke forutsi dens effekt på hver enkelt pasient før behandlingsstart. For å overvinne disse vanskelighetene, synes det avgjørende å etablere en analytisk tilnærming for å hjelpe legemiddelvalg, der uttrykk og aktivitet av flere legemiddel mål er omfattende vurderes fra sak til sak. Fosforylering er en viktig begivenhet modulerende protein aktivitet, derfor måle protein fosforylering er en nyttig indikator på aktiveringsstatusen.
Det er hundrevis av anti-kreft narkotika mål og onkogene signalproteiner som er relevante for terapeutisk utvalget derfor måle uttrykk og aktiveringsstatusen til alt ved hjelp av dagens gullstandard analyse, immunhistokjemi (IHC), er ikke gjennomførbart. I denne forbindelse opprettholder IHC en rolle som en valideringsverktøy. Omvendt fase protein mikromatriser (RPMA) har begrensninger på grunn av en begrenset antistoffrepertoaret og dårlig spesifisitet /kryssreaktivitet. I tillegg trenger genomikk baserte teknologier ikke tillate phospho-signale målinger. Væskekromatografi – tandem massespektrometri (LC-MS /MS), basert proteomic tilnærminger er blitt utviklet for å identifisere og kvantifisere tusenvis av proteiner og deres fosforyleringsseter [8], [9]. I denne studien har vi utviklet en LC-MS /MS basert fosfor-proteomikk arbeidsflyt (SysQuant) for å overvinne mange av de tekniske og bio-informatic vanskeligheter involvert i effektivt å kvantifisere uttrykk og aktivitet av signalanlegg proteiner, hvorav mange er narkotika mål, på et globalt eller hele systemet nivå i svulstvev. Vi sammenlignet frosset resekterte vev (tumor versus ikke-tumor bakgrunn) fra tolv tilfeller av pankreatisk hode duktalt adenokarsinom og økt gjennomstrømning anvendelse av rapportør ion isotopologues av TMT, noe som resulterer i 8-plex reagenser og derfor evnen til å kjøre åtte prøver samtidig [10], [11]. Molekylære begivenheter som vil kunne bidra til kreft ble identifisert felles for alle tilfeller er imidlertid noen var unik for den enkelte sak eller undergruppe. Det syntes også å være en sammenheng mellom tid for tilbakefall og gruppering av tilfellene følgende prinsipal komponent analyse av T /NT forhold av fosforpeptider. Phosphopeptide analyse ved hjelp SysQuant kan identifisere nye terapeutiske mål og også hjelpe stratifisere pasienter i ulike behandlingsregimer basert på aktiveringsstatusen til signalveier og kjente narkotika mål.
Materialer og metoder
Etiske aspekter og forskning protokollen ble godkjent av Biobankutvalget ved institutt for Lever Studies, Kings College Hospital (Ref 08 /H0704 /117). Alle deltakerne gitt skriftlig informert samtykke til å bruke sine vevsprøver for forskning. Tolv tilfeller av bukspyttkjertelen hodet duktalt adenokarsinom ble valgt (tabell S1 i tabell S1). Tilleggs ikke-konfidensiell klinisk informasjon som tumor stadium, kjønn og tilbakefall kan ses for hvert tilfelle i tabell S2 S3 i tabell S1. Tumor (T) vevsprøver ble tatt fra de pankreatiske tumormasser, mens ikke-tumor (NT) prøver var fra bukspyttkjertelen bort fra tumormassen. Alle vevsprøver ble frosset i løpet av 30 minutter etter kirurgisk fjerning og lagret [ved -80 ° C] inntil analyse av SysQuant (median tid lagringsplass [18,5 måneder] varierer [4-28 måneder]. T versus NT ble sammenliknet med SysQuant og eksperimentell detaljer er beskrevet i Methods S1 dokumentet. Oppsummert dette medførte proteinekstraksjon fra vevsprøver (ug mengdene som blir anvendt for hver prøve er vist i tabell S4 i tabellene S1), trypsin fordøyelse av proteiner til peptider, TMT 8-plex merking av peptider (tumor og ikke-tumorvev fra 4 tilfeller pr TMT 8-plex) etterfulgt av blanding for å danne en enkelt 8-plex prøveblanding (se tabell S5, i tabellene S1). Hver TMT 8-plex prøve ble så delt i tre uavhengige alikvoter som hver var videre delt inn i 12 fraksjoner av sterk kationbytter (SCX) kromatografi (tabell S6, i tabellene S1). Det første sett av 12 SCX fraksjoner ble så analysert direkte ved LC-MS /MS ved å bruke like data avhengig anskaffelse løper etterfulgt av en tredje løp ved hjelp av tidsavhengige avvisning av alle funksjoner som er identifisert i forsøk 1 2. De gjenværende to sett med 12 fraksjoner ble først anriket for fosforpeptidene ved bruk av enten immobilisert metall-affinitetskromatografi (IMAC) eller TiO
2 (tabell S6, i tabellene S1). De resulterende 24 phosphopeptide anrikede fraksjoner ble også analysert ved LC-MS /MS. I alt 108 separate LC-MS /MS-forsøk ble utført for hver TMT 8-plex prøven. Raw massespektrometri data ble søkt mot den menneskelige UniProtKB /Swiss-Prot database ved hjelp av Mascot og Sequest (via Proteome Discoverer). Peptide spektrum kamper (PSMS) ble avvist dersom identifisert med bare lav selvtillit (≥5% FDR), viste ≤75% fosfo-RS sannsynlighet score, og hadde manglende kvantifisering kanaler (f.eks ikke alle topper for isobariske tags synlige i spektra). Rå intensitetsverdiene av isobariske koder fra PSMS som passerer filtere ble anvendt for kvantifisering, men først normalisert ved hjelp av sum-skalering (som vist i figur S1) for å redusere potensiell eksperimentell /systematisk skjevhet. Logg
2 forhold ble beregnet ut fra isobariske tag intensiteter, som viser regulering mellom T løpet NT for hvert enkelt tilfelle. En phosphopeptide T /NT log
2-forholdet er median T /NT log
2 forhold fra alle PSMS unike for den spesifikke peptidsekvens. Et protein T /NT log
2-forholdet er median T /NT log
2 forhold fra alle unike ikke-fosforylerte peptider er unike for den spesifikke protein. Ensidig t-test (en-prøve sted test) ble benyttet for å beregne p-verdier. P-verdier ble plottet mot log
2 T /NT forholdstall på Volcano plott for å identifisere betydelig regulert peptider. På proteinnivå, ble merknads bruker GO-vilkår, KEGG-trasé og Drugbank informasjon til, og proteinene ble også kartlagt til trasé som bruker ressurser som DAVID og STRING. På fosforylering områdenivå merknad hjelp PhosphoSitePlus ble lagt til, blant kjente funksjonelle og biologisk /patologisk rolle fosforylering nettstedet. Partial Least Squares diskriminant analyse (PLS-DA) ble brukt til å modellere og undersøke multivariat datasettet for å identifisere rammene og grupper fra alle peptid isobariske tag intensiteter fra hvert filter passerer PSM, samt log
2 T /NT forholdstall (fosfor ) fra alle armene av arbeidsflyt (IMAC, TiO
2 og ikke-beriket). Den SysQuant arbeidsflyt, kombinerer fosfor-proteomikk prøveopparbeidelse, LC-MS /MS-analyse og bioinformatikk analyse, ble brukt til å identifisere viktige molekylære hendelser tror vi bidrar til kreft i bukspyttkjertelen i tilfeller analysert her. Diskusjon
Resultater og
Alle peptider identifisert av Sequest og Mascot i denne studien ble eksportert fra Proteome Discoverer og kan sees på zip filer S1, S2 og S3. File S1 inneholder alle peptider (fosforylerte og ikke-fosforylerte) identifiserte fra prøvene i TMT 8-Plex-en inneholder filen S2 alle peptider identifisert fra prøver i TMT 8-Plex-2, og File S3 inneholder alle peptider identifisert fra prøver i TMT 8-plex-3. Disse Supplemental zip filer vise detaljert informasjon, inkludert Sequest Xcorr, Mascot ioner score, ΔM [ppm], kaffetrakter q-verdier, og annen viktig informasjon. Data fra disse Excel-dokumenter var innspill til in-house bioinformatiske verktøy for å identifisere biologisk relevante hendelser.
I alt vi identifisert 6,543 unike fosfor sekvenser (6,284 unike fosforylering nettsteder), fra 2,101 proteiner (tabell 1). Figur 1 viser identifisert peptid (fosforylert og ikke-fosforylert) fordeling over alle tre armer (Non-beriket, TiO
2, IMAC) av SysQuant arbeidsflyten for hver TMT 8-Plex. Figur 1 illustrerer også antallet peptider detektert i totalt for alle tre analytiske repetisjoner (etter kombinasjon av tall fra forskjellige fraksjoner) i samtlige TMT-8-plex prøver. Når resultatene fra hver av de parallelle komponenter (TiO
2, IMAC, ikke-anriket) blir sammenlignet fordelene ved en kombinert anrikning tilnærming og flere analytiske gjentagelser (inklusive utnyttelse av den tidsavhengige avvisning liste), er åpenbare. Det største antall fosfo-peptider ble sett ved hjelp av IMAC berikelse som utgjorde 79% av alle unike fosfor identifisert. Imidlertid TiO
2 fraksjoner entydig identifisert nesten 19% av den totale som ville gå glipp ved hjelp av en enkelt fosfo-peptid anrikning strategi (Figur 1: TMT 8-plex-ALL: A). Det samme gjelder for de tre analytiske kjøringer utført på hver prøve. Hvis en enkelt dataavhengig løp ble utført bare 20 318 unike peptider er sett (Figur 1: TMT 8-Plex-ALL: D). En andre dataavhengig løp gir 5,868 peptider, mens bruken av den tidsavhengige avvisning liste i forsøk 3 tillates en ytterligere 3257 peptider som skal identifiseres samlet. Kollektivt (forsøk 2 3)
Venn-diagrammer viser antall.; A: unike phosphopeptide sekvenser, B: unike non-phosphopeptide sekvenser og C: Totalt antall unike peptidsekvenser identifisert i TiO
2, IMAC, og /eller ikke-Enrich arm av SysQuant arbeidsflyt, på tvers av alle tre TMT 8-plex prøver totalt (TMT 8-plex-ALL) og individuelt per TMT 8-plex (TMT 8-plex 1, TMT 8-plex 2, TMT 8-plex 3). D: demonstrerer graden av overlapping vi observerer for peptid identifikasjoner fra analytisk løp 1, analytisk run 2, og analytisk drevne 3 (inkludert tidsavhengig avvisning liste utarbeidet fra identifikasjoner fra løp 1 og 2)
.
av de 6543 fosfor identifisert, 5409 var kvantifiserbare. På grunn av det store antall målbare fosforpeptidene disse må sees på en separat Excel-fil (fil S4), i stedet for som en del av hoved dokumentet. File S4 viser phosphopeptide sekvenser, de fosforylerte rester og protein navn og Uniprot tiltredelse nummeret som peptid tilhører. File S4 viser også alle kvantitativ og statistisk informasjon om fosforpeptider i tumor versus ikke-svulst fra alle tilfeller, og gir også merknad informasjon, inkludert kjente funksjonelle effekter av fosforylering hendelsen. Denne informasjonen ble hentet fra databasen PhosphositePlus og kan observeres i kolonnene BM-CP. File S4 gir også funksjonell informasjon knyttet til protein, informasjon hentet fra GO vilkår (kolonner CQ-DC) og hvorvidt slike proteiner er kjent narkotika mål (kolonner DD-DG) hentet fra Drug Bank database. For ytterligere informasjon om den relative protein overflod og normalisert phosphopeptide nivåer (phosphopeptide normalisert til protein nivå) refererer til fil S5. Den relative overflod av fosforpeptidene i tumor sammenlignet med ikke-tumorvevet vil endre seg fra tilfelle til tilfelle i første rekke som følge av endringer i ekspresjonsnivået av fosforylert protein eller på grunn av modulert aktivitet av kinaser og fosfataser som induserer eller reversering fosforylering av proteinsubstratet, respektivt. I File S5 normal vi den relative overflod av en phosphopeptide til den relative overflod av den respektive protein. Relativ protein overflod beregnes med bare ikke-fosforylerte peptider derfor det er tilfeller der vi ikke er i stand til å gjennomføre normalisering på grunn av fravær av ikke-fosforylerte peptider til noen av proteiner.
PLS-DA
den første Principal Component (PC1) viser den variabilitet som innføres på grunn av de tre forskjellige armer av arbeidsflyten. Disse tre armer IMAC, TiO
2 og totalt protein (dvs. ikke-anriket), som vist i figur 2A og figur S3, har skilt variablene i 3 separate klynger. Den solide svart sirkel i figur 2A viser T2 ling plass basert på 95% sikkerhet. PC1 forklarer 13,6% av den totale variasjonen i datasettet. Den andre Principal Component (PC2) illustrerer variasjon introdusert i ulike TMT 8-plex kanaler. Denne variasjonen fremhever primært pasient til pasient varians, som er 10,56% av den totale variasjonen i datasettet. Den mellom klasse variasjon, dvs. Tumor (T) mot ikke-tumor (NT), er vist ved den tredje hovedkomponent (PC3) som forklarer 14,36% av den totale variasjonen i datasettet. Figur 2B og Figur S4 viser gruppering av variablene i to separate klynger, dvs. T og NT. Forskjeller mellom de forskjellige armene til arbeids har også påvirket PC3, som er illustrert ved en gruppering av TotalProtein (ikke-anrikede peptider) i en enkelt klynge i figur 2B. Bare pasienten 12 ikke viser eventuelle forskjeller i T i forhold til NT i henhold til figur 2B. PLS bi-plott viser at det ikke var noen slengere i dette datasettet, som vist på hoteling T2-Range plott (figur S3). PLS bekreftet at forsøket var vellykket, og at det er betydelige forskjeller mellom T og NT. Forskjeller mellom de tre forskjellige våpen av arbeidsflyten finnes, men TiO
2 og IMAC har en nesten lik korrelasjon. Sammen PC1, PC2 PC3 og forklare 38,52% av den totale variasjonen i datasettet. De resterende variasjonen i datasettet kan tilskrives blandede effekter av analytisk og biologisk variabilitet
A:. PC1 og PC2 resultatet plott av de første to hovedbestanddeler som beskriver 13,6% (PC1) og 10,6% (PC2) av den totale variansen i dataene (rå isobariske tag intensiteter fra hver PSM bestått sett filtre). Sirkelen viser T2 ling plass basert på 95% sikkerhet. B: PC2 PC3 og resultatet plottet av de neste hovedkomponent beskriver 10,6% (PC2) og 14,4% (PC3) av den totale varians i dataene. C: PC1 og PC2 resultatet plott av de første to hovedbestanddeler som beskriver 25,8% (PC1) og 19,3% (PC2) av den totale varians i dataene (median log
2 T /NT forhold av alle målbare fosforpeptider i hvert fall ). Her også vise vi tidspunktet for tilbakefall i måneder for hvert tilfelle, etter operasjonen
I tillegg til å undersøke rå isobariske tag intensiteter i T NT eksemplarer på å identifisere rammene og grupper, PLS-DA ble også brukt til å undersøke loggen
2 T /NT prosenter fra alle fosfo-peptider (median fra IMAC, TiO
2, Ikke-beriket) i hvert enkelt tilfelle, som vist i figur 2C. En subtil forholdet mellom grupperingen av saker og tidspunkt for tilbakefall ser ut til å gå ut, men antall biologiske repetisjoner måtte økes før du kommer til noen endelige konklusjoner. Det blir sagt det er interessant å observere tilfeller 14 og 9 gruppert tett og begge tilfeller opplevd veldig tidlig tilbakefall på 2 og 5 måneder etter operasjonen, henholdsvis. Tilfeller 10 og 8 også gruppert sammen, men langt fra alle andre tilfeller. Sak 10 viste tilbakefall på 31 måneder og saks 8 hadde ingen tegn til tilbakefall selv 23 måneder etter operasjonen. Tilfeller 4, 12, 1, 7, 5 og 13 gruppert sammen og disse viste tilbakefall mellom 10 til 21 måneder etter kirurgi. Interessant sak 6, som er nok til å vise tilbakefall, også gruppert sammen med de sakene som viste tilbakefall på 10 til 21 måneder. Sak 11 gjorde ikke gruppe med noen andre tilfeller.
Betydelig regulert protein uttrykk
Vi bestemmes den relative overflod av proteiner i tumor sammenlignet med ikke-svulstvev, ved hjelp av median log
2 T /NT forhold av de ikke-fosforpeptider som er unike for hvert protein som surrogater for å beregne den relative overflod av de respektive proteiner. En ensidig t-test ble brukt for å beregne p-verdier, og disse ble plottet mot log
2 T /NT forholdstall på en vulkan komplott for å påvise signifikant (Logg
2 T /NT≥0.3 eller ≤-0,3 og p≤0.05) regelverk enn alle tilfellene (figur 3A). Totalt var det 152 proteiner betydelig regulert basert på Logg
2 T /NT≥0.3 eller ≤-0,3 og p≤0.05 (File S6_Sheet «Pro_TvNT eller 0.3_p 0,05). Tabell 2 viser de 12 mest signifikant oppregulert proteiner i svulst i forhold til ikke-svulstvev, og gir også en beskrivelse av noen kjente funksjonen til hvert protein eller forening med kreft [13] – [31]. Overekspresjon av mucin-en er ofte assosiert med cancer og vi fant også mucin-en for å være signifikant oppregulert i bukspyttkjerteltumorvevet. Interessant vi fant flere betydelige oppregulert proteiner enn mucin-en, noe som kan vise seg å være mer spesifikke markører for kreft i bukspyttkjertelen, kanskje til og med nye terapeutiske mål f.eks Homeodomain-samspill protein kinase 1 (HIPK1). HIPK1, som ble forhøyet i tumor sammenlignet med ikke-tumor i alle tilfeller (median log
2 T /NT = 1,00; p = 1,59 E -04), er en av fire HIPK serin /treonin kinaser kjent for å interagere med og regulere aktiviteten til en rekke cellulære proteiner inkludert flere transkripsjonsfaktorer og kofaktorer [32], [33], [34]. HIPKs har vært innblandet i kontrollen av en rekke cellulære veier å regulere en rekke prosesser, inkludert den DNA-skade respons, spesifikasjon vev, og proliferasjon [34].
Vulkan plott som viser -log
10 P-verdiene i forhold til å logge
2 T /NT forholdstall for; A: relativ protein overflod (bestemt fra median ikke-phosphopeptide log
2 T /NT-forhold), B: fosforpeptidene målt i IMAC C: TiO
2, D: og ikke-anriket arm av SysQuant arbeidsflyten . Røde sirkler påpeke betydelig modulerte proteiner (log
2 T /NT forholdstall ≥0.3 eller ≤-0,3 og p-verdier ≤ 0,05) og fosfor (log
2 T /NT forhold ≥0.75 eller ≤-0,75 og p -verdier ≤0.05). E: er et Venn diagram som viser fordelingen av de 635 fosfor over de tre armene av arbeidsflyt som var betydelig modulert
For bedre å forstå de biologiske prosessene og KEGG signalveier ulik mellom tumor. og ikke-tumor vi valgt tiltredelsesnumrene til alle betydelig modulert proteiner og lastet opp disse til DAVID Bio-informatic ressurs. Focal Heft KEGG signalveien ble mest betydelig påvirket gi en Benjamini score på 1.0e-3. Betydelig modulert Focal adhesjonsproteiner inkludert; Talin-en, Filamin-A, Filamin-B, Filamin-C, Vinculin, Fibronektin, Zyxin, og myosinlettkjedefosfatase kinase, glatt muskulatur (Figur 4 Fil S6_Sheet, FA lamellipodium). Talin-2, Focal adhesjon kinase 1 (FAK1), protein fosfatase en regulatorisk subenhet 12A var også samlings adhesjonsproteiner og betydelig modulert men kan bare sees i File S6, da disse proteinene ikke var kvantifiserbare i noen tilfeller og Figur 4 viser bare proteiner kvantifiserbare i alle tilfeller (f.eks ingen N /A). Alle disse knutepunktene vedheft proteiner, bortsett FAK1, var signifikant oppregulert i tumor versus ikke-tumor tyder på økt størrelse og /eller frekvens av fokale sammenvoksninger i celler i svulsten. Fokal adhesjon er kjent for å spille en rolle i migrering av mange celletyper [35], [36], [37]. Under migrering brennvoksninger kan forankre cellene til den ekstracellulære matrise etter dannelsen av celle prognoser eller fremspring; slik som pseudopodium, filopodium, og lamellipodium [37]. Brenn adhesjonsproteiner Vinculin og myosinlettkjedefosfatase Kinase er også kjent for å være involvert i dannelsen av lamellipodia og fremme celle motilitet. På figur 4 vil vi liste proteiner kjent for å være involvert i dannelsen av vekstanslagene og fokale sammenvoksninger, sett å bli betydelig modulert og målbar i alle tilfeller. Plasmamembranomfattende ekstracellulære matriks-reseptorer (integriner) er essensielle komponenter i brennvoksn men vi ikke observere statistisk signifikant modulering av integrin ethvert uttrykk, men observere betydelig modulering av integrin fosforylering, som diskutert senere. Monteringen av fokale sammenvoksninger innebærer også aktivering av Rho signalering samt myosin-indusert kontraktilitet [37]. Figur 4 viser også Myosin 9, 10, 11 og 14 ble signifikant forhøyet i tumor sammenlignet med ikke-svulstvev
Alle proteiner i dette tallet ble vist å være assosiert med GO begrepene «lamellipodium « «Brennvidde heft «og også vist seg å være signifikant (p≤0.05) opp eller ned regulert i tumor sammenlignet med ikke-svulstvev og kvantifiserbare i hvert tilfelle (f.eks alle proteiner inneholder NA for alle fall ble tatt med i tabellen). Log
2 T /NT-forhold av de ikke-fosforylerte peptider fra hvert protein ble anvendt som surrogater for å beregne den relative overflod av de respektive proteiner. Logg
2 T /NT prosenter av de ikke-fosforylerte peptider ble fordelt på tre armer av arbeidsflyt (iMac, TiO
2, Ikke-Enrich).
funksjonelle roller av fire proteiner i Figur 4 (LIM og SH3-domenet protein 1, Moesin, Adin, og PDZ og LIM domeneprotein 7) har allerede blitt diskutert i tabell 2, men Alpha-actinin-4 (ACTN4) er en actin-bindende protein med flere roller i forskjellige celletyper. I ikke-muskelceller, er det funnet langs filament bunter og adherens-type kryss, hvor det er involvert i binding aktin til membranen. Det antas å være involvert i metastatiske prosesser som Li Fu et al [38] har vist at overekspresjon av ACTN4 i kombinasjon med 67 LR er forbundet med esophageal karsinomer (ESCC) progresjon. De viste at ACTN4 ble uttrykt forskjellig i ESCC vev sammenlignet med normalt vev, og at uttrykket nivåer av ACTN4 ble gradvis økt fra stadium I til III. Clinicopathological korrelasjon ved hjelp av TMA vist at overekspresjon av ACTN4 var signifikant assosiert med avansert stadium tumor (P = 2.6E-2) og lymfeknutemetastase (P = 4.9E-02) [38]. Plectin har også blitt foreslått som en biomarkør kreft, spesielt kreft i bukspyttkjertelen [39]. Selv om det normalt et cytoplasma-protein, er plectin uttrykkes på cellemembranen i pankreatisk duktus adenokarsinom (PDAC) og kan derfor anvendes til å målrette PDAC celler [39]. Vår studie bekrefter at begge kreft biomarkører er betydelig uttrykt i tumor sammenlignet med ikke-svulstvev i bukspyttkjertelen kreftpasienter (median log
2 T /NT = 0,29 og p-verdi = 3.33E-02 for ACTN4, og median log
2 T /NT = 0,32 og p-verdi = 1.63E-03 for Plectin).
catenin delta-1 er nødvendig for dannelse av celle-celle adhesjon (adherens kryss) gjennom dets interaksjon med den cytoplasmatiske hale av klassisk og type II cadherins. Catenin delta-en modulerer også aktivitetene i Rho familien av GTPases (RhoA, Rac, og Cdc42), noe som tyder på at sammen med andre Src underlag, catenin delta-1 regulerer aktin dynamikk. Dermed catenin delta-en er en mester regulator av adherens krysset formasjon, og sannsynligvis deltar i å regulere balansen mellom limet og bevegelige cellulære fenotyper [40]. Her ser vi betydelig redusert nivå av catenin delta-en i tumor sammenlignet med ikke-svulstvev (median log
2 T /NT = -0,29 og p-verdi = 1.34E-02). Når du vurderer de viktige rolle catenin delta-1 spiller i forming /opprettholde adherens overgangene mellom epitelceller, og vurderer våre observert nedgang i uttrykk og fosforylering av dette proteinet det tyder på at disse hendelsene kan bidra til dissosiasjon av epitelceller, derav epitelial til mesenchymale overgang . i bukspyttkjertelkreft
Av spesiell interesse er å oppdage at myosinlettkjedefosfatase kinase (MLCK) er betydelig overuttrykt i tumor sammenlignet med ikke-svulstvev (median log
2 T /NT = 0,5 p- verdi = 2.95E -02). MLCK er en Ca
2 + /calmodulin-avhengig protein-kinase som regulerer en rekke cellefunksjoner, for eksempel, muskelkontraksjon og cellemigrering, via fosforylering av myosin lett kjede proteiner. Ettersom tumorcellemigrering er et viktig steg i tumorspredning, kan myosin lettkjede-kinase (MLCK) betraktes som et terapeutisk mål for å forebygge tumorspredning. Faktisk har MLCK aktivering og uttrykk er funnet å være positivt forbundet med metastatisk tilbøyelighet. Dessuten har MLCK inhibitorer blitt vist å redusere invasivitet av forskjellige kreftceller [41]. Interessant tilfeller 14, 9, 4 og 13 har høyeste nivåene av MLCK og tre av fire av disse sakene viser også svært tidlig tilbakefall (2 måneder, 5 måneder, 10 måneder, og amp; lengst med 21 måneder tilbakefall, henholdsvis) . Kanskje disse fire tilfellene ville ha nytte av MLCK hemmere hvis pasientutvelgelse var basert på høy ekspresjon av stoffet mål i tumor versus ikke-tumor. Sak 10 viste de laveste nivåene av MLCK i tumor sammenlignet ikke-tumor korrelere med denne saken viser lengst tid før tilbakefall av 31 måneder. MLCK spiller også en rolle i p38 MAPK signaliserer en sti som viser økt aktivitet i flere av svulstene i denne studien, som omtalt senere.
Observere økt Myosin uttrykk i svulstvev er også av spesiell interesse som MYH9 (median log
2 T /NT = 0,29 og p-verdi = 5.93E-03), MYH10 (median log
2 T /NT = 0,23 og p-verdi = 2.18E-02), MYH14 (median log
2 T /NT = 0,35 og p-verdi = 2.03E-02) er alle mobiltelefon myosins som er kritiske til cytokinese, cellen form, og spesialiserte funksjoner som sekresjon og tildekking. Under celle spre disse tre, spiller en viktig rolle i cytoskjelettet omorganisering, fokale kontakter dannelse (i den sentrale delen, men ikke marginene av spredningsceller), og MYH10 induserer lamellipodial forlengelse mens denne funksjonen er mekanisk motvirkes ved MYH9, som antas å forårsake lamellipodial dementi.
