Abstract
Formål
Strålebehandling for invasiv blærekreft åpner for organbevaring men toksisitet og lokal kontroll forblir problematisk. Som sådan, forbedre effektiviteten av behandlingen krever bestrålingssensibilisering av tumorceller. Målet med studien er å undersøke om pattedyr target of rapamycin (mTOR), en nedstrøms kinase av phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT overlevelse sti, kan være et mål for stråling sensibilisering.
Experimental Design
klonogene analysene ble utført ved hjelp av seks blære kreft cellelinjer (UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, KU7, 253J-BV, og 253-JP) for å undersøke effekten av ioniserende stråling ( IR) alene og i kombinasjon med RAD001, en mTOR-inhibitor. Cellesyklusanalyse ble utført ved anvendelse av strømningscytometri.
In vivo
, atymiske mus ble subkutant injisert med to blære kreft cellelinjer. Behandlingsrespons med RAD001 (1,5 mg /kg, daglig), fraksjonert IR (total 9Gy = 3Gy x 3), og kombinasjonen av RAD001 og IR ble fulgt i 4 uker. Tumorvekt ble målt til eksperimentell endepunkt.
Resultater
klonogene analyser viste at i alle blære cellelinjer testet, ble en additiv effekt observert i den kombinerte behandlingen sammenlignet med hver behandling alene. Våre data indikerer at denne effekten skyldes arrestere i både G1 og G2 fasene av cellesyklusen når behandling er kombinert. Videre våre data viser at denne rest reguleres primært av endringer i nivåer av cyklin D1, p27 og p21 følgende behandlinger.
In vivo
, en betydelig reduksjon i tumorvekt ble observert i den kombinerte behandling sammenlignet med behandling enten alene eller kontroll.
Konklusjoner
Endring cellesyklus ved å hemme mTOR signale sti i kombinasjon med strålebehandling har gode resultater og er et lovende terapeutisk modalitet for blærekreft
Citation. Nassim R, Mansure JJ, Chevalier S, Cury F, Kassouf W (2013) kombinere mTOR Hemming med stråling Forbedrer Antitumor aktiviteten i blærekreft Cells
in vitro Hotell og
in Vivo
: A Novel strategi for behandling. PLoS ONE 8 (6): e65257. doi: 10,1371 /journal.pone.0065257
Redaktør: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, USA
mottatt: 24 februar 2013; Godkjent: 24 april 2013; Publisert: 17 juni 2013
Copyright: © 2013 Nassim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet er finansiert av et stipend fra det kanadiske Institute of Health Research (CIHR) tilskudd MOP 89796. Dr. W. Kassouf er en mottaker av en klinisk stipendiat utmerkelse fra Fonds de recherche du Québec-Santé (FRSQ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Den mTOR-hemmer RAD001 ble vennlig levert av produsenten, Novartis. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Blærekreft er en svært utbredt sykdom i Nord Amerika. I 2012 ble 55.000 menn og 18.000 kvinner diagnostisert med blærekreft; En i fem menn og 1 av 4 kvinner vil dø av sin sykdom [1]. . Radikal cystektomi som består av fullstendig fjerning av blæren, forblir «gullstandarden» behandling for blærekreft [2]. Strålebehandling er et attraktivt alternativ som det bevarer blæren og åpner for normal urin og seksuelle funksjoner [3]. Men mangelen på lokal kontroll av sykdommen, så vel som betydelig toksisitet som er forbundet med strålingsterapi fortsatt problematisk [4] – [6]. For å forbedre effektiviteten, ble flere kliniske studier på organbevarende styring utført for å teste effekten av kombinert kjemoterapi og strålebehandling [7], [8]. Men til tross for mange forsøk, forblir chemoradiation studier forbundet med suboptimal lokal kontroll over sykdommen og redusere overlevelse sammenlignet med radikal kirurgi. Som sådan, er det et viktig behov for å øke bestrålingssensibilisering av blærekreft for å øke effektiviteten ved å forbedre lokal kontroll av sykdom og åpner for reduksjon av dosen for å redusere giftigheten av strålebehandling.
A signalmolekyl som er svært attraktiv og har nylig trukket mye oppmerksomhet for målrettet terapi er mammalian target of rapamycin (mTOR). Mer spesifikt, er mTOR en nedstrøms serin /treonin proteinkinase av fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT sti som spiller en avgjørende rolle i onkogenesen [9], [10]. Dereguleringen av PI3K /AKT /mTOR vei frembringer en gunstig onkogen miljø og er blitt dokumentert i en rekke humane tumorer inkludert blærekreft [11]. mTOR-hemming ble et aktivt område av forskning for å utvikle og teste små hemmende molekyler som rapamycin analoger -notably RAD001 (everolimus, Novartis) og CCI-779 (Torisol, Wyeth) til å behandle ulike sykdommer, inkludert kreft. Nylig ble den første vellykkede fase III klinisk studie med en mTOR-hemmer realisert hos pasienter med avansert nyrecellekreft, som opplevde en forbedring i total overlevelse [12]. Vi har nylig publisert den første rapporten som viser signifikant antitumoraktivitet
via
hemme mTOR med RAD001 i blærekreft modeller
in vitro Hotell og
in vivo product: [13]. Interessant, ble bemerkelsesverdige forskjeller i følsomhet for mTOR-hemming bemerket blant ni human blære kreft cellelinjer. Dessuten var det ingen sammenheng mellom aktiverte AKT og mTOR nivåer med celle aggressive egenskaper. Men dette var ikke tilfelle for aktivert S6 som synes nivåene høyere i RAD001 sensitive i forhold til relativt resistente cellelinjer. Av interesse, har noen studier rapportert at mTOR-hemming kan bevisst svulster i prostata, bryst, og hjernen til ioniserende stråling [14] – [16]. Etter bestråling ble vist å aktivere PI3K /Akt overlevelse /vekst bane som kan være ansvarlig for celledød flukt og radioresistance [17], [18], kan samtidig mTOR inhibering potensielt overvinne motstand mot stråling i blærekreft. For å følge opp denne hypotesen, denne studien undersøkte effekten av å kombinere RAD001 og ioniserende stråling,
in vitro Hotell og
in vivo
, på celle overlevelse og vekst i en rekke av blærekreft celle linjer. I tillegg forsøkte vi å belyse den mekanismen som denne kombinasjonen av behandlinger kan hemme tumorvekst.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle etiske standarder i forbindelse med bruk av vår dyre xenograft modell var full fulgt og respektert. The McGill University Health Center Facility Animal Care Komiteen godkjente våre dyr protokoller (protokoll # 5428) før begynnelsen av studien. Videre ble dyrene vedlikeholdt og holdt i state-of-the-art fasiliteter som følger strenge prosedyrer for å gjennomføre dyreforsøk, som inkluderer konstant overvåking og kontroll av dyrene og brukerne.
Cell kultur
UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, og KU7 cellelinjer ble preget og levert av prøve Kjerne i urin spesialiserte programmer for Research Excellence i blærekreft ved MD Anderson Cancer Center [19]. Den 253-JP og 253J-BV ble vennlig levert av Dr Colin P.N. Dinney fra M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas [20]. Cellelinjene ble rutinemessig dyrket ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator, holdt i Eagles minimum essensielt medium (EMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Wisent, Saint-Jean-Baptiste QC) og passeres når nå 80% samløpet. MTOR-inhibitor RAD001 ble vennligst tilveiebrakt av produsenten, Novartis.
klonogene assay
Cellene ble utsådd i en 6-brønns plate ved en densitet på 200 celler per brønn og holdt i vekstmediet . Når festet, ble de behandlet med RAD001 ved doser tilsvarende den GI50 for hver cellelinje, slik som tidligere beskrevet [13]: UM-UC3 (75 nM), KU7 (50 nM), 253J-BV (8 nM), 253- JP (8 nM), UM-UC5 (0,5 nM) og UM-UC6 (0,5 nM) og holdt ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator i 12 timer. Dette ble etterfulgt av strålebehandlingen ved forskjellige doser, med og uten RAD001. Kontroller er inkludert ubehandlede celler sammen med celler behandlet med hver av stråling og RAD001 behandling alene. Celler ble ytterligere dyrket ved 37 ° C og tillatt å danne kolonier i 10-14 dager. Et tilnærmet cutoff på 50 levedyktige celler /koloni ble valgt. Cellene ble vasket med fosfat balanserte saltløsning (PBS) og fiksert i 15 minutter ved bruk av 3,7% formaldehyd i PBS. Etter en andre PBS-vask, ble cellene farget med krystallfiolett (0,4% vekt /volum i PBS; Fisher Scientific, Waltham, MA) og latt til lufttørring før telling av kolonier. Hver behandling besto av duplikate brønner i en 6-brønns plate og forsøket ble utført to ganger. Den overlevende fraksjon ble beregnet som (den midlere kimtall ved slutten av eksperimentet) /(celler inokulert i begynnelsen) x (plating effektivitet). Pletteringseffektiviteten ble definert som (bety kimtall) /(-celler sådd ut i den ikke-utstrålt kontroll). De ikke-bestrålte celler ble brukt som kontroll.
Flowcytometri
Celler ble sådd i kulturplater og lov til å feste. RAD001 ble tilsatt til de passende prøver 12 timer før bestråling i en dose tilsvarende til den GI50 av hver cellelinje. Dette ble fulgt av en dose på 4Gy av ioniserende stråling (basert på tidligere definerte følsomhets eksperimenter), og cellene ble ytterligere dyrket i 48 timer. Cellene ble så trypsinert, vasket en gang med PBS og fiksert med 100% kald etanol i 60 minutter ved 4 ° C. Etter sentrifugering ble cellepelletene resuspendert i en oppløsning av propidiumjodid (PI) (50 g /ml, Invitrogen, Carlsbad, CA) i PBS, supplert med RNase (100 g /ml; Invitrogen, Carlsbad, CA) og deretter overført til fluorescens -aktivert cellesortering (FACS) rør og inkubert i mørke i 30 minutter ved 40 ° C for å tillate propidiumjodid inntak i kjernen. PI inntaket ble deretter vurdert ved hjelp av en Coulter Flowcytometer (BD Biosciences, Franklin, NJ).
Western blot
Celler ble dyrket og behandlet i henhold til diett beskrevet ovenfor (RAD001, ioniserende stråling, og begge i kombinasjon), med ubehandlede celler som tjener som kontroller. Etter behandling ble cellene skrapet på is og resuspendert i 30 minutter ved 4 ° C i kald RIPA (lysis) buffer inneholdende en blanding av fosfatase og proteaseinhibitorer (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Cellesuspensjonene ble deretter sentrifugert for å samle klare lysater i supernatanten. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved bicinchoninic syre (BCA) assay (Pierce Scientific-Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Proteinprøver (40 ug-60 ug) ble sendt til polyakrylamid-gel-elektroforese, som tidligere beskrevet [13]. Proteiner i geler ble overført til membraner, blokkert med 5% ikke-fettholdig melk og /eller 5% bovint serum-albumin-oppløsning, og immuno-blottet med følgende monoklonale primære antistoffer (alt kanin): fosfo-AKT, total AKT, fosfo S6, total S6, p21, p27kip1, og cyclin D1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) ved konsentrasjoner er anbefalt av produsenten. Membranene ble deretter inkubert med de passende anti-kanin sekundære antistoffer og en ECL-kjemiluminescens påvisningssystem (Amersham-GE Healthcare, Piscataway, NJ) ble anvendt for å vise proteinbånd steder på røntgenfilm. Filmene ble skannet og proteinnivåer ble normalisert mot aktin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), en kontroll 42 kDa housekeeping protein som finnes i alle prøver og fungerte som vår lasting kontroll.
In vivo-Xenotransplantat modell
Alle protokoll godkjenninger ble oppnådd før utbruddet av studien fra Animal Care komité McGill University Health Center. Hunn atymiske mus (nu /nu stamme, 4-6 uker gamle; Charles River Laboratories, Wilmington, MA) ble benyttet for vår xenograft modell blærekreft, som tidligere rapportert [13]. I korte trekk ble mus injisert subkutant med KU7 (10
6 celler pr injeksjon). Et annet eksperiment med den samme metoden som er utført ved hjelp av 253J-BV blærekreftcellelinjer. For å lette adhesjon ble cellene suspendert i 200 mL Matrigel (BD Biosciences, Franklin, NJ) før injeksjon. Tumorene fikk feste seg og vokse i en uke før randomisering i 4 grupper svarende til de forskjellige behandlingsgruppene, og hver gruppe bestående av 14 mus. 1
st gruppe ble behandlet med et placebo (5% glukoseoppløsning i vann). De to
nd gruppen mottok RAD001 oralt (mikroemulsjon fortynnet i 5% glukoseoppløsning) ved en dose på 1,5 mg /kg daglig. I 3
rd gruppe, ble svulster utsatt for ioniserende stråling på en fraksjonert dosering totalt 9 Gy (3 × 3Gy) annenhver dag i løpet av den første uken av behandlingen. I 4
th gruppe ble mus gitt RAD001 ved den ovennevnte dosering en dag før starten av tumoren strålebehandling. Mus ble fulgt i 4 uker fra starten av behandlingene. Kroppsvekt og dyrs atferd ble overvåket gjennom forsøket. Tumorer ble målt (lengde og bredde) to ganger i uken ved hjelp av en Vernier skyvelære for å beregne volum (V = [(lengde x bredde
2) x (π /6)] som tidligere rapportert [13]. Musene ble avlivet i en CO
to kammer ved slutten av behandlingen. Svulster ble høstet, straks veiet og konservert fast eller frosset for fremtidige studier.
Immunhistokjemi
tumorsnitt ble erholdt fra mus behandlet med placebo, stråling, RAD001 og kombinasjonsregimet. de parafin innleiret tumorer snitt ble montert på objektglass for farging. etter de-paraffinization og hydrering, ble antigen gjenfinning utført i å oppvarme prøvene med 5% citrat-bufferoppløsning (pH 7,0). seksjonene ble inkubert over natten ved 4 ° C med en p21 spesifikt antistoff (fortynning 1:25). HRP-konjugert geite-polyklonal-anti-kanin-IgG sekundært antistoff ble tilsatt og inkubert ved romtemperatur i 1 time. 3,3′-Diaminobenzidin ( DAB) substrat (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) ble brukt for fargeutvikling i henhold til produsentens instruksjoner. Lysbilder ble sett under et Leica Diaplan invertert mikroskop utstyrt med en Leica DFC300FX kamera (Leica, Wetzlar, Tyskland). Bildene ble tatt med en Leica Application Suite. Analysen er basert på et gjennomsnitt av 5 brennpunkter, ved 40 x forstørrelse, og viser levedyktige celler, og en beregnet H-stillingen ble beregnet ved å summere produkter av de prosentvise celler farget ved et gitt fargeintensitet (0-100) og fargeintensitet (0 for negativ farging, en for lav og 2 for høy farging).
statistisk analyse
t-test (uparet, to-halet) ble benyttet i alle statistisk analyse. Signifikans ble satt til p. 0,05
Resultater
Relativ sensitivitet av et panel av blærekreftcellelinjer til RAD001 og ioniserende stråling
Vi har nylig vist at et panel av ni blære kreft cellelinjer viser relative forskjeller i deres RAD001 følsomhet og følgelig RAD001 behandling resulterte i relative forskjeller i mTOR-hemming og vekst arrest, som overvåkes av MTT-analyser. Med disse dataene, vi var i stand til å dele våre cellelinjer inn i 3 grupper basert på deres RAD001 følsomhet [13] som følger: relativt motstandsdyktig (UM-UC3, UM-UC13, KU7 (GI50≥50 nmol /L)), moderat følsomme (253J-P, 253J-BV, RT4 (GI50 50 nmol /L)). og til slutt svært følsom (UM-UC1, UM-UC5, UM-UC6 (GI50≤0.5 nmol /L) i denne studien ser på virkningene av kombinerte behandlinger (RAD001 og stråling), ble klonogene analyser brukes til å klassifisere de seks cellelinjene som ble testet i henhold til deres relative følsomheter for å IR til forskjellige strålingsdoser (fig. 1A). Basert på disse relative følsomheter for stråling, cellelinjer var delt inn i tre grupper, motstandsdyktig, moderat motstandsdyktig, og sensitive. den motstandsdyktig gruppen omfatter UM-UC5 med høyest overlevende brøkdel, moderat motstandsdyktig inkludert UM-UC13, KU7, UM-UC3, UM-UC6 mens 253J-BV hadde en lavere overlevende fraksjon og er derfor definert som et strålingsfølsomt cellelinje. Vi sammenlignet med responsen av disse seks cellelinjer til hver av RAD001 og ioniserende stråling. Basert på dataene i figur 1B og tabell 1, konkluderte vi at det ikke er noen korrelasjon mellom følsomheten til RAD001 og følsomheten for ioniserende stråling.
Pletterte celler ble utsatt for ioniserende stråling for å måle virkningene på vekst av klonogene assay, som beskrevet i Metoder. (A) Basert på de innsamlede resultatene, var vi i stand til å klassifisere disse cellelinjene som stråling-sensitive, moderat følsom og -relatively motstandsdyktig. (B) Den RAD001 IC50 ble plottet mot helningen på kurven for hver celle linje i klonogene analysen når de behandles med IR.
Ioniserende stråling aktiverer AKT mens RAD001 hemmer S6 fosforylering
det er blitt rapportert at ioniserende stråling aktiverer AKT i den overlevende cellefraksjon [17], [21]. Da dette kan være forbundet med resistens mot behandling, celledød og overlevelse flukt, søkte vi å bestemme om strålingseksponering av blærecancerceller ville føre til AKT aktivering. For dette formål blir en forholdsvis resistent cellelinje, KU7, ble utsatt for ioniserende stråling over tid (0 til 60 min) og lysert for å analysere pakt ved direkte Western blotting ved anvendelse fosfo-spesifikke AKT antistoffer rettet mot S473 fosforyleringssetet. Resultatene i figur 2A viser at faktisk AKT ble raskt aktivert etter 15 min av strålebehandling og denne aktiveringen vedvarte ved 30 og 60 min. Disse resultatene dermed innebære at KU7 gjennomgå en aktivering av pro-onkogene overlevelse vei etter eksponering for ioniserende stråling. I alle forsøkene, er nivået av pakt økte ved behandling med ioniserende stråling til et maksimum og redusert etterpå. På samme måte som KU7 celler er også relativt RAD001 motstandsdyktig, ble de behandlet med RAD001 å konstatere at målet mTOR ble hemmet. For dette formål, ble nivået av fosforylert S6 bestemt ved anvendelse av et antistoff som er spesifikt til serin-rester 240/244 i S6 protein. Som forventet, RAD001 var potent i nedad fosforylering nivåer på mTOR nedstrøms signalmolekyl og mål S6, som vist ved 30 minutter etter behandling (fig. 2B), og denne inhibering er vedvarende 24 timer etter-behandling (data ikke vist). Videre ble lignende resultater oppnådd med andre blærecancercellelinjer (253J-BV, UM-UC3, og UM-UC6) behandlet med bestråling og RAD001 (data ikke vist).
(A) KU7 celler ble behandlet med 4 Gy av ioniserende stråling. Celler ble lysert 15, 30 og 60 minutter etter behandling for å analysere AKT aktivering (p-AKT; øvre rad) ved hjelp av Western blot. Totalt nivåer av AKT er vist i den nederste raden. (B) KU7 celler ble behandlet med 5 Gy av stråling, 100 nM av RAD001 eller begge deler, og lysert. Nivåene av Akt og S6 fosforylering ble analysert ved Western blot. Totalt nivåer av Akt og S6 uttrykk vises. Lignende resultater ble oppnådd når 253J-BV, UM-UC3, og UM-UC6 ble behandlet med stråling og RAD001 alene og i kombinasjon (data ikke vist).
Kombinere RAD001 med ioniserende stråling reduserer koloni betydelig dannelsen
å gi innsikt i effektene av å kombinere RAD001 med ioniserende stråling på blærekreft cellelinjer, overvåket vi brøkdel av overlevende celler over tid ved hjelp klonogene analyser. Etter behandling ble cellene belagt overvåket over tid og antall kolonier ble tellet. Den RAD001 dosen ble opprettholdt på GI50 for hver cellelinje, mens strålingsdosen ble variert. I alle cellelinjer testet (253J-BV, UM-UC6, KU7, UM-UC3, UM-UC13, og UM-UC5), ble det observert en signifikant nedgang i antall kolonier for celler behandlet med kombinasjonsbehandling sammenlignet med enten ioniserende stråling alene, eller den ubehandlede kontroll (fig. 3). Interessant, mens denne nedgang i overlevende fraksjon ble observert i alle cellelinjene som ble testet, ble den mest dramatiske relativ nedgang når begge behandlingene ble kombinert sett med to mest følsomme cellelinjer til RAD001 (UM-UC5 og UM-UC6). I alle testede cellelinjer, våre resultater peker til en additiv effekt på vekst ved kombinasjon RAD001 med ioniserende stråling. Det er verdt å merke seg at en lavere hemming av colonic dannelse ble observert i de to cellelinjer (UM-UC5 og UM-UC6) som ble preget opprinnelig av vårt laboratorium for å være den mest følsomme for RAD001. Dette ligger i første rekke med den colonogenic analysen selv hvor colonic formasjonen (bestemt ved hjelp av et universelt angitt kolonistørrelse), mens følsomheten for RAD001 ble gjort med en enzymatisk analyse (MTT). Dette avviket i følsomheter for analysene, lengde av analysen, kombinert med rask doblingstiden, kan forklare de klonogene resultatene for disse to cellelinjer.
seks cellelinjer ble behandlet med RAD001 i 12 timer før eksponering overfor ioniserende stråling og ytterligere dyrket som angitt i Methods. Kolonidannelse ble målt etter cellefiksering og farging med krystallfiolett, 10-14 dager etter behandling, avhengig av cellelinjer. Resultatene var statistisk signifikant (p 0,05). I den kombinerte behandling sammenlignet med behandling enten alene i alle testede cellelinjer
Behandlingen med RAD001 og ioniserende stråling induserer både en økning i prosentandelen av celler i G0 /G1 og G2 faser av cellesyklus
for å få innsikt i mekanismen som ligger bak observert veksthemming, ble cellesyklus analyse utført av flowcytometri for å studere fordelingen av celler i de ulike fasene av cellesyklusen 48 timer etter hver behandling alene og i kombinasjon. Cellene ble behandlet med en dose på RAD001 ekvivalent med deres GI50 (som strekker seg 0,5 til 75 nmol /L), så vel som 4Gy av ioniserende stråling. Resultatene er vist i figur 4. RAD001 induserte en G0 /G1 arrest i alle blærekreftcellelinjene som ble testet: KU7 62% ± 4%, UM-UC3 71% ± 6%, UM-UC6 77% ± 3% og 253J- BV 67% ± 4% sammenlignet med de ubehandlede kontroller, 54% ± 3%, 64% ± 2%, 66% ± 2% og 55% ± 3%, respektivt. Prosentandeler representerer forholdet mellom celler i hver fase i forhold til det totale antall celler. Som forventet, ioniserende stråling ledes hovedsakelig til et G2 arrest, illustrert ved en signifikant økning i prosentandelen av celler i den fase som følge av behandling med ioniserende stråling: KU7 38% ± 4%, UM-UC3 23% ± 4%, UM-UC6 19% ± 4% og 253J-BV 22% ± 3% i forhold til sine respektive ubehandlede kontroller: 23% ± 2%, 19% ± 3%, 14% ± 3% og 4% ± 2%, respektivt. I den kombinerte arm med RAD001 og ioniserende stråling, observerte vi både en økning i prosentandelen av celler i G0 /G1 og G2 fasene (fig. 4). Mer spesielt, en reduksjon i prosentandelen av celler i S-fasen ble observert sammenlignet med hver behandling alene eller med kontrollgruppen (ingen behandling), og dette Parallelt med en økning i prosentandelen av celler i G0 /G1 og G2 faser. Til sammen har vi konkludert med at cytostatisk effekt av RAD001 kombinert med ioniserende stråling viser en hemmende additiv effekt på progresjon av celler gjennom syklusen sin.
cellelinjene ble dyrket og behandlet med RAD001 alene, ioniserende stråling alene og med en kombinasjon av RAD001 og stråling. For sistnevnte serie, prøver var forbehandlet med RAD001 i 6 timer før stråling. Celler ble fiksert og farget for propidiumjodid inntaket ved 48 timer etter behandling, og deretter målinger ble utført ved strømningscytometri. Andelen av cellepopulasjoner i de ulike faser av cellesyklus er vist for hver cellelinje med fargede barer (G0 /G1: Orange /Blå S: Rød og G2: Yellow)
RAD001. og ioniserende stråling endre nivåene av cellesykluskontrollpunkter cyklin D1, p27kip1 og p21
Basert på ovennevnte cellesyklusanalysedata, og for ytterligere å forstå mekanismen ved hvilken RAD001 og ioniserende stråling seg sammen for å hemme cellevekst, vi testet sannsynligheten for forandringer i ekspresjonsnivåer av forskjellige regulatorer av cellesyklusen, særlig i forbindelse med sjekkpunkter som cyklin D1, p27 og p21. Resultatene i figur 5 viser tilfellet med KU7, brukt som en representant for gruppen av cellelinjer funnet å være relativt resistente mot både ioniserende stråling og RAD001. Når det er sagt, er en dose på RAD001 ekvivalent til den GI50 av at cellelinjen ble anvendt for å sikre en reaksjon på RAD001 behandling. Våre resultater viser at nivået av cyclin D1, som er et protein som kreves for G1 /S overgang gjennom cellesyklusen, ble redusert etter 24 timers behandling med RAD001 (fig. 5), et funn som støtter våre observasjoner på cellesyklus Endringer. I motsetning til dette nivå av p27, som er et protein som også er forbundet med G1 /S overgang, endret i en invers korrelasjon (øket) etter 24 timers behandling med RAD001, ioniserende stråling, og den kombinerte behandling sammenlignet med kontrollen (fig. 5). Interessant nok nivå av p21, som også er forbundet med inhibering av cellesyklusprogresjon, ble redusert i celler behandlet med RAD001 alene sammenlignet med kontroll, eller stråling (fig. 5). Nivåene av p21 øker i respons til behandlingen for stråling sammenlignet med kontrollen, og nivåene av p21 er på sitt høyeste når cellene behandles med både RAD001 og ioniserende stråling. Det er bemerkelsesverdig at lignende resultater ble oppnådd for cyclin D1, p27 og p21, i alle testede cellelinjer:. UM-UC3, UM-UC6 og 253J-BV:
Blære kreft celler ble behandlet med RAD001, ioniserende stråling (IR) eller den kombinerte behandling. De ble lysert 24 timer etter behandling, som beskrevet i Metoder. Western blot-analyse for Cyclin D1, p27kip1 og p21 i KU7 celler og normalisert i nedre paneler som en funksjon av den aktin-nivå målt i parallell. Lignende resultater ble oppnådd for alle cellelinjer testet, UM-UC3, UM-UC6 og 253J-BV (ikke vist).
Kombinere RAD001 behandling med ioniserende stråling hemmer tumorvekst i humane blærekreft xenograft betydelig modell, sammenlignet med hver behandling alene
for å finne betydning og for å kontrollere om
in vitro
data med hensyn til effekten av å kombinere RAD001 og ioniserende stråling på veksten av blærekreft cellelinjer kan transponeres
in vivo
, vi brukte KU7 blærekreft cellelinje å vokse som subkutane tumorxenotransplantater i atymiske mus. I alle musene, ble tumorer dokumentert innen de første 10 dager etter implantasjon. Det var ingen kroppsvekt tap eller noen betydelig toksisitet direkte forbundet med RAD001 og ioniserende stråling behandlinger under hele varigheten av undersøkelsen (totalt 5 uker). I mus behandlet med kombinert RAD001 og ioniserende stråling, var der en maksimal hemmende effekt på blærekreft progresjon, som indikert ved den signifikante reduksjon i tumorvekt sammenlignet med behandling enten alene eller placebo-gruppen (gjennomsnittlig tumorvekt 31 mg for kombinasjonsterapi sammenlignet med 117 mg med RAD001 alene, 80 mg med IR, eller 340 mg for placebo, P 0,05) (figur 6).. Lignende resultater ble også oppnådd ved bruk av 253J-BV cellelinjer der en kombinert behandling oppnås maksimal hemmende effekt på blærekreft progresjon etter 4 ukers behandling sammenlignet med kontroll. De samme resultater ble demonstrert ved anvendelse av tumor vekstkinetikk når tumorvolum ble målt gjennom behandlingsvarighet (data ikke vist). Vår p21 immunhistokjemi flekker på xenograft seksjoner bekreftet våre funn fra den vestlige blot analyse for p21 nivåer
in vitro plakater (Fig. 7). Nivåene av p21 signifikant (p 0,05) økte etter behandling med stråling og kombinasjonsregimet sammenlignet med placebo. Videre våre data indikerte en svak nedgang, selv om statistisk ikke-signifikant, av p21 nivåene i RAD001-behandlede gruppe alene.
atymiske mus blæretumormodell av KU7 ble anvendt som beskrevet i Metoder. Tumorvekter (i gram) nådd ved eksperimentelle endepunkt og uttrykt som midlere vekt av tumorer høstet for hver gruppe av mus i 4 behandlingsmetoder, som angitt. Lignende funn innhentet ved hjelp 253J-BV celler (data ikke vist).
(A) Immunohistochemistry ble brukt til å påvise nivåer av p21 i parafininnstøpte mus xenograft blærekreft vev som ble behandlet med placebo, IR, RAD001 og i kombinasjon. (B) Kvantifisering av immunhistokjemi data viste en signifikant økning i p21-ekspresjon som ble observert i tumorer behandlet med ioniserende stråling, og i kombinasjon sammenlignet med placebo og RAD001 behandling.
diskusjon
strålebehandling er en sentral del av mange kreft behandlingsregimer dermed sin omfattende bruk. Imidlertid ioniserende stråling ser ut til å bidra til en ugunstig økning av signalisering gjennom de PI3K /AKT /mTOR-pro-overlevelsesreaksjonsveien. I den foreliggende undersøkelse, ble det observert forskjeller i følsomhet av et panel av seks blærecellelinjer overfor ioniserende bestråling, med noen som var mer motstandsdyktig enn andre. Vi demonstrerte også aktiveringen av AKT etter eksponering for ioniserende stråling. Flere faktorer kan potensielt være determinant i aktiveringsmekanismen til PI3K /AKT sti følgende ioniserende stråling og deretter bidra til kreftceller i etableringen av motstanden [22]. Blant annet den forbedrede aktivitet av viktige enzymer så som telomerase-aktivitet [23] samt involvering av signalmolekyler slik som den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) og RAS [24], [25] kan forklare hvorfor noen tumorer ikke svare på stråling så vel som andre. Spesielt, EGFR signalisering gjennom de PI3K /AKT ble rapportert å regulere DNA-avhengig protein kinase katalytiske subenheter, som er en del av DNA-reparasjon av veier slått på følgende stråling [26]. Selv om disse observasjonene understreker den viktige rollen som aktiveringen av PI3K /AKT spiller i kreft radioresistance, viser vi at blokkering av PI3K /AKT /mTOR sti med RAD001 vises som et verdifullt middel for å forbedre effektiviteten av strålebehandling i blæren kreftceller. Den mekanismen som RAD001 utstillinger dette bedret effekt trenger fortsatt videre evaluering. Det kan ganske enkelt være at blokkering returen aktivering av veien følgende stråling er tilstrekkelig til å minke radioresistance;
