Abstract
Tykktarmskreft er den nest vanligste årsaken til kreftdødelighet i den vestlige verden med metastaser som vanligvis kan finnes på diagnosetidspunktet. Screening for forplantning og metastatisk atferd i en roman kimære-mus tykktarmskreft modell, drevet av mutant p53 og β-catenin, førte til identifisering av en unik, invasiv adenokarsinom. Sammenligning av genomet av denne tumor, CB42, med genomer fra ikke-forplanter tumorer ved matrise CGH og sekvensering avslørte et fragment på kromosom inneholdende fem CDK6 og CDK14, og en KRAS mutasjon, respektivt. Monoterapi lite molekyl hemming av enten CDK6 eller MEK, en kinase nedstrøms KRAS, førte til tumorvekstinhibitering in vivo, mens kombinasjonsbehandling ikke bare ført til tilbakegang av de subkutane svulster, men også nær komplett hemming av lungemetastaser; således, genomisk analyse av denne tumor førte til effektiv, individuell behandling
relasjon:. Zhou Y, Rideout WM III, Bressel A, Yalavarthi S, Zi-T, Potz D, et al. (2014) Spontane Genomisk Endringer i et kimært Modell av tykktarmskreft Aktiver metastase og effektiv guide kombi Therapy. PLoS ONE 9 (8): e105886. doi: 10,1371 /journal.pone.0105886
Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, USA
mottatt: 9 april 2014; Godkjent: 24 juli 2014; Publisert: 27 august 2014
Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble i sin helhet finansiert av Aveo Pharmaceuticals. Aveo Pharmaceuticals er /var arbeidsgiver for alle forfatterne unntatt Marcus Bosenberg. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Dette arbeidet ble i sin helhet finansiert av AVEO Pharmaceuticals Inc. Marcus Bosenberg var en betalt konsulent for AVEO. Alle andre forfattere er enten nåværende eller tidligere ansatte i Aveo Pharmaceuticals. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er en av de fire mest vanlige og dødelige krefttyper forårsaker omtrent 53 000 dødsfall årlig i USA alene. Heldigvis er det framgang mot CRC som både forekomsten og dødeligheten av denne svulsten typen har vært fallende de siste ti årene på ca 2-3% per år. Til tross for denne generelle utviklingen, er gjennomsnittlig fem års overlevelse for stadium 4 metastatisk kolorektal kreft fortsatt en grim 12,5% [1]. Mange genetiske endringer som bidrar til CRC er blitt identifisert blant mutasjoner som inaktiverer tumorsuppressorgener (for eksempel p53 og APC mutert i 52% og 76% av tumorer, henholdsvis) eller aktiverer onkogener (f.eks KRAS og BRAF mutert i 42% og 10% av tumorer, henholdsvis) [2], [3]. Pasienter med stadium 3 eller 4 CRC trenger mer effektive og mindre giftige behandlinger for å forbedre deres overlevelse og livskvalitet. Som mer målrettede behandlingsformer blir tilgjengelige, har kliniske studier vist at mange av dem er bare beskjedent effektive når de brukes som monoterapi. I motsetning til dette, noe viser signifikant bedre resultater når den kombineres med eksisterende kjemoterapeutika eller andre målrettede medikamenter [4], [5]. For å få mer presist skjermen medikamentkombinasjoner for de som vil gi størst nytte, er nøyaktige og prediktive modeller nødvendig. Genmanipulerte musemodeller av CRC har blitt utviklet i løpet av de siste to tiårene hovedsakelig ved inaktivering av tumorsuppressorgener (f.eks APC1638N, [6] for gjennomgang se [7]). Eksisterende prekliniske modeller for CRC faller primært inn i fire kategorier: etablert cellelinje xenografter, pasient avledet xenografter (PDX), germline genmodifisert mus modeller (GEMMs) og Cre-Lox betingede GEMMs. Hver av de modellsystemer har sitt eget sett av fordeler og ulemper med cellelinje xenografts å være den letteste å utføre, men mest fjernt beslektet til den primære tumor i verten, mens i den andre enden av spekteret Cre-Lox aktivert GEMMs oppstå i ønsket vev i en immunkompetente vert.
Den siste samling og spredning av svulster direkte fra pasienter har gitt nye ressurser PDX som opprettholder større svulst heterogenitet, både histologisk og genetisk [8]. Men etablering av humane tumorer hos immunsupprimerte mus utøver seleksjonspress både i tilpasning til en mus vert og vanligvis til en graviditet utenfor området (dvs. subkutan). Dette begrenser iboende rekken av interaksjoner som normalt forekommer mellom tumor, stroma og det hematopoetiske system. I flere undersøkelser forplantningen effektiviteten av pasient-avledet materiale i immunkompromitterte mus har vært blandet, med rapporter om opp til 77% av meget avansert humane tykktarm tumorer som forplanter seg i nakne mus [9].
GEMMS overvinne mange av begrensninger xenografter. Nåværende GEMMs av tykktarmskreft utvikle svulster i et kort tidsperspektiv drevet av karakteristiske mutasjoner i avgjørende onkogener og svulster suppressor gener (for oversikt se [7]). Noen eksisterende musemodeller av tykktarmskreft, som benytter relevante RAS-mutasjoner, har gitt innsikt på potensielle legemiddel svar [10]. Vår tilnærming til å skape GEMMs innebærer en ikke-germline, mus chimera basert system som vi har generert komplekse modeller kreft, inkludert bryst og lunge modeller [11], [12]. Vår embryonale stamceller tilnærmingen gjør den raske generasjon av nye doxycycline induserbare modeller med flere genetiske modifikasjoner uten å måtte krysse avle de modifiserte lene sammen. Svulster fra disse modellsystemer har blitt formert som allotransplantater og brukes til å generere arkiver av tumormateriale og således tillate potensielle undersøkelse av legemiddelrespons og korrelasjonen av den respons på tumoregenskaper [12], [13]. Molekylær karakterisering av microarray og rekke komparativ genomisk hybridisering (aCGH) analyser av slike formert biblioteker av svulster har vist at flere kreft fremme mutasjoner hadde skjedd i tumorlinjer påvirker deres vekst, metastase, og respons på terapi [12], [13] , [14]. Mens en rekke biomarkør genuttrykk skjermer blir stadig mer nyttig i regi terapi i pågående kliniske studier (for eksempel 21, 50, 70 kandidater henholdsvis for Oncotype Dx, PAM50, og Mammaprint [15]) og neste generasjons sekvensering av kjente kreftgener (n = 236) er i ferd med å lede gunstig valg av behandling for et bredt spekter av tumortyper [16], den økende kostnader i genomet bred screening av uttrykk, kopiere nummer, og sekvensen kan gi en objektiv metode for å fastsette effektiv kreftbehandling.
i denne artikkelen beskriver vi prosessen med å lage en ES celle basert modell for tykktarmskreft drevet av p53 mutasjon, og induserbar aktivert β-catenin (
CTNNB1
).
CTNNB1
mutasjoner er funnet i 5% av menneskelig CRC med og uten tilsvarende mutasjoner i
APC product: [2] spesielt i arvelig nonpolyposis tykktarmskreft (HNPCC) pasienter hvor hyppigheten av
CTNNB1
mutasjon stiger [17]. De svulster som oppstår fra disse ES cell baserte modeller inneholde identisk genetisk bakgrunn og innledende driver mutasjoner; Men de har en tendens til å tilegne seg de novo mutasjoner og kopiere nummervariasjoner i løpet tumorigenesis som skaper begrensede mangfold som kan påvirke behandlingsrespons. Den β-catenin (ΔN131) -driven modellen vi presenterer her genereres nye innsikt i genetiske endringer som er nødvendige for mus tumor forplantning, metastase, og legemiddelrespons.
Resultater
ES cell basert chimera kolon modell
Vi har tidligere rapportert om en ny tilnærming for modellering kreftutvikling hos mus ved hjelp av ES-celle chimeras. Sammenlignet med de konvensjonelle kimlinje-transgene modell, er en av de viktigste fordelene ved det kimære måte at det tillater celler som onkogene mutasjoner å eksistere sammen med naboceller som er genetisk villtypen, bedre etterligner den onkogene prosessen i humane kreftformer. Sletting av APC, en kjent svulst lyddemper er en viktig hendelse i tykktarm kreft progresjon. Inaktivering av APC resulterer i forhøyede atom β-catenin nivåer, noe som forhindrer terminal differensiering og fremmer proliferasjon. For å generere kolon modell ES cellelinjer, startet vi med en Ink4a +/- linje (H12C23) og sekvensielt endret de to p53 alleler: den første p53-allelet ble gjort betinget ved å sette inn loxP nettsteder flankerer eksoner 2 til 7 som skifter fra et funksjonelt allel til en null allel på Cre mediert rekombinasjon; den andre p53-allel har en lox-stop-lox kassetten settes inn i intron en kombinert med R172H mutasjon i exon 5 som resulterer i ekspresjon av en onkogen versjon av p53 etter at Cre-formidlet fjerning av stopp kassetten. Deretter ble en GAPDH-lox-stoppe-lox-rtTA-IRES-luciferase kassett (aktivator /markør kassett) ble konstruert, som, når den aktiveres av Cre uttrykker rtTA (omvendt tetracyklin trans-aktivator) og Luciferase samtidig. Til slutt, ES-cellene ble ko-transfektert med konstrukter for GAPDH-lox-stop-lox-rtTA-IRES-luciferase, Villin-Cre og Teto-β-catenin (ΔN131), en forkortet versjon av β-catenin som mangler regionen som binder APC /AXIN kompleks og konstitutivt akkumuleres i kjernen. I ikke gastrointestinale epitelceller som følge chimeras vil Villin arrangøren være stille, og dermed grobunn vil ikke komme til uttrykk. I dette tilfellet, en p53 allel forblir villtype og den rtTA aktivatoren kassetten er inaktiv (fig. 1 ES celle). I målcellene i tarmepitelet hvor Villin promoter driver Cre uttrykk, vil bare mutant p53 uttrykkes og aktivatoren kassetten vil uttrykke rtTA- og Luciferase og derfor β-catenin (ΔN131) uttrykk kan være spesielt indusert i disse cellene ved doksycyklin (Fig . en GI celle og GI celle + DOX).
A). I ES-celler: 3 transgene kassetter ble satt inn: Villin-Cre, GAPDH-lox-stop-lox-rtTA-IRES-Luciferase, og TetO- β-CateninΔN131; alle tre tie i ES-celler. I tillegg ble en p53 allel floxed og uttrykker villtype p53 i ES-celler og den andre allelet var målrettet med lox-stop-lox og R172H punktmutasjon, som er funksjonelt null i ES-celler. B). I mage-tarm epitel, ekspresjon av Cre fører til sletting av de to lox-stop-lox kassetter samt floxed p53 allel. p53 uttrykk vil bytte fra villtype til mutant form, og uttrykk for rtTA- og Luciferase vil slå på. C). i nærvær av doksycyklin, vil rtTA binde til Teto promotoren og aktiverer transkripsjon av β-CateninΔN131.
Twenty ES-kloner som var positive for alle fem genetiske elementer som ble injisert inn i blastocyster for å generere kimærer som ble gitt 2500 ppm Doxycycline mat etter avvenning. Etter induksjon i 2-4 uker, for hver ES linje, 2-3 kimærer med 80% kimerisme av pelsfargen ble ofret og vev ble innhentet fra 3 forskjellige regioner i tarmkanalen. Vi analyserte ekspresjon av Cre, rtTA- og β-catenin ved QRT-PCR og rekombinasjon av de p53-alleler og aktivatoren kassetten ved hjelp av PCR. Disse analysene identifiserte 5 genetisk og funksjonelt validerte ES linjer (91A2, 91C5, 91D3, 91F5, og 91F7) for videre studier (data ikke vist).
β-catenin induksjon i kolonepitelet fører til invasive adenokarsinomer
Ett hundre og tjueni kimære mus ble generert ved hjelp av de fem validert kolon modell ES cellelinjer og matet med doksycyklin mat etter avvenning. Etter 3 måneder med induksjon, vi skjermet for okkult blod på månedlig basis og mus positivt for 2 måneder på rad ble overvåket daglig og ofret når vekttap ble observert. Tarmkanalen ble dissekert på langs, skylles i PBS for å fjerne avføring, deretter flatet på et papirhåndkle og skannet under et stereoskop for polypper og svulster.
Førti-fire prosent av kimære mus indusert med doksycyklin utviklet tarm neoplastiske lesjoner innen 3-17 måneder med en median svulst ventetid på 11 måneder (fig. 2B, og tabell 1). Bioluminescent avbildning demonstrert økt Luciferase aktivitet i nedre mageregionen av tumorbærende mus (Fig. 2A). I disse musene, identifiserte vi i gjennomsnitt 2-3 neoplastiske lesjoner per mus; Histologisk analyse bekreftet 60% av lesjonene som polypper, 25% som adenomer og 15% som adenokarsinomer (Fig. 2C). Interessant nok ble de tidlige lesjoner (polypper og adenomer) funnet likt i både den øvre og nedre tarmkanal, mens den store majoriteten (85%) av avanserte lesjoner ble funnet i tykktarmen. De adenokarsinomer varierte 2-8 mm i diameter og lignet menneske colontumorer histologisk. Invasjonen i sub-slimhinne laget ble observert i 70% av adenocarcinomer (Fig. 2C). Disse resultatene viste at atom β-catenin, i kombinasjon med p53-mutasjonen, var tilstrekkelig til å drive ondartet tumor utvikling i mage-tarmkanalen.
A). Bioluminescent avbildning av tre kimære mus etter tre måneder med doksycyklin induksjon. Selvlysende signaler ble påvist i nedre del av magen i to mus. B). Kaplan-Meyer kurve som viser ventetid for tykktarmskreftutvikling i kimære mus. C). Histologisk sammenligning av normal mage-tarmkanalen, godartede polypper, og adenokarsinom fra kimære mus. D). Kjemisk kolo farging for mucin og immunhistokjemisk farging for β-catenin, Ki-67, og cyclin D1 i normal GI epitel, polypper og adenokarsinom.
Molekylær karakterisering av β-catenin drevet colontumorer
Analyse ved hjelp av immunhistokjemi av kandidatproteinene i β-catenin drevne primærsvulster angitt aktivering av flere veier som er kjent for å spille en rolle i kolon tumorigenesis. Den normale kolonepitelet former velorganisert krypten-villus enheter (Fig. 2C), med skille stamceller som ligger i krypten regionen og differensierte ikke-dele celler i villus som gjenspeiles av en begrensning av Ki-67 og cyclin D1 positive celler til krypten. Mens membranøs β-catenin er detektert på alle epitelceller, er atom β-catenin som bare finnes i 20-30% av cellene i krypten (fig. 2D). I kontrast, ble den normale krypten-villus struktur tapt i både polypper og invasive adenokarsinomer. p-catenin farging ble ikke lenger begrenset til membranen; istedenfor 80-90% av cellene viste cytoplasmisk og atom β-catenin positivitet. 60-80% av svulstene celler viste sterk Ki-67-farging og Cyclin D1 positivitet, noe som viser at tumorcellene var aktivt prolifererende. I tillegg, selv sterk positiv farging for epitel-mucin ble påvist i 20-40% av cellene i alle benigne polypper studert, i samsvar med deres colonic epithelial opprinnelse, mucin ble ikke påvist i de adenokarsinomer ble undersøkt (fig. 2D). En brøkdel av adenokarsinomer viste også over uttrykk for EGFR (data ikke vist).
Serie utbredelsen av tykktarmskreft
Den lange ventetiden for denne modellen, i forbindelse med asynkron svulst utvikling, presentert en hinder for effektivt å gjennomføre prekliniske terapeutiske studier i en statistisk meningsfull måte. For å overvinne det problemet, vi utforsket måter å utvide svulsten innsamlet materiale fra denne modellen gjennom serie in vivo formering. Så langt har rapporter om mus kolon svulsten forplantning vært fraværende fra litteraturen. Vi testet in vivo formering i 3 forskjellige stammer av immunsupprimerte mus, (SCID, NOD-SCID og Nude) i 3 forskjellige steder (subkutan plass, nyre kapsel, og cecal sub-mucosal plass) (se tabell S1 for detaljer) av enten svulst fragmenter eller enkeltcellesuspensjoner innebygd i Matrigel. Formering av tumor materiale fra 82 svulster ble testet i totalt 107 sider. Av de svulstene som ble testet, bare en opprettet en spredd svulst linje, CB42, som oppsto i cecum av en kimære mus fra ES linjen 91C5 (tabell 2 og tabell S1).
CB42 vokste robust i begge nyrekapselen, og det subkutane plass; for eksempel når 10
5 celler ble injisert per område, svulster ble synlig i 5-7 dager, og nådde humane grenser innenfor en annen 2 uker. Histologisk analyse viste at arkitekturen av tumorer formert enten i nyren eller det subkutane plass lignet som primærtumor (Fig. 3A, B og data ikke vist). De formerte svulster beholdt mer enn 80% av celler som utviser cytoplasma og kjernefysisk β-catenin uttrykk (Fig. 3 C) og holdt sine epiteliale egenskaper som gjenspeiles av homogen IHC farging for pan cytokeratin (Fig. 3D) og E-cadherin (data ikke vist ). Immunhistokjemisk farging for HGF var positiv i 70-80% av disse tumorceller, og farging for fosfo-MET MET viste høy ekspresjon og aktivering, men merkelig nok ingen EGFR positivitet (fig. 3C-F og data ikke vist) som vanligvis ses i human CRC [18] og andre primære svulster i ES-chimera B-catenin kolon modell
A) Histologi (H . E farging) av CB42 primærtumor. B). Histologi (H E) av CB42 etter subkutan formering (CB42P1). C). Immunhistokjemisk farging for β-catenin. D). Immunhistokjemisk farging for pan Cytokeratin. E). Immunhistokjemisk farging for HGF. F). Immunhistokjemisk farging for fosfor-Met.
Tumor linje CB42 metastasizes til leveren og lungene
metastaser presenterer den virkelige terapeutisk utfordring i CRC. For å validere vår CB42 modellen vi studerte sin metastatisk potensial. Vi først gjennomført to pode assays: poding av tumorceller i lungene gjennom intravenøs injeksjon, eller i leveren gjennom intrasplenic injeksjon, etterfulgt av splenektomi. Suksess priser for både seeding analysene var høy: i lungene analysen, 10 av 10 mus utviklet svulster innen 4-6 uker etter injeksjon som resulterer i økt gjennomsnittslunge vekter for disse musene til 1,5 g (sammenlignet med 0,2 g for normal lunge) ; i leveren analysen, 7 av 10 mus utviklet synlige tumorknuter i leveren 5-8 uker etter injeksjonen. En andre serie av eksperimenter metastase nærmere rekapitulert prosessen med metastase i humane kreftpasienter. Tumorceller ble først injisert inn i det subkutane plass. Når inokulert svulster nådd 500-800 mm
3 i størrelse, skåret vi dem kirurgisk og overvåkes mus nøye for generell sunt utseende og vekt tap, en indikasjon på spredning til indre organer. Åtte av 10 mus viste ingen tegn til gjenvekst av den subkutane tumor og to hadde bare en meget liten nodul (
3 200 mm) på operasjonsstedet. Imidlertid ble alle 10 mus syk i løpet av 3-5 uker etter operasjonen. Obduksjon viste metastasering til lungen i alt 10 mus og fjernt lymfeknutemetastase hos 6 av de 10 mus. Nøye histologisk undersøkelse av andre indre organer, inkludert hjernen, lever, milt og nyre viste ingen tumorknuter (data ikke vist). Lunge og lymfeknutemetastaser lignet den primære svulsten histologisk, og var positive for pan cytokeratin farging (fig. 4). Det var ikke klart imidlertid basert på dette eksperiment, hvorvidt operasjonen ble årsaksmessig koblet til tumorcellespredning til fjerntliggende organer, eller bare tillatt i disseminerte tumorer mer tid til å vokse i den fjerntliggende organ ved å forlenge levetiden til disse mus. For å skille disse to muligheter, vi gjentok eksperimentet uten kirurgisk fjerning av den subkutane tumor. Musene ble avlivet når de subkutane svulster nådd humane grenser og undersøkes nøye for tegn på metastasering. Små hvitaktige noduler ble funnet i lungene av mus 5/10, og to av disse mus hadde hovne hjelpe lymfeknuter i nærheten av halsen. Dette eksperimentet viste at CB42 var kompetent til å metastasere spontant
Lung metastase H E på 5x (A) og 20X (C) objektivforstørrelsen; lymfeknutemetastase H E på 5x (B) og 20X (D) objektivforstørrelsen; pan-cytokeratin immunhistokjemi av lunge (E) og lymfeknute (F) metastaser.
Spontan genkopitallet endringer i CB42
Siden CB42 var unik blant våre β-catenin drevet colon svulster i sin evne til å forplante og metastaserer, utførte vi en rekke objektive genomiske analyser inkludert kledd komparativ genomisk hybridisering (aCGH) og sekvensering for å identifisere spontane genomisk endringer som korrelerte med forplantning og metastasering. Genomisk DNA isolert fra CB42 primære og underhud, serielt-forplantet (passasje 3, merket som CB42P3) tumorprøver sammen med DNA fra 7 andre primære svulster som ikke forplanter ble valgt for sammenligning av aCGH. Analyse av aCGH data avdekket flere amplikonene som var til stede i bare subkutant forplantet CB42 svulster (CB42P3), men ikke den primære CB42 svulst, eller noen av de andre primær colontumorer (Fig. 5A).
En ). aCGH profilen til CB42 primærtumor og passasje tre spredte svulst. En 3,5 Mb fragment på kromosom 5 ble detektert bare i den forplantes tumor. Prober for CDK6 ble farget i gult og prober for Cdk14 ble farget i blått. B). RT-PCR-analyse for ekspresjon av gener 7 i kromosomet 5 fragment. De relative uttrykk verdier av CB42P4 tumorer (n = 4) ble normalisert til de av normal cekale epitel (n = 4). C). Western Blot analyse for nivåer av Cdk4 og CDK6 i CB42 og 4 humane tykktarmkreft cellelinjer. D). Frekvens av CDK6 og CDK14 forsterkning i humane kreftprøver fra 13 vevstyper. Data ble hentet fra CBio nettside.
Den mest fremtredende amplicon var en 3,5 MBP region på kromosom 5 mellom CDK6 og Steap1 som inneholder mer enn 25 kjente gener. Vi undersøkt ved QRT-PCR ekspresjonen av 7 kandidat gener innenfor amplikonet og oppdaget at tre av de 7 gener ble betydelig overuttrykt i sammenligning med normal mage-tarmkanalen epitel: CDK6, Cdk14 (Pftk1) og Fzd1 (figur 5B.). Western blot-analyse av CB42 og flere humane tykktarm tumor xenograft linjer bekreftet høy ekspresjon av CDK6 i CB42 og SW620 og detekterbar CDK6 i HCT116 og HCC2998 indikerer at aktivering av CDK6 kan være fordelaktig for humane tumorxenografter (fig. 5C). Analyse av (TCGA) database Cancer Genome Atlas funnet bevis for amplifikasjon av syntenic regionen i det humane genom, og avslørte at mens amplifisering av området var uvanlig i human CRC, det varierte opp til 11% av mage tumorer (fig. 5D) .
mutasjoner identifisert av genomsekvense
i tillegg til å kopiere nummer endringer, vi undersøkt DNA fra formert CB42P3 svulster for mutasjonsendringer av hele genomet, exome, og RNA sekvensering som konsekvent identifisert 9 mutasjoner i ekson regioner (tabell 3). En av de mutasjoner som skyldes en endring av Glycine til cystein i kodon 12 posisjonen til KRAS genet. Etterfølgende pyro-sekvensering av DNA fra både primær og propagert CB42, så vel som 10 andre primære tumorer bekreftet KRAS mutasjonen bare i forplantes CB42, men fant ingen KRAS mutasjoner i noen av de andre prøvene, noe som tyder på at aktivering av KRAS ble ikke påkrevet for primær kolon startfasen i CRC-modellen, men var nødvendig for ondartet vekst av svulsten under forplantning og metastasering.
vekst og metastasering av CB42 er MET /HGF vei uavhengig
siden MET ekspresjon og aktivering ble forhøyet i formert CB42 (fig. 3F) og rollen til MET i invasjon og metastasering er godt støttet i litteraturen [19], [20], [21], testet vi om MTT-reaksjonsveien kan spille en viktig rolle i CB42 spredning og metastasering. For å teste denne hypotesen, gjennomførte vi en serie av 3 eksperimenter. I det første eksperimentet, behandlet vi mus implantert med subkutane tumorer CB42 med crizotinib (50 mg /kg po qd), et lite molekyl inhibitor av MET og ALK. Overraskende, til tross for det høye nivået av ekspresjon og aktivering MET, behandling av CB42 med crizotinib hadde ingen effekt på tumorveksten (TGI = 0%, fig. 6A). I det andre forsøket, studerte vi hvorvidt crizotinib kunne hemme CB42 metastase. CB42 tumorceller ble injisert subkutant og de primære tumorer ble kirurgisk fjernet etter 14 dager, når den gjennomsnittlige størrelsen på svulsten nådde 500 mm
3. Disse mus ble cohorted inn i en kjøretøy gruppe (n = 10) og en behandlingsgruppen (n = 10), og behandlingen begynte den andre dagen etter operasjonen. Mus i begge grupper begynte å bli syke 2-3 uker etter operasjonen. Når de ble avlivet, ble lungemetastaser funnet i 9/9 mus i bærergruppen og 10/10 mus i crizotinib behandlede gruppe, mens lymfeknutemetastase ble iakttatt i 2 mus fra hver gruppe. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i antall eller størrelse på metastaser mellom behandlingsgruppene, noe som tyder på at hemming av MET ikke påvirke metastatisk vekst etter etablering av fjerne metastatiske svulster.
A). MET-hemmer crizotinib hemmet ikke CB42 tumorvekst. B). CDK4 /6 inhibitor PD0332991 betydelig hemmet CB42 tumorvekst (*** P 0,001). C). MEK1 /2-hemmer PD0325901 fullstendig blokkert CB42 tumorvekst (*** P 0,001). D). Kombinasjon av CDK4 /6 og MEK1 /2-hemmer indusert CB 42 tumor regresjon (**** P 0,0001). E). Subkutane tumor volum av de tre behandlingsgruppene ved slutten av studien. Kombinasjonen er betydelig mer potent enn CDK4 /6-hemmer alene (**** P 0,0001) eller MEK hemmer alene (*** P 0,001). F). Undersøkelse av lungelapper for metastatiske noduler avslørte at både CDK4 /6-inhibitor og MEK-inhibitor vesentlig hemmet CB42 lungemetastaser (* P 0,05), men kombinasjonen var betydelig mer effektiv enn noen av midlene alene (**** P 0,0001) og nesten fullstendig eliminert lungemetastaser.
i det tredje forsøket, testet vi om MET hemming kan hindre tumorcelle spredning av små primære svulst områder. I dette eksperimentet, dosering med bærer eller crizotinib startet to dager etter subkutan injeksjon av CB42-celler inn i resipientmus. De subkutane svulster ble kirurgisk fjernet to uker senere og doseringsfortsatte til musene ble syk. Lungemetastaser ble observert hos alle musene, uansett om de fikk crizotinib eller kjøretøy. Basert på disse eksperimentene, konkluderte vi med at MET ikke var nødvendig for CB42 tumorvekst og metastasering.
Betydelig hemming av underhudsfett og metastatisk tumorvekst av CDK4 /6 eller MEK hemming
Siden spredte CB42 hadde et genomisk forsterkning av CDK6 og sterk cellulær ekspresjon (se ovenfor), testet vi en forbindelse, PD0332991, som hemmer både CDK4 og CDK6 [22]. Til tross for bekreftelse av Western blot som viste sterk CDK6 og svakere CDK4 ekspresjon i CB42 (fig. 5C), en 3 dagers in vitro-analysen proliferasjon viste at PD0332991 ikke hemmer proliferasjonen av en CB42-avledet cellelinje som selv ved den høyeste dosen (10 pM) (data ikke vist). I kontrast, behandle mus implantert med subkutane CB42 svulster med PD0332991 (125 mg /kg, po QD) sterkt hemmet subkutan tumorvekst (TGI-75%, p 0,00005, figur 6B.) Og redusert lungemetastaser. Ved slutten av eksperimentet, bare fem av 15 mus behandlet med PD0332991 hadde synlige noduler i lungene, mens alle 15 mus i bilens gruppene hadde synlige lungemetastaser. Det var i gjennomsnitt fem lunge knuter per mus i PD0332991 gruppen vs. 18,3 i bilen (p = 0,00002). Samlet foreslått disse resultatene at CDK6 overekspresjon lar musen GI svulster til å vokse utenfor colonic under mucosal miljø og at aktivering av CDK6 kan bidra til GI svulster gjenlevende og blomstrende i en metastatisk setting.
Siden CB42 hadde også fått en aktivering Kras mutasjon og litteratur foreslått at KRAS mutante tumorer var følsomme for MEK-hemmere [23], MEK-inhibitor PD0325901 ble testet for sin evne til å hemme veksten av CB42 in vitro og in vivo. MEK hemming blokker nedstrøms signal av KRAS. In vitro, PD0325901 potent blokkert ERK1 /2-signalisering i CB42-celler (data ikke vist). In vivo, en enkeltdose av PD0325901, enten ved 5 mg /kg eller 15 mg /kg, resulterte i fullstendig inhibering av ERK1 /2 fosforylering 4 timer etter dosering (data ikke vist). Behandling med PD0325901 av subkutane CB42 tumorer i mus, ved enten 5 mg /kg eller 15 mg /kg, fører til nesten fullstendig tumorvekstinhibering (93% og 96% deltaTGI henholdsvis fig. 6C). Scanning av lungene ved slutten av studien viste også en betydelig reduksjon av både antall og størrelse av metastatiske noduler i de behandlede mus sammenlignet med kjøretøygruppe. Disse data viste at vekst og metastasering av CB42 som en subkutan allograft var også sterkt avhengig av KRAS mutasjonen.
Regresjon av CB42 ved kombinert inhibering av KRAS /MEK signalering og CDK4 /6
de multiple genetiske lesjoner som er identifisert i CB42 foreslått at maksimal terapeutisk effekt kan oppnås med en kombinasjon av målrettede midler som hemmer flere av feilregulert veier. For å teste denne hypotesen, behandlet vi CB42 med MEK hemmer PD0325901 (5 mg /kg) i kombinasjon med CDK4 /6 inhibitor PD0332991 (125 mg /kg). Kombinasjonen av disse to stoffene var godt tolerert og førte ikke til betydelig vekttap ( 10%) (data ikke vist). Kombinert behandling med PD0332991 og PD325901 ble dramatisk tilbakegang tumorer med et gjennomsnitt på 35% (fig. 6D), mens de enkle middel behandlingsarmene igjen viste en betydelig tumorveksthemning sammenlignet med kontroller. Sammenligning av de individuelt plottede tumorstørrelser mellom de tre behandlingsgruppene på slutten av studien illustrert hvordan betydelig og ensartet tumorregresjon var i kombinasjonsterapi (fig. 6E). Også ved slutten av studien, ble lungene dissekert og undersøkt for observerbare metastatiske noduler. Færre metastaser ble observert i begge monoterapi behandlingsarmene (ned til 5 knuter /mus sammenlignet med 15 knuter /mus i bilen kontroll arm), mens spesielt, kombinasjonsarmen gjennomsnitt mindre enn en knute per mus (Fig. 6F). Derfor, for CB42, begge anskaffet genetiske skader bidratt til subkutan tumorvekst samt metastatisk potensial og /eller spredning tumorvekst.
Tvungen uttrykk for CDK6 og CDK14 resulterte i propagatable colontumorer
Selv om det er noen litteratur tyder på at både CDK6 [24], [25] og CDK14 [26], [27] er involvert i ulike aspekter av tumorgenese, deres potensielle rolle i tykktarmen tumorigenesis er for tiden ikke er godt forstått. Vi tok fordel av fleksibiliteten i ES chimera modell tilnærming og lagt doxycycline-induserbar ekspresjonskassetter av CDK14 alene eller i kombinasjon med CDK6 og Fzd1 til den opprinnelige kolon modellen ES linjen 91C5 å etablere nye modellseriene.
