Abstract
Kreft celle invasjon og metastasering er de viktigste negative prognostiske faktorer for kreft i bukspyttkjertelen. Identifikasjon av biomarkører knyttet til utfallet av kreft i bukspyttkjertelen kan gi nye innfallsvinkler og mål for kreftbehandling. Målet med denne studien er å undersøke forholdet mellom uttrykket av RhoT1, Smad4 og p16 og metastasering og overlevelse hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Analysen viste at de høye cytoplasmatiske uttrykk nivåer av RhoT1, Smad4 og p16 i kreft i bukspyttkjertelen vev hadde signifikant negativ korrelasjon med lymfeknutemetastase (LNM) (
P
= 0,017,
P
= 0,032
P
= 0,042, henholdsvis). Imidlertid ble det observert noen signifikant sammenheng mellom perinevral invasjon (PNI) og uttrykk for ovenfor tre proteiner (alle
P
0,05). I tillegg er overlevelsesanalyse viste at lave nivåer av RhoT1 og Smad4 var signifikant assosiert med dårligere overlevelsen (
P
= 0,034,
P
= 0,047, respektivt). I konklusjonen, disse resultatene tydet på at lav-uttrykk nivåer av RhoT1 og Smad4 var signifikant assosiert med LNM og kortere overlevelse. RhoT1 kan betraktes som en potensiell ny markør for å forutsi utfallet hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Jiang H, han C, Geng S, Sheng H, Shen X, Zhang X, et al. (2012) RhoT1 og Smad4 er korrelert med lymfeknutemetastase og total overlevelse i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE syv (7): e42234. doi: 10,1371 /journal.pone.0042234
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 02.12.2011; Godkjent: 05.07.2012; Publisert: 31.07.2012
Copyright: © Jiang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. HJ er støttet av Key Discipline Construction Project av Pudong Health Bureau of Shanghai, Kina (Grant No: PWZxkq2010-05). HG er støttet av China National 863 Prosjekt Foundation for Cancer Genomics (Pancreas Genomics) (Grant No: 1006AA02A302), henholdsvis. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. HS, XS, XZ, SZ, og HG er ansatt av National Engineering Center for biochip på Shanghai. Det er ingen konsulenttjenester, patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er den dominerende formen for kreft i bukspyttkjertelen, som rangerer fjerde i kreftrelaterte dødsårsaker [1]. Det ble anslått at 43140 amerikanere ble diagnostisert og 36800 pasienter døde av kreft i bukspyttkjertelen i USA i 2010 [2]. Til tross for omfattende kliniske og vitenskapelige innsats, har prognosen for denne svært dødelige sykdommen ikke bedret seg betydelig de siste tiårene [2], [3]. Median overlevelse etter diagnose er 3-6 måneder uten behandling, og resectional kirurgi og adjuvant behandling økning median overlevelse til rundt 23 måneder [4].
Mange studier har funnet at RAS regulerer vekst og metastasering av kreft i bukspyttkjertelen celler. Rho familien av GTPases er en underfamilie av Ras super. Rho GTPases har blitt rapportert å bidra til de fleste trinn av kreft initiering og progresjon blant annet oppkjøpet av ubegrenset spredning potensial, overlevelse og unndragelse fra apoptose, vev invasjon og etablering av metastaser [5], [6], [7], [8 ], [9], [10], [11], [12]. Rho familien av GTPases inneholder 20 medlemmer. Det meste av det vi vet om rollen til Rho GTPases i kreftcelle invasjon kommer fra studier av det prototypiske medlemmer RhoA, RHOB og RhoC, Rac1 og Cdc42. Men lite er kjent om rollene til andre mindre preget familiemedlemmer i kreft. Noen tidligere studier har avdekket at RhoA og RhoC uttrykk er ofte økt i kreft hos mennesker, mens RHOB er ofte nedregulert. RhoT1 tilhører mitokondrie Rho GTPase familie [13]. Imidlertid er RhoT1 protein klassifisert som atypiske GTPases fordi det ikke er regulert som de andre klassiske GTPases [14], [15]. Så langt vi vet lite om hvilken rolle RhoT1 i kreft progresjon. I en tidligere studie har vi identifisert totalt 1276 gener som er forskjellig uttrykt i PDAC. Blant dem er 691 gener oppregulert og 585 gener er nedregulert gener, inkludert RhoT1, Smad4 og p16 [16]. Derfor er vi interessert i å vite om RhoT1 er tilsvarende involvert i utviklingen av kreft.
I tillegg har tidligere studier har rapportert at mutasjon av Smad4 er identifisert i ca 50% av bukspyttkjertelen adenokarsinomer [17]. En rekke studier har vist at tap av Smad4 observeres generelt i bukspyttkjertelen karsinogenese, og inaktivering av Smad4 er assosiert med dårlig prognose i bukspyttkjertelkreft [18], [19]. Likeledes er det blitt vist at tap av p16-ekspresjon observeres i de fleste bukspyttkjerteltumor [20], [21], og utgjør en viktig hendelse i flertrinnsprosessen av pankreatisk duktus celletransformasjon. Imidlertid er betydningen av p16 og Smad4 inaktive for komplekse og vevs-spesifikke aspekter av kreft i bukspyttkjertelen progresjon, slik som angiogenese og metastase, er mindre forstått [22]. Det er også relativt få studier som har undersøkt den mulige rollen Smad4 og p16 i utviklingen av LNM og PNI i bukspyttkjertelkreft.
Kreft celle invasjon og metastasering er viktige skritt i bukspyttkjertelkreft progresjon, og er viktigste årsakene til dårlig overlevelse i bukspyttkjertelkreft. Forutsi invasjon og metastasering for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen kan gi viktig innsikt i bukspyttkjertelkreft progresjon og prognose. Identifikasjon av biomarkører knyttet til utfallet av kreft i bukspyttkjertelen kan gi nye innfallsvinkler og mål for kreftbehandling. Derfor har vi gjennomført denne studien er å undersøke uttrykket av RhoT1, Smad4 og p16 i kreft i bukspyttkjertelen, og å analysere om de uttrykk mønstre av RhoT1, Smad4 og p16 er korrelert med metastatisk potensial og er prediktive for klinisk utfall hos pasienter med bukspyttkjertel kreft.
Resultater
Pasient Kjennetegn
Som vist i tabell 1, prøven besto av 162 pasienter med diagnosen kreft i bukspyttkjertelen (102 menn og 60 kvinner). Gjennomsnittsalderen ved diagnose var 59 år gammel (range 34-85 år gamle). Mediantumorstørrelse var 4 cm (spredning 0,5 til 14 cm). De fleste svulster (117/162, 72%) var godt differensiert, åtte (8%) ble moderat differensiert, og 31 (19%) var dårlig differensiert. 80 (49,4%) svulster ble kategorisert som amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) stadium I, 80 as (49,4%) stadium II, ingen som fase III, og 2 (1,2%) som stadium IV. 83 (51,2%) av 162 pasienter hadde PNI. 65 (40,1%) av 162 pasienter hadde LNM, Median antall lymfeknuter (LNS) undersøkt ble 7. Median antall LNS vurdert i node-positive pasienter ble 10 sammenlignet med en median på 6 lymfeknuter i node- negative pasienter (
P
= 0,007).
foreninger mellom de ulike Clinicopathological faktorer og tilstedeværelsen av LNM og PNI
Sammenhenger mellom de ulike clinicopathological faktorer og tilstedeværelsen av LNM og PNI ble analysert for å identifisere risikofaktorer for LNM og PNI (tabell 2). Disse faktorene inkludert: kjønn, alder ( 60 år eller ≧ 60 år), lokalisering av tumor (hodet eller kroppen og bak), lang diameter på tumor ( 4,0 cm eller ≧ 4,0 cm), tumor differensiering (dårlig eller moderat /godt). Plassering av tumor ble signifikant assosiert med LNM (
P
= 0,03). Det var ingen signifikant sammenheng mellom LNM og alder, kjønn, lang diameter på svulsten og tumor differensiering (
P
0,05 for hver). I tillegg ble det observert noen signifikant sammenheng mellom PNI og alder, kjønn, plasseringen av svulst, lang diameter på svulsten og tumor differensiering (alle
P
0,05).
Expression av RhoT1, Smad4 og P16 i bukspyttkjertelen vev og Paracancerous Vev
RhoT1 og p16 flekker ble lokalisert til cytoplasma (figur 1). Selv om det ble Smad4 uttrykt hovedsakelig i cytoplasma (figur 1), ble noen Smad4 sett i kjernen. De cytoplasmatiske uttrykk nivåer av RhoT1, Smad4 og p16 var lavere i kreftvev enn paracancerous vev (
P
0,0001,
P
0,0001,
P
= 0,002 , henholdsvis). Det var en sterk sammenheng mellom cytoplasma og kjernekraft Smad4 uttrykk (Spearman korrelasjonskoeffisient = 0,321;
P
0,0001). Imidlertid ble det ikke observert signifikant forskjell i atom Smad4 uttrykk mellom kreft vev og paracancerous vev (
P
0,05).
Paneler D, E og F henholdsvis viser positivt uttrykk for RhoT1, Smad4 og p16 i paracancerous vev. Alle bildene ble tatt på 200 × forstørrelse.
Foreninger mellom uttrykket nivåer av RhoT1, Smad4 og P16 og Clinicopathological funksjoner
Analysen viste at høyt cytoplasma uttrykk nivå RhoT1 var signifikant negativ korrelasjon med LNM i kreftvev (
P
= 0,003). Forskjellen holdt seg betydelig, selv etter justering for alder, kjønn, kreft beliggenhet og lang diameter tumor (
P
= 0,017). Tilsvarende cytoplasma uttrykk nivåer av Smad4 og p16 i kreftvev ble også negativt korrelert med LNM (
P
= 0,032,
P
= 0,042, henholdsvis). Men det var ingen signifikante assosiasjoner mellom PNI og uttrykket nivåer av tre proteiner (alle
P
0,05; Tabell 3). Siden ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom kreft vev og paracancerous vev, ble atom uttrykk for Smad4 eliminert fra videre testing foreningen med clinicopathological funksjoner. Logistisk regresjonsanalyse viste at cytoplasma uttrykk nivået RhoT1 i kreftvev fungerte som en selvstendig risikofaktor for LNM (
P =
0,042). Men ifølge analysen, de cytoplasmatiske uttrykk nivåer av Smad4 og p16 kan ikke brukes som uavhengige risikofaktorer for LNM (
P
0,05). I tillegg viste resultatene at ingen signifikant sammenheng ble observert mellom cytoplasmatiske uttrykk nivåer av RhoT1, Smad4, p16 og clinicopathological funksjoner, som blant annet alder, kjønn, tumor beliggenhet, størrelse, tumor differensiering, og AJCC scene (alle
P
0,05;. tabell 4)
i tillegg ROC kurver ble etablert for å vurdere den potensielle diagnostiske verdien av disse proteinene for å forutsi mellom prøver med LNM og prøver uten LNM. Analysen oppdaget at området under ROC-kurven (AUC) for RhoT1 var 0,629 [95%
konfidensintervall product: (
CI
) 0,541 til 0,718], AUC for Smad4 var 0,551 (95 %
CI
0461 til 0,640) og AUC for p16 var 0.480 (95% konfidensintervall 0,388 til 0,572). Den statistiske analysen viste at bare AUC-verdien for RhoT1 var betydelig større enn 0,5 (
P =
0.005). Ved cut-off på 75% (relativ ekspresjon positiv-hastighet), følsomheten til RhoT1 var 69,2% og spesifisiteten var 55,7% (figur 2-A).
Arealet under ROC-kurven (AUC) for RhoT1 , Smad4 og p16 var henholdsvis 0,629, 0,551 og 0,480. B viser ROC-kurven analyse av ekspresjonen av RhoT1, Smad4 og p16 for total overlevelse (
n =
70). AUC-verdier for tre proteiner var 0,667, 0,643 og 0,469, henholdsvis.
Survival Analysis
overlevelsesanalyse viste at overlevelse etter 5 år var 28,6%, median overlevelse var 14 måneder. Analysen av overlevelse viste LNM, tumor differensiering og scene (I
v
II) som negativt signifikant prediktor for kreft i bukspyttkjertelen OS (
P =
0.01,
P =
0.003,
P =
0,036, henholdsvis), og pasienter med lymfeknute ratio (LNR) 0 til 50% hadde en lengre median overlevelse (11 måneder) sammenlignet med pasienter som ikke hadde LNR ≧ 50% (8 måneder) (
P
= 0,035) (data ikke vist). I kontrast, gjorde evalueringen av OS etter alder, gruppe, kjønn, tumor plassering, tumor størrelse, og PNI indikerer ingen signifikante forskjeller (
P
0,05 for alle). To pasienter med stadium IV ble ekskludert fra overlevelsesanalyse fordi størrelsen på utvalget var for liten.
I tillegg er de fem-års overlevelse var 23,4%, 27,1% og 50%, 48,5% hos pasienter med lav ekspresjon og høy uttrykk for RhoT1 og Smad4 hhv. Pasienter med høye cytoplasmatiske uttrykk nivåer av RhoT1 og Smad4 oppnådd bedre overlevelse enn pasienter med lav-uttrykk nivåer av RhoT1 og Smad4 (
P =
0,034,
P =
0,047, henholdsvis figur 3) . Det var imidlertid ikke statistisk signifikant sammenheng i OS mellom pasienter med høy eller lav ekspresjon av p16 (
P =
0,148). AUC-verdier for RhoT1, Smad4 og p16 var 0,667 (95%
CI
0,532 til 0,802), 0,643 (95%
CI
0,509 til 0,777), og 0,469 (95%
CI
0,328 til 0,610) hhv. I tillegg, viste analysen at AUC-verdien for RhoT1 var signifikant større enn 0,5 (
P =
0,022). Imidlertid ble det observert noen signifikant forskjell mellom områdene Smad4 og p16 i ROC-analyse (
P =
0,051,
P =
0,674, henholdsvis) (Figur 2-B).
Høy uttrykk nivåer av RhoT1 og Smad4 korrelert med bedre overlevelse (
P
= 0,034,
P =
0,047, henholdsvis; log rank test), ble det ikke observert signifikant sammenheng mellom uttrykket nivå av p16 og total overlevelse (
P
0,05).
Tabell 5 viser resultatene av univariate Cox analyse for de store clinicopathologic funksjoner og for det cytoplasmatiske uttrykk for RhoT1 , Smad4 og p16 i kreft i bukspyttkjertelen vev. Analysen viste at variablene med en økning i risiko for død inkludert dårlig differensiering [
hasardratio product: (
HR
), 2,484; 95%
CI
, 1,329 til 4,642;
P =
0.004], Høyere stadium (
HR
, 1,82; 95%
CI
, 01.01 til 03.28;
P =
0,044) og LNM (
HR
, 2,09; 95%
CI
, 1,16 til 3,77;
P =
0,014) og lav-uttrykk for RhoT1 (
HR
, 1,92; 95%
CI
, 1,02 til 3,61;
P =
0,042). Multivariat analyse av Cox regresjon og korrigering for alle histopatologiske funksjoner og RhoT1 uttrykk viste at svulsten differensiering var en uavhengig prognostisk faktor (
P =
0,01), mens tumorstadium, LNM og RhoT1 uttrykk ikke var statistisk signifikant (
P =
0,623,
P =
0,101,
P =
0,3, henholdsvis) (tabell 5).
Diskusjoner
Aktuelle studier har rapportert at molekylære markører kan gi viktig informasjon for å forstå kreft i bukspyttkjertelen progresjon bedre. Sammenligning av protein uttrykk av kreftprøver med forskjellig invasjon og metastasestatus kan gi en ledetråd for nye metastaseassosierte faktorer. I denne studien fant vi at det var signifikante forskjeller i cytoplasma uttrykk for RhoT1, Smad4 og p16 mellom kreft og paracancerous vev. Disse resultatene underforstått at RhoT1, Smad4 og p16 var involvert i utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen. Videre ble lave cytoplasmatiske uttrykk for RhoT1 og Smad4 forbundet med LNM og lavere overlevelse hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
RhoT1 tilhører mitokondrie Rho GTPase familien og er først rapportert av Fransson
et al
i 2003 [23]. Tidligere studier har vist at Rho-GTPases var involvert i reguleringen av en rekke cellulære prosesser, og spilte en viktig rolle i kreftutvikling, kreft celle migrasjon, invasjon og metastasering. For eksempel, ble ekspresjonen av RhoA og RhoC ofte økt i humane tumorer, over-ekspresjon av RhoA og RhoC i tumorer var assosiert med metastase og invasjon [24]. I motsetning til dette, RHOB er ofte nedregulert, lav ekspresjon av RHOB er omvendt korrelert med tumor aggressivitet [25], [26], [27], [28]. Disse resultatene indikerte at det var forskjeller i uttrykk mønstre av Rho familiemedlemmer i human kreft. I denne studien fant vi at det cytoplasmatiske uttrykk nivået RhoT1 i kreftvevet var lavere enn i paracancerous vev, og ble betydelig redusert hos pasienter med LNM sammenlignet med de uten LNM (
P =
0,017) etter justering for alder, kjønn, kreft plassering og lengste diameter av tumoren. Som RHOB ble høy uttrykk for RhoT1 negativt korrelert med tumor aggressivitet. Imidlertid er den nøyaktige molekylære mekanisme stort sett ukjent. Flere tidligere studert har demonstrert at RhoT1 er implisert i regulering av mitokondriell homeostase og apoptose [15], [23], kan en mulig mekanisme er at kreftcellen er resistent mot RhoT1-mediert apoptose, og gjør det mulig å unngå apoptotisk celledød, noe som resulterer i initiering og progresjon av kreft. Så vidt vi vet, er dette den første studien som viser at det cytoplasmatiske uttrykk for RhoT1 er involvert i utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen. Til sammen tyder disse resultater på at RhoT1 kan være en ny tumorsuppressorgen av kreft i bukspyttkjertelen, og den lave cytoplasmisk ekspresjon av RhoT1 kan tjene som en potensiell prediktor for tendensen til å metastasere. Imidlertid ble ingen signifikant sammenheng mellom RhoT1 og PNI funnet i denne studien. Dette tyder på at forskjellene i mekanismene kan eksistere mellom LNM og PNI. Videre studier har klart behov for å belyse mekanismen av RhoT1 involvert i kreft i bukspyttkjertelen.
I tillegg er Smad4 en av de mest vanlig inaktiverte gener i kreft i bukspyttkjertelen, og tap av p16-ekspresjon observert i de fleste bukspyttkjertelkreft [20 ], [21]. I denne studien, har vi funnet at den lave ekspresjon av Smad4 var forbundet med LNM, som var i overensstemmelse med resultatene av noen tidligere studier [29], [30], [31]. Tanaka
et al product: [32] rapporterte at Tap av Smad4 protein uttrykk og kromosom 18q sletting ble tydelig i forbindelse med spredning. I en annen studie, Tanaka
et al
også funnet at uttrykket av Smad4 var svakere i lymfeknute positive gruppen sammenlignet med den negative gruppen (
P =
0,00075) [33]. Resultatene indikerte at Smad4 inaktivering var en vesentlig molekylær hendelse i prosessen med LNM. Videre har vi funnet at lav ekspresjon av p16 ble også korrelert med LNM, som var i overensstemmelse med følgende to studier. Zhi-Jie Fu
et al product: [34] rapporterte at p16 uttrykk i strupe plateepitelkarsinom (LSCC) ble nedregulert med cervical LNM (
P
0,05), den ned- uttrykk for p16 kan være en viktig prediktor for livmorhals LNM i pasienter med LSCC. Daniela
et al product: [35] har foreslått at positiv cytoplasmatisk farging p16 kan være knyttet til en lavere metastatisk potensial på primær malignt melanom. Dermed vår studie ytterligere bekreftet at Smad4 og p16 spilte viktig rolle i prosessen med LNM i bukspyttkjertelkreft.
I denne studien har vi undersøkt sammenhengen mellom cytoplasmatiske uttrykk nivåer av RhoT1, Smad4 og p16 og OS videre . Vi fant at pasienter med kreft hadde lav cytoplasma uttrykk nivå Smad4 hadde signifikant lavere overlevelse enn pasienter med høy cytoplasma uttrykk for Smad4 (
P =
0,047). Dette funnet var i samsvar med noen tidligere forskning [36], [37]. I tillegg er det mulig korrelasjon mellom ekspresjonen av noen medlemmer av Rho GTPases og klinisk resultat som tidligere er blitt beskrevet. For eksempel, Takao
et al product: [38] foreslått at Rac1 var involvert i LNM av urothelial karsinom av øvre urinveiene, og i forbindelse med en kortere sykdomsfri overlevelse (
P
0,001). Tilsvarende annen studie [28] rapporterte at høy uttrykk for RhoA og RhoC var assosiert ikke bare med muskel invasjon og LNM (
P
0,001,
P
0,05, henholdsvis ), men også med dårligere overlevelse i blærekreft (
P
0,0001). Omvendt, ble høy uttrykk for RHOB korrelert med bedre total overlevelse (
P
0,05). Imidlertid har hittil få studier har undersøkt forholdet mellom ekspresjonen av RhoT1 og utfallet eller prognosen for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. I denne studien fant vi at høy RhoT1 uttrykk ble omvendt korrelert med overlevelsen av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen (
P =
0,034). Videre resultatene av univariate Cox analyse for cytoplasma uttrykk for RhoT1, Smad4 og p16 i kreft i bukspyttkjertelen vev viste at lav-uttrykk for RhoT1 var korrelert med en økning i risiko for død (
P =
0,042). Til sammen antyder denne studien at RhoT1 kan betraktes som en potensiell prognostisk biomarkør for total overlevelse, og som en potensiell terapeutisk mål for intervensjon hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
I konklusjonen, våre funn markere at lav cytoplasma uttrykk nivåer av RhoT1 og Smad4 var signifikant assosiert med økende risiko for LNM og dårligere overlevelse. Så langt vi kjenner til, er dette den første rapporten som viser at uttrykket av RhoT1 kan potensielt brukes til å forutsi utfallet av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Flere studier med et større antall tilfeller er nødvendig for å validere våre funn.
Materialer og metoder
pasient
Studiet ble godkjent av etisk komité av biobanksenter relatert sykehus. Prøver med informert samtykke ble samlet mellom 1995 og 2009 fra 162 pasienter som gjennomgikk bukspyttkjertelen kirurgi, og ble lagret ved Biobank Center of National Engineering Center for biochip på Shanghai. 162 pasienter med både kliniske data og tilstrekkelig vev for inkludering i denne studien ble identifisert. Klinisk informasjon, inkludert alder, kjønn, presentasjon og patologiske funn inkludert tumor størrelse, scene, differensiering, perinevral invasjon og lymfeknute status, ble hentet fra original patologi rapporter. Patologisk iscenesettelse ble oppdatert i henhold til gjeldende amerikanske Joint Committee on Cancer retningslinjer. Siden vi samlet og analysert dataene i ettertid, oppfølgingsdata var ikke tilgjengelige i alle tilfeller. Med en cut-off date av desember 2011 ble 92 pasienter i vår studie tapt for oppfølging, 70 pasienter med kreft i bukspyttkjertelen ble inkludert i vår endelige overlevelse analyse. Total overlevelse ble målt fra tidspunktet for endelig operasjon for å dø av kreft i bukspyttkjertelen. Inntil nå 46 av de 70 pasientene døde.
Tissue microarray Construction
Originale formalinfikserte, parafininnstøpte prøvene ble brukt til å konstruere en PDAC vev microarray (FFPE TMA). Hematoxylin og eosin (H E) -stained standard lysbilder fra hver kreftprøve ble anmeldt av en enkelt patolog (MR), som ble blindet til prøven protein uttrykk status. Representative tumor regioner og dets paracancerous ikke-ondartede bukspyttkjertelen prøver (NMPs) ble valgt fra hvert vev blokk og 2 vev kjerner (0,6 mm i diameter) ble tatt fra hver region ved hjelp av en automatisert vev arrayer (Beecher Instruments, Sun Prarie, WI). Kjerner ble overført til den enkelte mottaker blokker. I alle tilfeller ble kjernene tatt normale hosliggende bukspyttkjertelen ble også anvendt som interne kontroller. Fem-micron seksjoner ble kuttet fra hver mottaker blokk. Seksjonene ble farget med H E for å bekrefte tilstedeværelse av tumor i hver kjerne
Immunohistochemistry og poeng
Dette er den første manuskript basert på vår bukspyttkjertelen TMA.. TMA glass ble deparaffinized, rehydrert gjennom gradert alkohol, vasket med Tris-bufret saltvann, og behandles ved hjelp av et streptavidin-biotin-peroksidasekompleks metode. Antigen gjenfinning ble utført ved microwaveheating seksjoner i 10 mm natriumsitratbuffer (pH 6) i 10 minutter. Etter slukking av endogen peroksidase aktivitet og blokkering av uspesifikke binding, 3 antistoffer (RhoT1, Santa selskap, polyclone antistoff, uttrykk i cytoplasma, Smad4, Abcam selskap, monoclone antistoff, uttrykk i cytoplasma og cellekjernen, p16, BD selskap, monoclone antistoff, uttrykk i cytoplasma) ble tilsatt ved en spesiell fortynning 1:15, 1:15,1:300 henholdsvis, etter som glir ble inkubert ved 4 ° C over natten. De tilsvarende sekundære biotinylerte kanin-antistoff ble anvendt ved en spesiell fortynning i 30 minutter ved 37 ° C. Etter ytterligere vasking med Tris-bufret saltvann, Snitt ble inkubert med StrepABComplex /pepperrotperoksidase (1:100, DAKO) i 30 minutter ved 37 ° C. Kromogent immunolocalization ble utført ved eksponering for 0,05% 3,3-diaminobenzidin tetrahydroklorid. Andre kjerner inneholder PDAC tjente som positive kontroller for de genene uttrykk. Normalt serum ble anvendt i stedet for primært antistoff som en negativ kontroll. Lysbilder ble kontra med hematoksylin før dehydrering og montering
Immunohistokjemiske flekker ble scoret semi-kvantitativt i henhold til andelen og intensiteten av positive-flekker epitelceller (cytoplasma og kjernekraft farging av epitel celler ble scoret uavhengig):. 1, 0 poeng for ingen farging; 2, 1 poeng for 20%; 3, 2 poeng for 20-75%; 4, 3 poeng for 75%, som beskrevet tidligere [39]. Deretter ble den gjennomsnittlige intensitet av immunreaktivitet gradert på en skala fra 0 til 3, (0, ingen, en, svak, 2, mellomliggende, og tre sterk). Den totale poengsummen var et produkt av resultatet for intensiteten og positiv rate på farging (Farging index = intensitet × positiv rate, fraværende, 0; mild, 1-3; moderat, 4-6, og sterk, 7-9). For dataanalyse, scoret Farging indeksen som enten fraværende eller mild ble ansett som lav-uttrykk, enten moderat eller sterk ble vurdert høy-uttrykk. Lysbilder ble anmeldt av 2 uavhengige observatører blindet for kliniske og patologiske data. I tilfeller av uenighet, ble en enighet ved felles gjennomgang.
Statistical Analysis
Sammenhengen mellom individuelle clinicopathological variabler og LNM, mellom de proteinene uttrykk og LNM ble statistisk analysert ved hjelp av χ
2-test. Uavhengige risikofaktorer for LNM ble bestemt ved hjelp av logistisk regresjonsanalyse for å identifisere disse variablene uavhengig assosiert med metastaser. Den optimale sensitivitet og spesifisitet av ekspresjonsnivåene av tre proteinene ble evaluert ved mottakeren bruksegenskap (ROC) kurve analyse. Kaplan-Meier metoden ble brukt for å estimere overlevelsesfunksjonen, og log-rank test ble benyttet for å undersøke statistisk signifikans. Cox modellen ble gjennomført for å anslå hazard ratio for OS og for å teste for uavhengige prognostiske faktorer. All statistikk var to-tailed med
P
verdi 0,05 ansett som statistisk signifikant. Analysene ble utført ved hjelp av SPSS programvarepakken (versjon 17.0).
