Abstract
Bakgrunn
Selv om androgener er brukt i kastrering resistent prostatakreft (CRPC), metastaser fortsatt uttrykke atom androgen reseptor (AR) og androgen regulert gener. Vi har nylig rapportert at C-terminal avkortet konstitutivt aktive AR spleisevarianter bidra til CRPC utvikling. Siden spesifikke antistoffer oppdage alle C-terminal avkortede AR varianter er ikke tilgjengelig, vårt mål var å utvikle en tilnærming for å vurdere utbredelse og funksjon av AR varianter i prostatakreft (PCA).
metodikk /hovedfunnene
Ved bruk av 2 antistoffer mot ulike regioner i AR protein (N- eller C-terminalen), viste vi lykkes eksistensen av AR variant i LuCaP 86,2 xenograft. For å vurdere utbredelsen av AR varianter i menneskelig PCa vev, brukte vi denne metoden på microarray inklusive 50 primær PCa og 162 metastatiske CRPC vev. RT-PCR ble benyttet for å bekrefte AR varianter. Vi har observert en signifikant reduksjon i kjerne C-terminale AR farging i CRPC men ingen forskjell mellom N- og C-terminale AR nukleær farging i primær PCa. Ekspresjonen av AR regulerte proteiner PSA og PSMA ble marginalt påvirket av reduksjon i C-terminal farging i CRPC prøver. Disse data tyder på at det er en økning i forekomsten av AR varianter i CRPC basert på vår evne til å skille atom AR uttrykk ved bruk av N- og C-terminale AR antistoffer. Disse funnene ble validert ved hjelp av RT-PCR. Viktigere, tap av C-terminal immunoreaktivitets og identifisering av AR varianter var annerledes avhengig av området av metastaser hos samme pasient.
Konklusjoner
Vi har fått utviklet en ny immunhistokjemisk tilnærming som var brukes til å fastslå utbredelsen av AR-varianter i et stort antall primær PCa og metastatisk CRPC. Våre resultater viste et øyeblikksbilde av generelle høy frekvens av C-terminal avkortede AR spleisevarianter og stedsspesifikke AR tap i CRPC, noe som kan ha nytte i stratifying pasienter for AR målrettet legemiddel
Citation. Zhang X, Morrissey C Sun S, Ketchandji M, Nelson PS, Sann LD, et al. (2011) androgen Receptor Varianter Det oppstår ofte i Kastrering resistent prostatakreft metastaser. PLoS ONE 6 (11): e27970. doi: 10,1371 /journal.pone.0027970
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 17 juni 2011; Godkjent: 29 oktober 2011; Publisert: 17.11.2011
Copyright: © 2011 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen er basert på arbeid støttet delvis av en PA1 National Institutes of Health stipend (PO1CA085859), Pacific Northwest prostatakreft SPORE stipend (P50CA097186), Prostate Cancer Foundation og Richard M. Lucas Foundation. CM fikk en karriereutvikling pris fra Pacific Northwest prostatakreft SPORE tilskuddet (P50CA097186). Denne forskningen er et resultat av arbeidet støttes av ressurser fra VA Puget Sound Health Care System, Seattle, Washington. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Metastatisk prostatakreft (PCA) som går igjen etter kastrasjon eller androgen deprivasjon terapi (ADT), betegnet kastrering resistent prostatakreft (CRPC), portends et dårlig resultat med høy dødelighet. Selv om det sirkulerende nivåer av androgener er tømt i CRPC, er tumorprogresjon ofte samtidig med forhøyede nivåer av androgenreseptoren (AR), aktivering av AR, og ekspresjonen av AR-regulerte gener. Men en økning i AR-ekspresjon ved i seg selv er vanligvis ikke tilstrekkelig til å engasjere den AR transkripsjon program [1]. Ulike mekanismer har vist seg å føre til AR trans og engasjere AR programmet etter kastrering. Disse omfatter utholdenhet av intratumorale androgener, ektopisk androgen syntese av svulsten enten fra binyrene androgener eller intratumoral
de novo
syntese, og forbedret androgen transport inn i svulsten av oppløst stoff bære organisk anion transporter proteiner [2] – [6] . Flere cytokiner og vekstfaktor-trasé har vist seg å være i stand til å aktivere den AR gjennom direkte binding eller krysstale mekanismer [7] – [13]. Endringer i AR co-regulatorer kan også modulere AR aktivitet når androgen nivåer er redusert [14] – [18]. Funksjonelt, krever hver av disse mekanismene som fremmer AR aktivering i CRPC karboksyterminal region av det modne protein som inneholder ligand-bindende domene (LBD).
I tillegg til mekanismene som fører til AR aktivering i CRPC som krever ligand, siste bevisene peker på eksistensen av alternativt spleisede former for AR mRNA som koder for reseptorer blottet for LBD, men beholder evnen til å engasjere transkripsjonen maskiner og fremme regulering av kjente — og potensielt nye — sett av transkripsjons mål [19] – [26]. Ikke bare er disse C-terminalt trunkert AR-varianter konstitutivt aktiv, men deres struktur forutsier en generell resistens mot terapeutiske midler så som AR-antagonister som krever binding til den LBD for aktivitet. Til dags dato har vi og andre har identifisert tre AR spleisevarianter i humane vevsprøver [22], [25] – [27]. AR-V1 koder for et spleisevariant består av eksoner 1-3 og ender i en kryptisk ekson (CE1), AR-V7 (også kalt AR3) koder for et protein med eksoner 1-3 og en terminal kryptisk ekson (CE3) og AR
v567es koder for et protein som består av eksoner 1-4, og på grunn av en ramme-skift på grunn av tap av exoner 5-7, exon 8 har et stoppkodon som genereres etter de første 10 aminosyrene som resulterer i en forkortet exon8. [22], [25] – [27]. Tilleggs AR spleisevarianter som er påvist i humane PCA cellelinjer [21], [24], [26] – [28]
Flere studier som evaluerer uttrykk for AR spleiseformer i et lite antall prostatakreft. tyder på at AR varianter er lettere påvist i CRPC forhold til hormon naive kreft, og kan dukke opp på grunn av seleksjonspress av AR målrettet terapi [22], [25], [26]. En fersk studie brukes QRT-PCR for å identifisere AR variant transkripsjoner i 40 beinmetastaser, hvorav 30 var fra CRPC, og fant en sammenheng mellom uttrykk for AR varianter og overlevelse [29]. Bestemme forekomsten av AR varianter i ulike kliniske tilstander av prostatakreft har blitt utfordret av krav til godt bevarte frosne vevsprøver for transkripsjon baserte analyser, og mangel på antistoffer som spesifikt kan påvise de fleste AR variant proteiner. For å overvinne denne begrensningen, søkte vi å dra nytte av det faktum at nye AR karboksy-termini kodet av alternativt spleisede former av AR mRNA ikke kan bli gjenkjent av antistoffer rettet mot vanlig C-terminalen av full-lengde AR (AR
FL). Vi antok at denne funksjon av AR-varianter gis en mulighet til å identifisere AR proteinvarianter i formalinfiksert vev ved å sammenligne den differensielle farging av antistoffer som gjenkjenner enten N- eller C-enden av AR. Derfor, i den foreliggende studien brukte vi antistoffer mot den N- eller C-terminale enden av det AR-protein for å avhøre et stort antall av godartet prostatavevet, primære hormon naive PCa og en serie av metastatisk CRPC å fastslå forekomsten av C-terminale avkortede AR varianter.
Materialer og metoder
Reagenser
de antistoffer som brukes i denne studien og arbeidsforholdene er oppført i tabell 1.
Tissue
Menneskelig primære og metastatiske PCA vev ble oppnådd som en del av PCA forskningsprogram og University of Washington Medical Center Prostate Cancer Donor Rapid Autopsy program, som er godkjent av University of Washington Institutional Review Board. The Institutional Review Board ved University of Washington Medical Center godkjent alle prosedyrer som involverer mennesker, og alle fag signert skriftlig informert samtykke. Menneskelig vev mikromatriser (TMA) består av 42 pasienter fra Prostate Cancer Donor Rapid Autopsy Program (inkludert 65 bløtvev metastaser og 120 benmetastaser) [30], 55 radikal prostatektomi pasienter (inkludert 28 normal prostata, 24 hyperplastic prostata, og 50 primær prostata kreftvev) ble anvendt. Den LuCaP 86,2 prostatakreft xenograft er et adenokarsinom som ikke svare på kastrering og ble avledet fra et menneske PCa blære metastasering. Den LuCaP 35 prostata kreft-xenograft er en adenocarcinom som reagerer på kastrering og er avledet fra en PCa lymfeknutemetastase. Disse xenotransplantater mislykkes i å vokse som cellelinjer, således at de blir opprettholdt ved seriepasseringer i SCID-mus. Den LuCaP 86,2 xenograft uttrykker et kjent C-terminalt avkortet variant AR AR
v567es som er konstitutivt aktiv. Den LuCaP 35 xenograft uttrykker bare bred type AR [25]. Frisk LuCaP 35 og 86,2 xenograft vev ble brukt til western analyse. Tjueto CRPC metastatiske vev fra hurtige obduksjons pasienter som korresponderer til vev på menneske TMA hadde vært hurtigfrosset i flytende nitrogen etter reseksjon og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Kliniske data vedrørende de 42 obduksjons pasientene er vist i tabell 2.
Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)
Totalt vev RNA ble isolert fra hakket frisk vev ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. To mikrogram av total RNA ble kuttet med DNase, og revers transkribert ved hjelp av Superscript First-Strand Synthesis System (Invitrogen). PCR ble utført ved hjelp AmpliTaq Gold® PCR Master Mix (Applied Biosystems). PCR produktene ble kjørt på 2% agarosegel og bilde bildene ble tatt ved hjelp AlphaDigiDoc Pro bildebehandlingssystem fra Alpha Innotech (San Leandro, CA). QRT-PCR reaksjoner ble gjort ved hjelp av en Applied Biosystems 7900 sekvens detektor med 5 ng av cDNA, 200 nM av hver primer par og Power SYBR Grønn PCR Master Mix eller TaqMan Universal PCR Master Mix fra Applied Biosystems.
Gene uttrykk nivåene ble målt ved relativ kvantifisering mellom RNA prøver, og brette uttrykk endringer ble bestemt ved 2-ΔΔCT metoden [31]. Alle QRT-PCR eksperimenter ble utført i tre eksemplarer, og husholdningsgenet RPL13A ble brukt som en endogen kontroll.
Primersekvensene er oppført i tabell 3.
Cell Kultur og stimulering
Vcap celler som uttrykte både AR
FL og AR
v567es variant ble dyrket til 80% konfluens i 30 mm plater i RPMI 1640 medium med 5% serum, og deretter byttet til RPMI-1640 medium med 5% trekull strippet serum i 24 timer. Dihydrotestosteron (DHT) 10
-9 M, MDV-3100 50 nM, eller MDV-3100 pluss DHT tilsatt til kulturene. Etter 24 timer ble totalt RNA samlet inn fra to brønner for QRT-PCR for å påvise AR
FL, AR
v567es og AR-V7 transkripsjoner. Forsøket ble gjentatt 6 ganger med hver gang tre paralleller, og den QRT-PCR-resultater ble normalisert til DHT behandlingsgruppe.
Western blotting
Frisk vev ble homogenisert og lysert med kald lyseringsbuffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl
2, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100) inneholdende Halt ™ fosfatase inhibitor cocktail og proteasehemmere (Thermoscientific). Komp lysater ble separert på SDS-PAGE, overført på en nitrocellulosemembran, blokkert i 5% melk-PBS-Tween og probet med respektive over natten ved 4 ° C. Membraner ble inkubert med pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Cell Signaling), og utviklet med ECL (Pharmacia Biotech). Membranene ble strippet i 30 minutter i Stripping Buffer (Thermoscientific) og re-probet med anti-β-actin-antistoff som en lastekontroll (Sigma-Aldrich). Uavhengige forsøk validert at denne stripping prosedyren ikke førte til tap av signal.
Immunohistochemistry
formalinfiksert parafin-vevssnitt (5 nm) ble deparaffinized og vannes ut. Antigen gjenfinning ble utført med 10 mM citratbuffer (pH 6,0) i en trykkoker (20 psi i 10 min). Endogene peroxide og biotin /avidin ble blokkert i 15 min med respektive agenter (Vector Laboratories). Etter inkubering med 5% normalt geite-hest-kyllingserum ved romtemperatur i 1 time ble snittene inkubert med primære antistoffer (tabell 1) ved 4 ° C over natten etterfulgt av biotinylerte sekundære antistoffer og SABC reagens (Vector Laboratories). DAB (Invitrogen) ble anvendt som kromogen, og hematoxylin som counterstain. Mus eller kanin IgG, etter behov, ved den samme konsentrasjon som det primære antistoff ble anvendt som en negativ kontroll og viste ingen ikke-spesifikk farging [32].
Immunhistokjemisk vurderings
Noen ubrukelig kjerner ble funnet i TMA på grunn av vev kjerne mangler, kreft nekrose, eller utilstrekkelig kreftceller. Disse kjernene ble ekskludert fra resultatene.
Farging ble vurdert ved hjelp av en kvasi-kontinuerlig atom AR score, skapt ved å multiplisere hver intensitetsnivå (0 for ingen skam, en for svak flekk, og to for intense flekken) etter den tilsvarende andelen positive celler, og deretter summere resultatene.
Ki-67 farging ble målt ved tilfeldig velge opp til 4 felt på 250 mikrometer
2 i hvert vev nettstedet. Totalt celletall og Ki67-positiv celle nummer ble tellet, og det endelige Ki-67-indeksen ble beregnet ved hjelp av positiv celletallet dividert med totalt celleantall.
AR antistoffer brukt i denne studien rettet tre forskjellige regioner av det humane AR protein. De immunogener av AR F39.4.1 (mot aa301-320) og AR441 (mot aa299-315) ble plassert i den N-terminale AR AR, mens C-19 (mot aa900-919) i den C-terminale. Derfor beskriver vi AR F39.4.1 og AR441 som N-terminale AR-antistoffer og AR C-19 som en C-terminal AR antistoff. Spesifikke mønstre av AR atom farging ble vurdert som: N + C + (tilsvarende positiv N-terminal og C-terminal AR farging i kjernen); N + C ↓ (C-terminale AR stillingen falt mer enn 50% i forhold til N-terminalen i cellekjernen) og N-C- (tilsvarende negativ N- og C-terminale AR-farging i kjernen). Vev i N ↓ C + gruppe ble ikke tatt med fordi de var sjeldne, og ikke i forhold til C-terminal avkortede AR varianter.
Statistisk analyse
Statistiske analyser av resultatene ble utført ved hjelp av Prism programvare (Prism Graphpad), der vi brukte Mann-Whitney test, og
p
verdier ≤0.05 ble valgt som statistisk signifikant.
Resultater
Alternativt spleisede former for AR kunne bli identifisert ved anvendelse av N- og C-terminale antistoffer
Flere AR transkripsjonsvarianter som er beskrevet som koder for AR polypeptider blottet for den C-terminale LBD på grunn av alternativ spleising exon [21], [24] – [28] . Imidlertid spesifikke antistoffer er ikke tilgjengelige for å påvise alle disse variantene i vev. Som antistoffer har blitt utviklet mot bestemte N-terminale og C-terminale domener av AR-protein, søkte vi å bestemme om disse reagenser kan brukes til å skille PCa som uttrykker forskjellige AR former. For å validere denne tilnærmingen, vi først evaluert to PCa xenograft linjer avledet i laboratoriet av en av forfatterne (RIV) og er kjent for å uttrykke forskjellige AR-kodende mRNA. Den LuCaP 86,2 xenograft, avledet fra et humant PCa blære metastase og opprettholdt ved seriepasseringer i uncastrated SCID-mus, har vist seg å ha en C-terminalt trunkert AR spleisevariant som hoppet eksoner 5-7 og som koder for et alternativt leseramme fra ekson 8 , utpekt AR
v567es. Den LuCaP 35 xenograft ble avledet fra PCA lymfeknutemetastase og uttrykker full lengde AR (AR
FL) kodende mRNA består av 8 eksoner og et protein av passende størrelse for transkripsjon [25].
Vi analyserte proteiner fra LuCaP 86,2 og LuCaP 35 xenografter av Western blot som bruker antistoffer som gjenkjenner N-terminale (AR 441) eller C-terminalen (AR C-19) fra AR
FL protein. I LuCaP 35 tumor, både AR-antistoffer påvises en lignende 110 KDa AR polypeptid som samsvarer med størrelsen av AR
FL. I LuCaP 86,2 tumor, ved siden av en svak 110 kDa bånd, N-terminale AR-antistoff også identifiseres et 80 KDa AR isoform som tilsvarte den antatte størrelsen av de C-terminale avkortet AR spleisevariant-AR
v567es mens C-terminale AR antistoff ikke (figur 1A).
(A) Western blot analyse av AR uttrykk i LuCaP 86,2 og LuCaP 35 xenografttumorer. (B) IHC-farging for N- og C-terminale AR på LuCaP 86,2 (a og b) og LuCaP 35 (C og D) xenograft tumorer. (C) IHC-farging for PSA (e), PSMA (f), Kromogranin-A (g), synaptophysin (h), Ki67 (i) og negativ kontroll (j) på LuCaP 86,2 xenograft. (D) IHC-farging for PSA (k), PSMA (l), Kromogranin-A (m), synaptophysin (n), Ki67 (o) og negativ kontroll (p) på LuCaP 35 xenograft. (Original forstørrelse x200, setter x400).
I likhet med Western blot resultat immunhistokjemisk analyse (IHC) av LuCaP 86,2 viste veldig svak kjernefarging med C-terminal AR (AR c-19) antistoff, men intens nukleær farging i serie delen med AR antistoff mot N-terminal (AR F39.4.1). Den LuCaP 35 svulst, vist seg å uttrykke bare AR
FL ved Western-analyse, viste ingen forskjell mellom N- og C-terminal AR farging av IHC (figur 1B). Disse data bekreftet at sammenlikne den N-terminale AR med C-terminale AR ekspresjon kunne identifisere C-terminale, avkortede varianter AR /mutasjoner i PCa vev.
AR
v567es har vist seg å være konstitutivt aktiv [25 ], dette er i overensstemmelse med det faktum at forskjellige AR immunoreaktivitet med N- og C-terminale antistoffer ble observert i kjernen. For å bekrefte atom AR aktivitet lenger, vi farget for AR-regulert PSA og PSMA proteiner. LuCaP 86.2 var immunoreactive for både Petroleumstilsynet og PSMA. For å bekrefte at LuCaP 86,2 var ikke en nevroendokrin xenograft linjen, vi farget med nevroendokrine biomarkører Kromogranin A (CHG-A) og synaptophysin (SYN). LuCaP 86.2 viste negativ CHG-A immunreaktivitet, og svak til moderat SYN immunreaktivitet som et fint, granulært reaksjonsprodukt som var hovedsakelig er lokalisert i det perifere cytoplasma av celler. Videre er omtrent 20% av tumorcellene var positive Ki67 indikerer LuCaP 86.2 hadde en moderat formeringshastigheten (figur 1C). Tilsvarende IHC resultater for LuCaP 35 er også vist i figur 1D.
Variasjoner i N-terminal og C-terminal AR uttrykk sjelden oppstått hos godartet epitel og primær ubehandlet PCa
For å bestemme frekvensen av C-terminal avkortet AR varianter i benign epitel og ubehandlet lokalisert PCA scoret vi IHC farging av radikal prostatektomi prøver. Alle 28 normal prostata prøvene hadde overensstem N-terminale og C-terminale AR nukleær uttrykk (N + C +) (figur 2A a og b). Blant de 24 hyperplastiske prostata prøver, 21 tilfeller (87,5%) viser konsistent N + C + uttrykket (figur 2A c og d), bare 1 (4,2%) hadde sunket C-terminale AR-farging (N + C ↓) og 2 (8,3 %) hadde ikke noen AR immunoreaktivitets (NC-). I 50 foretrukne PCA-prøver, 46 tilfeller (92%) uttrykte N + C + AR (figur 2A e-h), 2 tilfeller (4%) var redusert atom C-terminale vs. N-terminale AR-farging (N + C ↓) , mens 2 tilfeller (4%) var AR negative (NC-). Totalt var det ingen signifikant forskjell i forholdet mellom N- vs C-terminal atomfargeintensitet mellom normal prostata og hyperplastiske prostataprøver (
p
= 0,5756), normal prostata og PCA prøver (
p
= 0,7428), og hyperplastisk prostata og PCA prøver (
p
= 0,7508) (figur 2B).
(A) IHC farging for N- og C-terminal AR i normal prostata (NP) (a og b), hyperplastisk prostata (HP) (c og d) og primær PCa (eh) (forstørrelse x200). (B) Sammenligning av AR fargeprofiler blant normal prostata, hyperplastisk prostata og primær PCa. (C) Sammenligning av AR fargeprofiler mellom primær PCa og metastatisk CRPC.
Variasjoner i N-terminal og C-terminal AR uttrykk forekom hyppig i CRPC
For å bestemme frekvensen av variant AR uttrykk i metastatisk PCA scoret vi IHC farging av metastaser fra 42 pasienter som døde av avansert CRPC.
Blant 162 metastaser, 103 (63,6%) nettsteder viste konsekvent atom AR uttrykk med begge antistoffer (N + C +). Imidlertid 39 (24,1%) sider hadde en kjernefysisk C-terminale AR stillingen (N + C ↓) som var minst 50% mindre enn den tilsvarende N-terminale AR stillingen, og 20 (12,3%) områder av metastasering hadde ingen atom AR uttrykk (NC-) (Figur 2C). Disse IHC resultatene var i samsvar med hyppigheten av AR spleisevarianter i metastatisk PCa retningslinjer PCR metoder for å oppdage AR-V7 /AR3 og AR
v567es transkripsjoner [25]. Det var ingen forskjell i N-terminal AR flekker mellom primære og metastatisk PCa (
p
= 0,38, data ikke viser), men forekomst av nedsatt atom C-terminal AR uttrykk i metastatisk CRPC var betydelig høyere enn i primære PCa (
p
= 0,0027). Sammenligningen av atom AR uttrykk mellom primær PCa og metastatisk CRPC er vist i figur 2C.
AR-regulert genekspresjon ble endret i metastatisk CRPC med redusert atom C-terminal AR
For å finne ut om nedgangen i atom C-terminale AR-ekspresjon ble assosiert med en endring i ekspresjonen av AR regulerte proteiner, noe som representerer et tap av AR-aktivitet, undersøkte vi AR regulerte proteiner PSA, PSMA, og TMPRSS2 uttrykk i de metastatiske CRPC prøver (figur 3A) . Mens knapt mangler betydning, uttrykket av PSA i N + C ↓ metastaser var lavere enn N + C + metastaser (
p
= 0,0505). PSA uttrykk i N-C- metastaser var betydelig lavere enn både N + C + og N + C ↓ metastaser (
p
0,001) (figur 3B). I tillegg er uttrykk for PSMA i N + C + metastaser var høyere enn i N + C ↓ metastaser (
p
= 0,0097), men PSMA i NC-metastaser var betydelig lavere enn både N + C + og N + C ↓ metastaser (
p
0,0001) (figur 3B). Endelig uttrykk for TMPRSS2 i N + C + metastaser var betydelig høyere enn N + C ↓ metastaser (
p
= 0,045). TMPRSS2 i N-C- metastaser var betydelig lavere enn både N + C + og N + C ↓ metastaser (
p
0,01) (figur 3B). Tapet av TMPRSS2 uttrykk i N + C ↓ og NC-metastaser var ikke så uttalt som tap av PSA og PSMA uttrykk, noe som tyder på at TMPRSS2 ikke kan bli regulert av AR på samme nivå som PSA og PSMA i CRPC.
(A) IHC-farging for N-terminale AR (a), C-terminale AR (b), PSA (c), PSMA (d), TMPRSS2 (e), AKT-1 (f), Ki -67 (g), Negativ kontroll (h) på en metastatisk CRPC vev (forstørrelse x200, sett x400). (B) PSA, PSMA, TMPRSS2 og AKT-1 flekker profiler av CRPC.
Vi neste undersøkte gener som har blitt identifisert som å ha sitt uttrykk stiger som respons på AR C-terminalen avkortede varianter [ ,,,0],26], [29], inkludert akt1, CDC20, CDK1, C-MYC, CyclinA2, UGT2B17 og UBE2C. Kvantitative RT-PCR-resultater viste at akt1, CDC20, CDK1 og UGT2B17 ekspresjon var betydelig høyere i de N + C ↓ (n = 11) sammenlignet med N + C + prøver (n = 7), (p 0,05) (figur 4A) . UBE2C også trend høyere, men nådde ikke signifikans (p 0,10). Vi videre oppdaget AKT-1 protein uttrykk ved IHC. Imidlertid syklusen antall forholdsvis lav indikert forholdsvis høye nivåer av genekspresjon i alle tilfeller. Derfor, når vi også farget TMA for akt1, forholdsvis sterkt signal var tilstede i de fleste av vevsprøver på TMA og gitt semi kvantitative målinger, ingen forskjeller ble funnet mellom gruppene av IHC (figur 3B). Dermed kreft med N + C ↓ AR uttrykt høyere akt1 nivåer, men denne forskjellen kunne ikke påvises på IHC grunn av rikelig protein i alle grupper.
(A) Profil av syv AR variant forbundet gener uttrykk i menneskelig metastatisk vev. (B) De samme genene ble målt i LuCaP 86,2 og LuCaP 35 xenografter. Housekeeping genet RPL13A ble brukt som en endogen kontroll.
Tapet av atom C-terminal AR immunoreaktivitets var assosiert med uttrykk for AR varianter i metastatisk CRPC
Vi fastslått at tap av C-terminal AR immunoreaktivitets skjedde ofte i metastatisk CRPC. Dette tap av C-terminale immunreaktivitet kan skyldes ekspresjonen av et antall kjente (f.eks AR-V7 /AR3, eller AR
v567es) og ukjente AR spleisevarianter. For å bestemme om de N- og C-terminale immunoreaktivitet var forbundet med AR transkripsjons varianter, utførte vi RT-PCR på en undergruppe av metastatiske CRPC vev og sammenlignet RT-PCR-resultater til IHC resultater (tabell 4). Av 4 N + C + metastatisk undersøkte prøvene ved RT-PCR, alle uttrykt AR
Florida (en hadde også begrenset uttrykk for AR-V7). 8 metastatiske prøvene klassifisert som N + C ↓ av IHC-analyse, alt uttrykt AR
FL og 6 (75%) uttrykte også minst en kjent AR-variant (AR-V7 /AR3 og /eller AR
v567es ) ved RT-PCR. Disse N + C ↓ metastatisk prøver også utstilt mindre nivåer av PSA og PSMA immunoreaktivitets. Ingen av de fire NC-metastatisk prøver uttrykte AR
FL undersøkt av RT-PCR, selv om man viste svært lavt nivå av AR
v567es uttrykk.
Disse dataene viste at IHC analyse ved hjelp av ulike AR antistoffer som gjenkjenner tydelig AR protein regioner var svært konkordant med transkripsjoner koder AR
FL og AR spleisevarianter som mangler C-terminal eksoner.
AR variant mRNA var følsom for androgen konsentrasjon in vitro
VCap-celler ble dyrket på trekull stripet serum (CSS), og deretter behandlet med dihydrotestosteron (DHT), MDV-3100 eller MDV-3100 med DHT, hver for seg. QRT-PCR viste at AR
FL mRNA ble undertrykt ved å legge til DHT, MDV-3100 og DHT + MDV (figur 5A). Varianten AR
v567es mRNA ble også undertrykt av DHT; imidlertid, kan den økes ved tilsetning av androgen-reseptor-antagonist MDV-3100 alene, og undertrykket til nivået av CSS når DHT ble tilsatt MDV-3100 (figur 5B). AR-V7 mRNA reagerte på lignende måte som AR
FL (figur 5C).
(A) AR
FL mRNA ble undertrykt av DHT, MDV-3100 og MDV-3100 + DHT men ikke til nivået sett av DHT alene. (B) AR
v567es mRNA ble undertrykket i nærvær av DHT, ytterligere økes ved tilsetning av MDV-3100 og undertrykket til nivået av CSS når DHT ble tilsatt sammen med MDV-3100. (C) AR-V7 mRNA reagerte på lignende måte som AR
FL.
Heterogen ekspresjon av AR ble observert hos enkelte pasienter
Vi identifiserte C-terminalt trunkert AR proteiner i flere metastaser fra hver av 42 CRPC pasienter (figur 6). Av de 42 pasienter, 16 (38%) hadde ingen tap av C-terminale AR uttrykk, 23 (55%) hadde minst en metastatisk område med redusert atom C-terminale AR immunoreaktivitet, og 6 (14,3%) hadde minst én område med ingen AR uttrykk. Disse dataene markere heterogenitet av AR uttrykk mellom ulike metastaser innen samme pasient.
Flere metastaser av 42 CRPC pasienter hadde blitt analysert med IHC bruke 2 AR antistoffer. Fargingen Resultatene ble oppsummert som N + C + (blå), N + C ↓ (orange) og N-C- (rød). LN = lymfeknute; L = lumbarvirvel; R. = høyre; L. = venstre; T = thorax vertebra
I tillegg, for å avgjøre om AR status fremmet frekvensen av tumorvekst, fordelt vi CRPC bein metastaseprøver i tre grupper:. N + C + (n = 93), N + C ↓ (n = 39), og NC- (n = 18). Den Ki67 indeks for de N + C + nettsider var 18%. Dette var ikke signifikant forskjellig fra N + C ↓ sider (20,8%) (p = 0,4225) eller NC-områder (17,8%) (p = 0,95).
Diskusjoner
Tradisjonell begrepene AR translokasjon til kjernen som involverer ligand binding, dissosiasjon fra anstand og kjernefysisk trans innebærer at uten androgen ligand, ville AR finnes først og fremst i cytoplasma og CRPC tumorprogresjon vil bli drevet av andre enn de som involverer AR mekanismer. Dette er imidlertid ikke tilfelle med unntak av de fleste nevroendokrine tumorer. CRPC vanligvis har et transkripsjonelt aktive AR som modulerer ekspresjonen av AR-regulerte messenger RNA [1], [33]. Videre i de fleste studier på CRPC vev, AR har blitt funnet i kjernen.
Flere mekanismer har blitt foreslått for å forklare AR kjernefysiske lokalisering og noen eller alle kan være ansvarlig for det man ser i CRPC [34], [35]. Mesteparten av de foreslåtte mekanismene ville være i stand til å translocate AR til kjernen, siden de krever at ligandbinding til LBD. Hvis dette var tilfelle, forutsatt at det ikke er noen forskjeller i AR strukturer, ville vi forvente å se noen forskjeller i AR farging med N- eller C-terminale rettet antistoffer i metastatisk CRPC. Men som vi viser i denne studien, er det en betydelig forskjell mellom kjerne N- og C-terminale AR-antistoffer i de metastatiske vev. Dette tyder på at mekanismen (e) enn de som er nevnt ovenfor kan også være involvert i AR trans inn i kjernen uten ligand i CRPC.
Selv om antistoffer har blitt utviklet for AR-V7 /AR3 og AR
v567es spleisevarianter, minst 20 AR spleisevarianter som er rapportert hittil. Med spesifikke antistoffer som er tilgjengelige for bare to av variantene, bruk av spesifikt antistoff farging på vev detektere kastrerings-induserte C-terminalt avkortet AR varianter er ikke mulig [20] – [25]. Her utvikler vi en ny og rask immunhistokjemisk tilnærming som sammen N- og C-terminal AR immunoreaktivitets, som kan med hell vise den generelle hyppigheten av C-terminal avkortede AR spleisevarianter hos pasienter.
De dataene som presenteres her samkjøre ekspresjon av AR-protein ved IHC med 2-antistoffer og validering av ekspresjonen av AR spleisevarianter ved hjelp av RT-PCR, antyder sterkt at variasjonen mellom AR N- og C-terminal-immunoreaktivitet resultatene fra ekspresjonen av alternative AR mRNA. Imidlertid bør alternative forklaringer på tribunene. Den primære svulster og metastaser bløtvev ble formalinfiksert og parafininnebygd mens metastatiske lesjoner av bein ble formalinfiksert og decalcified med 10% maursyre før innstøping i parafin. Vi observerte ingen signifikant forskjell i AR farging i bløtt vev versus benmetastase (p 0,05, ikke data vist). Videre har vi ikke sett forskjeller med andre antistoffer mellom bein og bløtvev tilberedningsmetoder ved hjelp av de samme vev og metoder [36], [37]. Derfor har vi ikke vært i stand til å identifisere en teknisk årsak til forskjellene i farging.
