Abstract
1-metyl-D-tryptofan (1-D-MT) blir nå brukt i kliniske studier hos pasienter med residiverende eller refraktær solid tumor med sikte på å hemme indoleamine-2,3- dioxygenase (IDO) -mediert svulst immun flukt. IDO er uttrykt i tumorer og tumor-drenering lymfeknuter og forringer tryptofan (trp) for å skape en immunundertrykkende micromilieu både tappe trp og ved å samle immunsuppressive metabolitter av kynurenine (KYN) veien. Her viser vi at spredning av alloreaktive T-celler cocultured med IDO1-positive menneskelige kreftceller paradoksalt nok ble hemmet av 1-D-MT. Overraskende inkubering med 1-D-MT økt KYN produksjon av humane kreftceller. Cellefrie analyser viste at 1-D-MT endret ikke IDO1 enzymatisk aktivitet. I stedet, 1-D-MT indusert IDO1 mRNA og protein uttrykk gjennom ulike veier som involverer p38 MAPK og JNK signalering. Behandling av kreftpasienter med 1-D-MT har transkripsjonseffekter som kan fremme heller enn å undertrykke anti-tumor immun unnslippe ved å øke IDO1 i kreftcellene. Disse off-target effekter bør være nøye analysert i de pågående kliniske studier med 1-D-MT
Citation. Opitz CA, Litzenburger UM, Opitz U, Sahm F, Ochs K, Lutz C, et al. (2011) The Indoleamine-2,3-dioksygenase (IDO) Inhibitor 1-metyl-D-tryptofan oppregulerer IDO1 i humane kreftceller. PLoS ONE 6 (5): e19823. doi: 10,1371 /journal.pone.0019823
Redaktør: Matej Oresic, Governmental Technical Research Centre of Finland, Finland
mottatt: 25 november 2010; Godkjent: 18 april 2011; Publisert: May 20, 2011
Copyright: © 2011 Opitz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Helmholtz Association (VH-NG-306) til MP og Hertie Foundation til WW. CAO er støttet av en Heidelberg University Medical Faculty postdoktorstipend. Som Uta Opitz og Christian Lutz er ansatte i Heidel Pharma, Heidelberg Pharma hadde en rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer. Uta Opitz og Christian Lutz er ansatte i Heidelberg Pharma. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
I de senere år tryptofan (trp) nedbrytning har fått økende oppmerksomhet som en potent immunsuppressiv mekanisme som er involvert i å opprettholde immunologisk toleranse. Trp-nedbrytende enzym indoleamine-2,3-dioksygenase (IDO) har vært implisert i morens toleranse overfor allogen concepti [1], kontrollere autoimmunsykdommer [2], [3] og kronisk infeksjon [4], så vel som å fremme tumor immun~~POS=TRUNC flukt [5], [6], [7]. IDO-mediert trp degradering er ikke begrenset til tumorceller [7], men er også detektert i tumor-drenerende lymfeknuter [8]. I begge tumor drenering lymfeknuter og svulster, skaper IDO1 lokal toleranse ved direkte undertrykke T-celle responser og styrke immunsuppresjon mediert av regulatoriske T-celler (T
reg
) [6]. IDO er kronisk aktivert i mange kreftpasienter [9] og dets ekspresjon eller enzymaktiviteten korrelerer med dårlig prognose i pasienter med forskjellige cancere slik som ovarie karsinom [10], [11], endometrialt karsinom [12], [13], hepatocellulær kreft [14] og tykktarmskreft [15].
til tross for hoveddelen av bevis som støtter en rolle for IDO i å fremme tumordannelse og tumor immun flukt, har det vært som viser en anti-tumor aktivitet av IDO1 studier. Induksjonen av IDO1 har blitt beskrevet som en mekanisme som Interferon (IFN) -γ inhiberer proliferasjon av maligne celler [16], [17]. Noen dyreforsøk vist at IDO1 ekspresjon var positivt assosiert med eliminering av maligne celler [18], [19]. Disse funn ble bekreftet i kliniske studier som viser at til tross for å være en kraftig induserer IDO1, IFN-γ var effektiv ved behandling av ovarialcancer og blærekreft [20], [21], [22]. I tillegg IDO1 uttrykk i leverkreft prøver og i endotelceller nyrecellekarsinom positivt korrelert med progresjonsfri overlevelse og langsiktig overlevelse henholdsvis [23], [24]. Det gjenstår dermed usikkerhet om den kliniske relevansen av IDO1 uttrykk i tumorer.
I prekliniske studier på IDO-inhibitor en-metyl-tryptofan (en-MT) reduserte tumorvolumet av mus preimmunized med en svulst antigen [7 ] og – i kombinasjon med kjemoterapi – forårsaket regresjon av etablerte murine brystkreft [5]. Inhibering av IDO i kombinasjon med kjemoterapi eller som et vaksinehjelpestoff utgjør derfor en attraktiv metode for cancer immunoterapi [5], [6], [7], [25], [26]. Nylig en roman IDO isoform, betegnes IDO2 ble oppdaget, som – i likhet IDO1 – er uttrykt i tumorer og tumor-drenering lymfeknuter [27]. Den tredje trp-nedbrytende enzym hos mennesker, tryptofan-2,3-dioksygenase (TDO) hovedsakelig uttrykt i lever og regulerer trp konsentrasjoner etter næringsopptak trp. Den IDO inhibitor en-MT eksisterer som to stereoisomere, 1-D-MT og en-L-MT. De prekliniske studier har anvendt den racemiske blanding 1-D /L-MT å inhibere IDO. Nyere studier har vist at IDO1 er preferanse målet for 1-L-MT, mens 1-D-MT preferensielt inhiberer IDO2 [26], [27], [28], [29]. 1-D-MT brukes i dag i fase I kliniske studier som tillegg til konvensjonell kjemoterapi basert på prekliniske studier i mus modeller av kreft. Vi var interessert i immunmodulerende effekter av 1-D-MT i IDO1-positive humane kreftceller.
Resultater
1-D-MT induserer immunsuppresjon av menneskelige kreftceller
SKOV-3-celler som konstitutivt nedbrytes trp til KYN og uttrykker høye nivåer av mRNA IDO1 mens IDO2 og TDO mRNA blir uttrykt ved lave nivåer (fig. 1A). Knockdown av IDO1 av siRNA i Skov-3 celler redusert IDO1 mRNA uttrykk med 87,5% (Fig. 1B) som fører til en sterk reduksjon i IDO1 protein uttrykk som gjenspeiles av Western Blot (Fig. 1C) og immunocytochemistry (Fig. 1 D). Til slutt ble KYN produksjon hemmet med 91,4% i de IDO1 knockdown cellene i forhold til den midlere KYN produksjon av SKOV-3-celler transfektert uten siRNA eller med en ikke-målsøkende siRNA kontroll (fig. 1E), noe som tyder på at IDO1 er hovedsakelig ansvarlig for den konstitutive KYN produksjon i SKOV-3-celler. For å bestemme virkningen av en MT-behandling på den immunmodulerende fenotype av cancerceller, ble SKOV-3 /MLR coculture eksperimenter utført. Tilsetning av KYN (fig. 2A) eller nærvær av SKOV-3-celler (fig. 2B) hemmet Alloreaktive T-celleproliferasjon i MLR. Knockdown av IDO1 ved siRNA ikke bare reversert SKOV-3-cellemediert suppresjon av T-celle proliferasjon, men også økt T-celleproliferasjon (fig. 2C), sannsynligvis på grunn av den ekstra allogene stimulering av T-celler ved den IDO-manglende SKOV-3 celler. Neste vi testet effekten av de to stereoisomerer av 1-MT. Tilsetning av 1-metyl-L-tryptofan (1-L-MT) også reverseres undertrykkelse av T-celleformering i SKOV-3 /MLR coculture eksperimenter (fig. 2D). Overraskende T-celleformering ble ikke forbedret, men hindres i cocultures behandlet med 1-metyl-D-tryptofan (1-D-MT, fig. 2E). Tilsetning av trp endret ikke denne inhibering, noe som indikerer at trp uttømming ikke er involvert i denne paradoksal effekt av 1-D-MT (fig. 2F). Neste analyserte vi effekten av 1-D-MT på cellesyklusprogresjon og proliferasjon av SKOV-3-celler, som en inhiberende virkning på 1-D-MT på SKOV-3-celler kunne forklare den reduserte
3H tymidinopptaket i de coculture eksperimenter (fig. 3). Imidlertid, 1-D-MT forandret hverken
3H tymidin-opptak (fig. 3A), eller cellesyklusprogresjon SKOV-3-celler (fig. 3B). For å utelukke, at 1-D-MT kunne ha hemmet
3H tymidin opptak av SKOV-3-celler bare når disse ble dyrket i MLR, T-celledeling i cocultures på SKOV-3-celler med MLR i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av 1-D-MT ble målt ved CFSE farging og strømningscytometri (fig. 3C). 1-D-MT-konsentrasjon avhengig hemmet T-celledeling også i disse analyser (fig. 3C), noe som bekrefter at 1-D-MT inhiberer T-celle-proliferasjon og ikke spredning av SKOV-3-celler i cocultures.
(A) Relativ mRNA uttrykk av de tre trp-nedbrytende enzymer IDO1, IDO2 og tryptofan-2,3-dioxygenase (TDO) (hvite søyler) og KYN produksjon (sort strek) fra Skov-3 celler, målt ved kvantitativ RT-PCR og høy ytelse væskekromatografi (HPLC). (B) knockdown av
IDO1
mRNA av siRNA målt ved QRT-PCR. (C) Western blot-analyse som viser IDO1 protein ekspresjon i SKOV-3-celler med siRNA mediert knockdown av IDO1 i forhold til kontrollene. (D) Immunocytochemistry (rød, IDO1 flekker, blå, DAPI nukleær farging) av kontroll Skov-3 celler og Skov-3 celler med IDO1 knockdown. (E) Kyn frigjøring av SKOV-3-celler etter knockdown av IDO1 i forhold til kontrollene. Forsøk ble utført i det minste i tre eksemplarer. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. * (P 0,05)
(A) Alloreaktive T-celledeling etter tilsetting av 25 mikrometer KYN til blandede leukocytter reaksjoner (MLR).. (B) Alloreaktive T-celleformering i nærvær av 6000 SKOV-3-celler. (C) T-celledeling i MLR cocultured med 2000 kontroll Skov-3 celler (hvit bar) eller 2000 Skov-3 celler med en knockdown av IDO1 (sort strek). (D) T-celledeling i cocultures av MLR med 2000 SKOV-3-celler etter tilsetning av økende konsentrasjoner av 1-L-MT. (E) T-celledeling i cocultures av MLR med 2000 SKOV-3-celler etter tilsetning av økende konsentrasjoner av 1-D-MT. (F) Representant resultat av MLR /Skov-3 coculture eksperimenter med PBMC fra fem ulike givere og 2000 eller 6000 Skov-3 celler. Celler ble behandlet med eller uten 1 mM 1-D-MT i kombinasjon med eller uten 250 uM trp. Proliferasjon ble målt ved
3 [H] methylthymidine uptake. Forsøk ble utført i det minste i tre eksemplarer. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. * (P 0,05)
(A)
3 [H] methylthymidine inkorporering av Skov-3 celler behandlet med 1 mM 1-D-MT (sort strek) eller kjøretøy (hvit. bar) for 6 dager. (B) Celle syklus analyse av SKOV-3-celler behandlet med 1 mM 1-D-MT eller bærer i 48 timer. (C) Proliferasjon analyse av CFSE-fargede lymfocytter fra 6 dagers cocultures av MLR med 2000 SKOV-3-celler, behandlet med indikerte konsentrasjoner av 1-D-MT (øvre panel). Plott av celletallene i hver generasjon av de ovennevnte eksperiment (nedre panel).
1- D-MT øker KYN produksjon i humane kreftceller
Vi testet deretter effekten av 1-MT på KYN produksjon av Skov-3 celler. Overraskende, 1-D-MT-konsentrasjon avhengig øket KYN dannelse (Fig. 4A), mens dens stereoisomer 1-L-MT inhiberte KYN formasjon som forventet (fig. 4A). Den racemiske blanding av 1-MT, som har vært anvendt i mange studier, inkludert de som har etablert IDO1 som en immundempende enzym, inhiberes KYN formasjon, om enn mindre enn en-L-MT alene (Fig. 4A). Som trp konsentrasjoner i mediet kan ha begrenset økning i KYN produksjon, har vi også målt Kyn konsentrasjoner produsert av SKOV-3-celler i respons til en-D-MT i nærvær av økende konsentrasjoner trp. Under disse forhold meget høyere Kyn konsentrasjoner ble oppnådd (fig. 4B), som antyder at den observerte platå ovenfor konsentrasjoner på ca 250 pM 1-D-MT (fig. 4A) var på grunn av begrenset tilgjengelighet trp. Trp-konsentrasjoner i cellekulturmedier som vanligvis varierer mellom 12 og 20 uM mens konsentrasjoner i humant serum området mellom 50 og 70 uM. Kyn-dannelse i celler behandlet med 1-D-MT var mer uttalt når trp konsentrasjoner som er tilstede i human serum (62,5 pM) i stedet for trp-konsentrasjonene som finnes i cellekulturmedium (15 uM) ble anvendt (Fig. 4C). Imidlertid gangers økning i Kyn ved tilsetning av trp var lik i celler behandlet med eller uten 1-D-MT (fig. 4C). For ytterligere å teste om en-D-MT påvirker IDO1 enzymatisk aktivitet vi målt IDO1-mediert KYN produksjon i Skov-3 celleekstrakter direkte. 1-D-MT endret ikke KYN formasjon uansett om trp var til stede ved en fast konsentrasjon på 100 uM (fig. 4D) eller ved konsentrasjoner ekvimolare til 1-D-MT (fig. 4E), noe som tyder på at økningen i KYN formasjon ved 1-D-MT i SKOV-3 ikke er formidlet av en direkte effekt av 1-D-MT på IDO1 enzymatisk aktivitet.
(A) Kyn konsentrasjoner utgitt av SKOV-3-celler etter behandling med 1- D-MT (hvite sirkler), 1-L-MT (svarte sirkler) og den racemiske blanding av 1-MT (svarte trekanter) målt etter 48 timer ved hjelp av HPLC. (B) Kyn frigjøring av SKOV-3-celler i respons til 500 uM 1-D-MT i nærvær av økende konsentrasjoner trp. (C) Kyn frigjøring av SKOV-3-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av trp alene (åpne sirkler) eller i kombinasjon med 1 mM 1-D-MT (fylte sirkler) målt etter 48 timer ved hjelp av HPLC. (D) Kyn produksjon i IDO1 enzymatiske analyser utført i nærvær av 100 pM trp i kombinasjon med økende 1-D-MT konsentrasjoner. (E) Kyn produksjon av IDO1 enzym i nærvær av økende konsentrasjoner av trp alene (åpne sirkler) eller i kombinasjon med 1-D-MT (fylte sirkler). Forsøk ble utført in triplo. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. * (P 0,05).
IDO1 uttrykk forsterkes av 1-D-MT i humane kreftceller
Deretter undersøkte vi om 1-D-MT påvirket uttrykk for trp-enzymer. Til vår overraskelse fant vi at 1-D-MT økt IDO1 mRNA og protein i Skov-3 celler, mens IDO2 og TDO forble uendret (Fig. 5A). Oppregulering av IDO1 mRNA var konsentrasjonsavhengig (fig. 5B) og ble først påvist etter 16 timers inkubasjon med 1-D-MT (fig. 5C). Viktigere, ble IDO1 bringende effekt ikke begrenset til Skov-3 celler. Mens en-D-MT induserte ikke
de novo
IDO1 mRNA uttrykk og KYN produksjon i IDO1-negative HeLa livmorhalskreft celler, økte IDO1 mRNA og KYN produksjon etter induksjon av IDO1 uttrykk og KYN produksjon av IFN γ (fig. 6A, B). Interessant, 1-D-MT-mediert oppregulering av IDO1 mRNA i mange IDO1-negative kreftceller var forskjellig avhengig av konsentrasjonen av IFN-γ som ble anvendt for å indusere
de novo
ekspresjon av IDO1 (fig. 6C). Etter stimulering med passende IFN-γ konsentrasjoner økte 1-D-MT IDO1 mRNA og KYN produksjon i et panel av forskjellige kreftceller (Fig. 6C-F), som indikerer en universell mekanisme av 1-D-MT-mediert aktivering av IDO1 .
(A) Venstre panel: mRNA uttrykk for IDO1, IDO2 og TDO i Skov-3 celler etter behandling med 1 mM 1-D-MT, analysert etter 24 timer ved QRT-PCR. Høyre panel: Western Blot analyse av IDO1 uttrykk i Skov-3 celler utført etter 48 timer 1 mM 1-D-MT. GAPDH tjente som lasting kontroll. (B) IDO1 mRNA-ekspresjon som reaksjon på økende konsentrasjoner av 1-D-MT målt etter 24 timer ved QRT-PCR. (C) Tid løpet analyse av IDO1 mRNA-induksjon av 1 mM 1-D-MT, analysert ved QRT-PCR. Forsøk ble utført in triplo. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. * (P 0,05).
(A) Representative HPLC grafer av KYN produksjon av HeLa-celler, som enten var ubehandlet, behandlet med 1 mM 1-D-MT og /eller 1000 U IFN y i 72 timer. Absorpsjon av KYN ble målt ved 365 nm. (B) In ubehandlede HeLa-celler 1 mM 1-D-MT induserte ikke
de novo
IDO1 mRNA, men økte IDO1 mRNA etter dens induksjon av 1000 U IFN-γ mRNA-ekspresjon ble analysert ved QRT-PCR 24 timer etter behandlingen. (C) Representative eksempel på virkningen av forskjellige IFN-γ konsentrasjoner på IDO1 mRNA-induksjon ved 1-D-MT som er vist på U251 glioma celler. (D) IDO1 mRNA uttrykk av angitte cellelinjer som ble stimulert i 24 timer med passende konsentrasjoner av IFN-γ alene (hvite søyler) eller i kombinasjon med en mM 1-D-MT (svarte søyler). (E) representativt eksempel på IDO1 mRNA-induksjon ved 200 uM 1-D-MT i IFN-y-stimulerte T98G glioma celler. (F) Kyn frigivelse av angitte cellelinjer som ble stimulert i 72 timer med passende konsentrasjoner av IFN-γ alene (hvite stolper) eller i kombinasjon med 1 mM 1-D-MT (sorte stolper), målt ved HPLC. Forsøk ble utført in triplo. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. * (P 0,05).
1-D-MT-mediert IDO1 uttrykk innebærer JNK og p38 MAPK
Vi utforsket signalveier involvert i oppregulering av IDO1 svar på 1-D-MT behandling. IFN-mediert fosforylering STAT1 er involvert i induksjon av IDO1 i mange forskjellige celler og vev [30], men knockdown av STAT1 ved siRNA ikke redusere KYN produksjon av 1-D-MT-behandlede celler (Fig. 7A). I tråd med dette resultatet, ble 1-D-MT ikke induserer mRNA-ekspresjon av IFN-β eller IFN-γ (fig. 7B). Mitogen aktivert proteinkinase (MAPK) banene har blitt rapportert å bli modulert ved hjelp av den racemiske blanding av 1-MT og derved påvirker polarisasjonen av dendrittiske celler (DC) [31]. Vi har derfor undersøkt hvorvidt inhibering av MAPK av signale påvirket 1-D-MT-mediert økning i IDO1 uttrykk. Inhibering av ERK-fosforylering av PD98059 påvirkes IDO1 mRNA-ekspresjon og KYN frigivelse hverken i ubehandlet eller i 1-D-MT behandlede celler (Fig. 8A). Mens inhibering av p38 MAPK-fosforylering av SB203580 [32] svakt redusert IDO1 mRNA i ubehandlede celler, er det nesten fullstendig dempet økning i IDO1 mRNA-ekspresjon som reaksjon på en-D-MT (fig. 8B). Den svake hemming av IDO1 transcipt i ubehandlede celler ikke oversette til betydelig redusert KYN utgivelsen, mens reduksjonen i KYN utgivelsen ble betydelig i 1-D-MT behandlede celler (fig. 8b). Lignende resultater ble oppnådd ved å hemme JNK ved SP600125 (Fig. 8C) [33]. Sammen er disse dataene antyder, er at p38 MAPK og JNK signale involvert i medie induksjon av IDO1 som svar på en-D-MT.
(A) knockdown av STAT1 mRNA ved si-RNA (hvite søyler) ikke påvirke Kyn frigivelse (sorte stolper) 1-D-MT (1 mM) ble behandlet SKOV-3-celler. (B) Analyse av IFN-γ og IFN-β mRNA-ekspresjon i SKOV-3-celler etter stimulering med 1 mM 1-D-MT i 24 timer.
IDO1 mRNA (venstre panel) og KYN frigivelse (høyre panel) på SKOV-3-celler behandlet med (A), 50 uM av MEK1 inhibitor PD98059, (B) 20 uM av p38 MAPK inhibitor SB203580 og (C) 20 uM av JNK-inhibitor SP600125 eller kontroll 1 time før tilsetning av 1 mM 1-D-MT analysert ved QRT-PCR etter 24 timer og HPLC etter 48 timer, henholdsvis. Forsøk ble utført in triplo. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. * (P 0,05)
Diskusjoner
I det siste IDO hemming ble hovedsakelig oppnådd ved bruk av racemisk blanding av 1-MT [34].. Som det viste seg at IDO-inhibering kan være et lovende mål for cancerterapi, ble de individuelle stereoisomerer av 1-MT undersøkt nærmere [5], [35]. Selv om 1-L-MT ble vist å mer effektivt å inhibere IDO1 i enzymanalyser og i kreftcellelinjer, 1-D-MT viste overlegen anti-tumor aktivitet i musemodeller og er derfor valgt for kliniske forsøk [35]. En senere studie antydet at den overlegne anti-tumor-aktivitet av 1-D-MT kan oppstå ved hemming av IDO2 isoformen [27]. Nyere studier indikerer at 1-D-MT hemmer IDO aktivitet verken i dendrittiske celler eller i tumorceller [26], [28] og ikke effektivt gjenopprette IDO-indusert arrestasjonen av T-celleproliferasjon [36]. I vår studie, 1-D-MT undertrykket T-celleformering ved konstitutivt IDO1-uttrykk SKOV-3-celler ble cocultured med blandede lymfocytt-reaksjoner (fig. 2E, F). Undersøkelse av de underliggende mekanismene overraskende vist at 1-D-MT økte KYN produksjon av kreftceller med IDO1 aktivitet (Fig. 4, 6) på grunn av oppregulering av IDO1 mRNA og protein ekspresjon (fig. 5, 6). Oppregulerer IDO1 ekspresjon og aktivitet ble observert bare i kreftceller med enten konstitutiv eller IFN-γ-indusert IDO1 ekspresjon (fig. 5, 6). Oppregulering av IDO1 ved 1-D-MT i mange kreftceller var mest fremtredende ved moderate konsentrasjoner av IFN-γ som kan antas å ligne fysiologiske konsentrasjoner (Fig. 6C). Lave konsentrasjoner av IFN-γ kanskje ikke har indusert tilstrekkelig IDO1 ekspresjon (Fig. 6C), muligens forklarer hvorfor en-D-MT ikke økte IDO1 på følgende konsentrasjoner, mens stimulering med meget høye konsentrasjoner av IFN-γ kan ha resultert i en maksimal IDO1 induksjon (fig. 6C), noe som forklarer hvorfor ikke ble observert ytterligere økning av 1-D-MT. I alle de undersøkte IDO1-uttrykkende celler er en økning i IDO1 ekspresjon og KYN frigjøring ble observert i respons til behandling med 1-D-MT, som indikerer en generell mekanisme som er involvert i 1-D-MT-mediert IDO1 induksjon (fig. 4, 5, 6).
i en tidligere studie, den racemiske blanding av 1-MT er blitt rapportert å modifisere polarisasjonen av dendrittiske celler (DC) ved modulering av MAPK [31]. Inhibering av p38 MAPK fosforylering forhindret økningen i IDO1 mRNA og KYN produksjon av 1-D-MT (fig. 8B), noe som tyder på at p38 MAPK-deltar i 1-D-MT mediert signalisering. I tråd med dette resultat, har p38 MAPK tidligere blitt vist å bidra til induksjon av IDO1 i en leukemicellelinje og i DC [37], [38]. Også inhibering av JNK-signal dempet induksjon av IDO1 mRNA og KYN frigivelse i nærvær av 1-D-MT (fig. 8C). Inhibering av JNK-fosforylering er nylig blitt beskrevet for å redusere IDO1 ekspresjon indusert av LPS i mus mikroglia [39]. 1-D-MT mediert modulering av p38-MAPK og JNK antyder at 1-D-MT kan ha flere effekter enn bare oppregulering av IDO1.
Så vidt vi vet er dette den første rapporten om en-D- MT-medierte virkninger på genekspresjon i humane celler. Den stereoisomer av 1-D-MT, ble 1-L-MT nylig rapportert å undertrykke IFN-γ-indusert ekspresjon av IDO1 i mus rektale carcinoma celler [40]. I tillegg er det tidligere blitt beskrevet som en-MT påvirker modningen av DC uavhengig av IDO [31]. Men den racemiske blanding av 1-MT ble anvendt i denne studien, og det er derfor ikke kjent hvilken stereo-isomer var ansvarlig for de observerte effektene [31]. Det er ikke avklart hvorvidt en-D-MT utøver flere effekter på genuttrykk enn reguleringen av IDO1. I motsetning til IDO1, ble trp-catabolising enzym IDO2 ikke indusert av 1-D-MT. Dette funnet understreker den oppfatningen at IDO1 og IDO2 er forskjellig regulert på en transkripsjonsnivået [27]. Mulige andre effekter av 1-D-MT på genekspresjon kan bidra til den høye anti-tumor effekt av 1-D-MT observert hos mus tumormodeller [35]. Signifikante forskjeller i IDO uttrykk og regulering eksisterer mellom mennesker og mus [29], [41], noe som kan forklare de observerte avvik av 1-D-MT handling i musemodeller og humane celler. I en studie med en-D-MT i SIV-infiserte rhesusape, en modell ligner mer mennesker enn musemodeller, Boasso og kolleger observerte at KYN plasmanivået ikke er redusert, men heller indusert ved behandling med en-D-MT [42 ]. Økt IDO1 mRNA uttrykk i lymfeknuter av aper etter en-D-MT behandling ble tolket som et kompenserende counterregulatory mekanisme aktiveres av 1-D-MT, som kan ha stått for den manglende effekt på plasma KYN [42]. Våre data viser at oppregulering av IDO1 og KYN foregår også i isolerte humane celler, der en counterregulatory mekanisme som formidler immunsuppresjon er usannsynlig.
Som det er dokumentert at IDO1 kan begrense tumorvekst som en formidler av tumorici-dal IFN -γ i eksperimentelle modeller og pasienter [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22] og som IDO1 uttrykk i svulster positivt korrelert med progresjonsfri overlevelse og lang- uttrykket overlevelse i noen studier [23], [24] er det fristende å spekulere i at induksjon av IDO1 ved 1-D-MT faktisk kan forklare noen av de antitumoreffektene av 1-D-MT.
i konklusjonen, har vi identifisert oppregulering av IDO1 uttrykk i humane kreftceller som en dyp effekt på 1-D-MT, en forbindelse som for tiden benyttes i kliniske studier hos pasienter med residiverende eller refraktær solid tumor med sikte på å hemme (IDO ) -mediert svulst immun flukt. IDO1 uttrykk er kjent for å være immunosuppressiv og kan øke tumorImmun flukt, men det har også vært implisert i direkte anti-tumor effekt. Flere studier er nødvendig for å bedre forstå hvilken rolle IDO i kreft biologi og potensiell bruk av 1-D-MT som en anti-kreft agent.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
SKOV-3 og NIH: OVCAR-3 eggstokk-karsinom-celler ble dyrket i McCoys 5A medium (BioConcept, Allschwil, Sveits) supplert med L-trp som indikert (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland), 300 mg /L Glutamin (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland), 10% FBS (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) og 100 U /ml penicillin og 100 mikrogram /ml streptomycin (PAA Laboratories, Pasching, Østerrike). HeLa-cervical carcinoma celler, A375-maligne melanomceller, ble LN18, LNT229, T98G og U251 ondartet glioma-celler opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, PAA) inneholdende 10% FBS (Thermo Fisher Scientific Inc.) og 100 U /mL penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PAA Laboratories). Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert fra fem friske, ikke-relaterte bloddonorer ved tetthetssentrifugering ved bruk av lymfocytt-separasjonsmedium LSA 1077 (PAA Laboratories) og dyrket i RPMI 1640 (PAA Laboratories) inneholdende 10% FBS (Thermo Fisher Scientific Inc.) og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PAA Laboratories). Alle celler ble rutinemessig testet for forurensning av Multiplex cellen Forurensning Test [43]. Kulturer ble inkubert ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære
20 mM stamløsninger av 1-metyl-D-tryptofan (1-D-MT, partinummer: 09315BH, 08007EJ). og 1-metyl-L-tryptofan (1-L-MT, partinummer: 08023HE, 15399MJ) (Sigma-Aldrich) ble fremstilt ved oppløsning av inhibitorene i 0,1 N NaOH. PH ble justert til 7,5 ved hjelp av saltsyre. For å unngå forurensning av cellekulturer, ble stamløsninger filfotered gjennom 0,2 um filtre. IFN-γ ble kjøpt fra Immunotools (Friesoythe, Tyskland). ERK-fosforylering ble hemmet bruker MEK1 inhibitor PD98059 (Cell Signaling Technology, Beverly MA, USA). C-Jun N-terminal kinase (JNK) hemmer SP600125 og hemmer av p38 kinasefosforylasjon SB203580 ble kjøpt fra Enzo miljø- og biovitenskap (Lörrach, Tyskland).
Høy ytelse væskekromatografi (HPLC)
Høy ytelse væskekromatografi (HPLC) analyse ble utført ifølge [44] ved anvendelse av en Beckman HPLC med fotodiode array (PDA) deteksjon og Lichrosorb RP-18-kolonne (250 mm x 4 mm ID, 5 um, Merck, Darmstadt, Tyskland ). Kyn frigivelse og trp nedbrytning ble målt i mediet av 3 * 10
5-celler i 2 ml McCoys 5A medium (BioConcept) inneholdende 10% FBS (Perbio), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PAA Laboratories ) supplert med 0-125 mM L-trp (Sigma-Aldrich). Mediet ble innhøstet fra 6 brønners plater ved de angitte tidspunkter, sentrifugert og frosset helt til videre analyse. Etter tining ble prøvene supplert med trikloreddiksyre for proteinutfelling, sentrifugert og 100 pl av supernatanten ble analysert ved HPLC. Standardkurver ble generert med L-KYN og L-trp (Sigma-Aldrich) i det samme medium. Siden FBS inneholder KYN, Kyn lave konsentrasjoner (~ 1 mm) ble påvist i alle prøver og medium uten celler, ble alltid målt for sammenligning.
Quantitative (q) RT-PCR
Total RNA ble isolert med Qiagen RNAeasy RNA isolering kit (Hilden, Tyskland) og DNA ble syntetisert med Applied Biosystems revers-transkripsjon-Kit (Foster City, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. QRT-PCR ble utført i en ABI 7000 termosykler med SYBR Grønn PCR MasterMix (Applied Biosystems) i henhold til standard protokoller. PCR reaksjoner ble sjekket ved å inkludere no-RT-kontroller, ved unnlatelse av maler og ved begge smeltekurve og gel analyse. Standardkurver ble generert for hvert gen. Relativ kvantifisering av genekspresjon ble bestemt ved sammenligning av terskelverdier. Alle resultater ble normalisert til GAPDH, som varierte verken med IFN-γ eller 1-D-MT behandling
Primer sekvenser var (5′-3 «forover, bakover).
CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC, TGAGCGATGTGGCTCGGCT (GAPDH), etter
TTCAGTGCTTTGACGTCCTG, TGGAGGAACTGAGCAGCAT (IDO1), etter
TGCTTCATGCCTTTGATGAG, GAAGGCCTTATGGGAAGGAG (IDO2), etter
ACTGCCTCAAGGACAGGATG; AGCCAGGAGGTTCTCAACAA (IFN-β), etter
TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA; TCCTTTTTCGCTTCCCTGTTTT (IFN-γ), etter
AGGAAAAGCAAGCGTAATCTTCA; TATTCCCCGACTGAGCCTGAT (STAT1), etter
GGTTCCTCAGGCTATCACTACC; CAGTGTCGGGGAATCAGGT (TDO)
siRNA eksperimenter
For å knockdown IDO1 (Indo) og STAT1 ON-TARGETplus SMART-bassenget siRNA av Dharmacon RNA Technologies (Lafayette, CO, USA) ble brukt.
De sekvensene var som følger:
Menneskelig Indo, NM_002164
, følelse, 5′-UCACCAAAUCCACGAUCAUUU-3 «, antisense, 5′-PUAUGCGAAGAACACUGAAAUU-3′; forstand, 5»-UUUCAGUGUUCUUCGCAUAUU-3 «, antisense, 5′-PUAUGCGAAGAACACUGAAAUU-3′; forstand, 5»-GUAUGAAGGGUUCU GGGAAUU -3 «, antisense, 5′-PUUCCCAGAACCCUUCAUACUU-3′; forstand, 5»-GAA CGGGACACUUUGCUAAUU-3 «, antisense, 5′-PUUAGCAAAGUGUCCCGUUCUU-3»
Menneskelig STAT1, NM_139266
, følelse, 5′-GCACGAUGGGCUCAGCUUUUU-3 «, antisense, 5 «-PAAAGCUGAGCCCAUCGUGCUU-3′; forstand, 5»-CUACGAACAUGACCCUAUCUU-3 «, antisense, 5′-PGAUAGGGUCAUGUUCGUAGUU-3′; forstand, 5»-GAACCUGACUUCCAUG CGGUU-3 «, antisense, 5′-PCCGCAUGGAAGUCAGGUUCUU-3′; forstand, 5»-AGAAAGAG CUUGACAGUAAUU-3 «, antisense, 5′-PUUACUGUCAAGCUCUUUCUUU-3».
ON-TARGETplus siCONTROL Non-måls Pool (D-001810-10-05, Dharmacon) og en transfeksjon uten siRNA ble brukt som negative kontroller.
for transfeksjon av siRNA ble Amaxa Nucleofector Kit V (Amaxa Biosystems, Koeln, Tyskland) som brukes. I korthet, 3 * 10
5-celler ble resuspendert i 100 ul av den Nucleofector oppløsningen V og blandet med 1,5 ug av siRNA, så elektroporert ved hjelp av program V005. Mediet ble endret etter 24 timer, analyse av KYN innholdet i mediet ved hjelp av HPLC, høsting av cellene for RNA-ekstraksjon eller generering av lysater og immuncytokjemisk analyse ble utført etter 48 timer.
Western blot-analyse
Hele cellelysatene ble fremstilt i iskald tris (hydroksymetyl) aminometan-hydroklorid (tRIS-HCl, 50 mM, pH 8,0; Carl Roth) inneholdende 150 mM NaCl (JT Baker, Deventer, Nederland), 1% Triton X-100 (AppliChem, Darmstadt, Tyskland), 10 mM EDTA (Gerbu Biotechnik, Gaiberg, Tyskland), 200 mM ditiotreitol (Carl Roth), 3% 2-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich), 100 uM phenylmethylsulphonyl fluorid (PMSF), 10 ug /ml aprotinin og 5 ug /ml leupeptin (Carl Roth) og sentrifugert ved 4 ° C (10 min, 13 000 rpm).
