Abstract
Livmorhalskreft (CC) er forårsaket av høy-risiko humant papillomavirus utholdenhet på grunn av den immunsuppressive svulsten mikromiljøet mediert av cytokiner. Vaginal bakterieflora bestemmer tilstedeværelsen av visse cytokiner lokalt. Vi vurderte forbindelsen mellom cervical bakterieflora mangfold og histopatologisk diagnostisering av hvert trinn i CC, og vi har evaluert mRNA cervical uttrykk nivåer av IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α og IFN-γ tvers histopatologisk diagnose og spesifikke bakterie klynger. Vi bestemte cervical microbiota av høy gjennomstrømming sekvensering av 16S rDNA amplikonene og klassifisert den i samfunnet statlige typer (CST). Bety forskjellen mellom analyser alfa-diversitet og histopatologisk diagnose ble utført, så vel som et β-diversitet analyse innenfor den histologisk diagnose. Livmorhals cytokin mRNA uttrykk ble analysert over CSTs og histopatologiske diagnoser. Vi fant en signifikant forskjell i bakterieflora mangfold i NCL-HPV-negative kvinner vs de med plateepitel intraepitelial lesjoner (SIL) og CC (p = 0,006, p = 0,036) .Når β-diversitet ble evaluert, CC prøvene viste den høyeste variasjonen innen gruppene (p 0,0006) og den største avstanden i forhold til NCL-HPV negative (p 0,00001). De dominerende bakterier hos kvinner med normal cytologi var
L
.
crispatus Hotell og
L
.
iners
, mens det for SIL, det var
Sneathia spp
. og for CC,
Fusobacterium spp
. Vi har funnet høyere median cervikale nivåer av IL-4 og TGF-β1 mRNA i CST dominert av
Fusobacterium spp
. Disse resultatene tyder på at livmorhals microbiota kan være innblandet i livmorhalskreft patologi. Ytterligere kohortstudier er nødvendig for å validere disse funnene
Citation. Audirac-Chalifour A, Torres-Poveda K, Bahena-Román M, Téllez-Sosa J, Martínez-Barnetche J, Cortina-Ceballos B, et al . (2016) Livmorhals mikrobiomer og cytokin profil på ulike stadier av livmorhalskreft: en pilotstudie. PLoS ONE 11 (4): e0153274. doi: 10,1371 /journal.pone.0153274
Redaktør: Maria Lina Tornesello, Istituto Nazionale Tumori, ITALIA
mottatt: 04.12.2015; Godkjent: 25 mars 2016; Publisert: 26 april 2016
Copyright: © 2016 Audirac-Chalifour et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Instituto Nacional de Salud Pública, Mexico og tilskudd fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (MX) (CONACYT) Fondo september CB -2011-01-169552, CONACyT-Fondo E0013 Apoyo COMPLEMENTARIO CATEDRAS-2014-C01-245520 og CONACyT-FONSEC SSA /IMSS /ISSSTE-2014-C01-234149, Mexico. Audirac-Chalifour takker Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) for MSc fellesskap 2976418945. K Torres Poveda er CONACyT Stipendiat-Instituto Nacional de Salud Pública (INSP), Cuernavaca, Morelos, Mexico.
Konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CC) er den fjerde vanligste kreftformen hos kvinner, og den syvende samlet over hele verden, med en anslått 485 000 nye. tilfeller og 236 000 dødsfall i 2013. CC forårsaket 6,9 millioner uførejusterte leveår (DALY) i 2013 [1], og det var den nest vanligste dødsårsaken etter kreft blant meksikanske kvinner i 2011 (10,4%) [2 ]. CC er forårsaket av en vedvarende infeksjon med høy risiko humant papillomvirus (HR-HPV). Imidlertid er et HR-HPV-infeksjon ansett som en nødvendig, men ikke en tilstrekkelig grunn for CC utvikling [3]. Mekaniske faktorer, som vaginal skylling eller samleie, og biologiske faktorer, som bakteriell vaginose (VB) [4, 5], eller seksuelt overførbare infeksjoner (SOI) [6] endre vaginal mikromiljøet og har blitt identifisert som kofaktorer i utholdenhet av en HPV-infeksjon [7].
de aller fleste av HR-HPV-infiserte kvinner aldri utvikle CC fordi en tilstrekkelig immunrespons er i stand til å kontrollere infeksjonen og hindre dens utvikling til forstadier lesjon [8]. Dette tyder på at flere faktorer virker sammen med HPV å påvirke risiko for utvikling CC. Så langt har følgende determinant co-faktorer vært knyttet til utseendet på CC: sosio miljømessige faktorer (kulturelle barrierer, ekstrem fattigdom, dårlige sanitære områder, og begrenset tilgang til helsetjenester) [9], epidemiologiske faktorer (multiparity, bruk av p-piller i mer enn fem år, flere seksualpartnere og røyking) [10, 11], og genetiske faktorer knyttet til verten (polymorfismer i immunresponsgener, som avgjør en mangelfull immunrespons og lokal immunsuppresjon) [12- 14] . Derfor er CC en kompleks multifaktoriell sykdom, og videre forskning er nødvendig for å forbedre vår forståelse av dens etiologi.
Det har nylig blitt foreslått at unormal vaginal bakterieflora spiller en viktig rolle i utviklingen av livmorhals svulst [15] . En epidemiologisk studie identifisert
Chlamydia trachomatis
som en co-faktor for CC utvikling [16]. Likeledes kan andre studier viser at enkelte bakteriearter synes å være assosiert med utvikling av andre kreftformer, så som kreft i tykktarmen; disse studiene tyder også på at ulike bakteriearter fortrinnsvis bebo svulst områder [17, 18].
Det er fortsatt flere kunnskapshull når det gjelder sammenhengen mellom vaginal og livmorhals microbiomes og CC utvikling [19]. Bakteriell kulturbasert bevis indikerer at noen potensielle pro-onkogene patogener, som kan være medlemmer av commensal bakterieflora, bidrar til tumor initiering og utvikling [20, 21].
CC er en langvarig sykdom, og det er etapper tidligere til det der betingelsene for cervical og vaginal miljøet er endret, inkludert vaginal surhet og cytokin mønster som fører til en lokal immunsuppresjon tilstand. Tilstedeværelsen av Lactobacilli, en lav vaginal pH-verdi ( 4,5) og antimikrobielle peptider er en del av forsvarsmekanismer som er tilstede i vaginal mikromiljøet [22]. Når en ubalanse i immunsystemet oppstår, oppstår fysio endringer og produsere histologiske endringer av vaginalslimhinnen og cervical epitel, som alle forhold en selektiv press på microbiota [23]. I en CC mikromiljøet, tilstedeværelse av immunundertrykkende cytokiner (TGF-SS1, IL-10) favoriserer persistenceof HPV-infeksjon [24, 25, 26, 27]. De fleste studier av det kvinnelige kjønnsorgan mikrobiomer har blitt utført ved vaginal nivå og få studier involvere cervical bakterieflora og cytokin-profiler. En komparativ genomisk analyse av vaginal mikrobiomer har identifisert endringer i bakterieflora diversitet blant kvinner med genital human immunsviktvirus (HIV) infeksjon, med eller uten bakteriell vaginose (BV) [28] og i gravide kvinner [29]. I tillegg er det foreslått at vaginal mikrobielle økosystem og cytokin profilen spille en rolle i å fremme celleforandringer [30], gitt at en unormal vaginal bakterieflora har vært forbundet med kjøpet av en HPV-infeksjon [31]. Imidlertid har få studier er utført på cervical mikrobiomer som modifikator av HPV naturhistorie med hensyn til utvikling av livmorhalskreft og livmorhals svulst [32].
Med tanke på at det har blitt bevist at bestemte arter av cervicovaginal microbiota modulere den inflammatoriske immunrespons hos det kvinnelige kjønnsorgan av sunne svarte sørafrikanske kvinner [33], er det mulig at livmorhals mikrobiomer er involvert i å fremme uttrykket av immundempende cytokiner [34] .Vi har en hypotese om at HPV-infeksjon og utvikling av SIL og CC er knyttet til endringer i microbiota mangfold og med cytokin uttrykk mønstre på cervical nivå. Vår studie undersøkte sammenhengen mellom livmorhals microbiota mangfold og sammensetning, ifølge en histopatologisk diagnose av hvert trinn av den naturlige historien til CC, og cervical uttrykk nivåer av IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF -α og IFN-γ mRNA.
Materiale og metode
studie~~POS=TRUNC og befolkningen
en tverrsnittsundersøkelse ble gjennomført ved hjelp av prøver fra et biologisk bank bygget mellom 2008 og 2011 fra nydiagnostiserte tilfeller av plateepitel intraepitelial lesjoner (SIL) (n = 268 HPV-positive prøver); kvinner med en negativ Papanicolaou og en normal kolposkopi som kontroller (n = 205, 81 HPV-negative og 124 HPV-positive prøver), rekruttert fra kvinner Health Care Center i delstaten Morelos (
Centro de Atención para la Salud de la Mujer del Estado de Morelos
) i Mexico mellom juni 2008 og juni 2011, og fra livmor plateepitelkarsinom tilfeller (n = 171 HPV-positive prøver), rekruttert fra gynekologi service på National Cancer Institute (Inka) i Mexico by, mellom september 2010 og desember 2011. Bioetikk og forskningsutvalget ved Inka (referansenummer. inka /CC /326 /10CB /609) og ved Statens institutt for folkehelse (
Instituto Nacional de Salud Pública
-INSP, referansenummer: CI814) godkjent baseline studie der det biologiske banken ble bygget. I tillegg har alle deltakerne ga sitt samtykke til å bruke sine biologiske prøver for videre undersøkelser. Hver gjenstand ble intervjuet for livsstil, sosiodemografiske og reproduktive faktorer som er kjent for å være assosiert med økt risiko for CC [12].
For metodisk bekvemmelighet, valgte vi 32 saker for denne studien, ikke-livmorhalskreft (NCL : n = 10 HPV-negative; n = 10 HPV-positive), Sils (n = 4 HPV-positive) og CC (n = 8 HPV-positive). Inklusjonskriterier for subsample valg knyttet til medisinsk historie var: pasientens rekruttering på samme dag av menstruasjon (syv fremtidige helse menstruasjon dager), ikke-bruk av Douches og ingen seksuell aktivitet i tidligere dager etter prøvetaking. Også, ikke har registreringer av antibiotika eller soppdrepende bruk i de siste 30 dagene forut for prøvetaking. Andre inklusjonskriterier inkludert: molekylær HPV + diagnose; DNA og RNA renhet og integritet egnet for sekvensering og kvantifisere mRNA ved QRT-PCR, og å være meksikanske med meksikanske foreldre og besteforeldre for å sikre lik opphav. Den eneste eksklusjonskriterium var ikke å ha tilstrekkelig leser. «Vi vurderte en 000 som terskelen, etter å ha utført bioinformatikk sekvensanalyse. Den studerte befolkningens sosiodemografiske og reproduktiv-seksuell egenskaper er presentert i tabell 1. Alle forsøkspersonene var meksikanske kvinner hvis alder varierte fra 22 til 61 år. Det var en signifikant forskjell mellom gruppene med hensyn til prevensjon og den positive HPV-testen. CC pasienter rapporterte ingen bruk av prevensjonsmetoder oftere enn NCL pasienter. Angående SIL tilfeller de mest utbredte HPV genotypene var HR-HPV (non-HPV16 eller 18), mens blant CC pasienter de mest utbredte genotype var HPV 16.
Kjennetegn på den biologiske prøver banken
det ble tatt prøver fra kvinner cervix sju dager etter mensen uttak. Den biologiske bank brukt i denne studien består av DNA-prøver og cDNA hentet fra cervical epithelial skraping vattpinner fra kvinner diagnostisert med NCL og fra friske celler biopsier fra kvinner diagnostisert med SIL og CC. Genomisk DNA ble ekstrahert fra livmor epitelceller avskraping og biopsier tidligere fordøyd med proteinase K, ved hjelp av genomisk DNA Purification Kit (Fermentas biovitenskap, Vilnius, Litauen). Alle mulige tiltak ble iverksatt for å unngå kryss-kontaminering av prøvene under DNA-ekstraksjon. DNA-konsentrasjon og renhet ble bedømt ved Thermo Scientific NanoDropTM 1000 spektrofotometer (260/280) og DNA-integritet ble bestemt ved elektroforese i agarosegeler ved 1%. Total RNA ble isolert fra livmorhalsprøver ved bruk av Trizol reagens fra Invitrogen. cDNA-syntese ble utført i nærvær av 200 U av M-MLV revers transkriptase og 2,5 ug av total-RNA ved anvendelse av standardbetingelser. PCR-reaksjonene ble utført i et reaksjonsvolum på 25 pl inneholdende 1 pl av cDNA, 0,2 mM dNTPs, 15 pmol av hver primer, 2,5 pl reaksjonsbuffer and1U av Taq DNA-polymerase rekombinant. Primere for den humane rengjøring glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase GAPDH (450 pb) ble anvendt for å bekrefte cDNA integritet.
livmorhalsprøver ble testet tidligere for HPV. Viral DNA-fragmenter fra prøvene ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av primere konsensus årsmodell 09 /MY11 [35], LIC1 /LIC2 [36], og GP5 /GP6 [37], som flankerer den L1 regionen av HPV kapsid. PCR-amplifisering av GAPDH (556pb) ble anvendt som en intern kontroll for DNA-kvalitet. Cellelinjer som uttrykker HPV-16 (Siha) og HPV-18 (HeLa) ble anvendt som positive kontroller. Avionisert H
2o servert som en negativ kontroll. Alle produktene ble analysert ved elektroforese på akrylamidgeler på 6%. Positive prøver ble visualisert i en agarosegel ved 1,5%. DNA-båndet ble oppnådd ble ekstrahert og renset med MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og sekvensert ved hjelp av Sanger-metoden. HPV-sekvenser ble analysert ved BLAST. HPV ble kategorisert i henhold til sine fylogenetiske mønstre i lav- og høyrisikotyper: HPV16 og HPV18. HPV status ble bekreftet med Anyplex
TM II HPV HR Detection analysen fra Seegene
®, basert på multiplex real-time PCR, Toce og DPO primerpar teknologi, i henhold til leverandørens anvisninger. [38]
Etikk uttalelse
Denne undersøkelsen ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Den ble godkjent av Research, etikk og biosikkerhet komiteer på INSP (CI: 1143). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne
Analyse av livmorhals cytokin mRNA uttrykk
En QRT-PCR forsterkning ble utført i duplikat for analyse av genuttrykk med følgende TaqMan prober:. GAPDH (ID -Hs99999905_mL), IL-4 (ID-Hs00174122_mL), IL-6 (ID-Hs00174131_mL), IL-10 (ID-Hs00961622_mL), TGF-β1 (ID-Hs00961622_mL), TNF-α (ID-Hs00174128_mL) og IFN -γ (ID-Hs00174143_mL). Amplifikasjonen blanding ble fremstilt ved tilsetning av 100 ng av hver cDNA-prøve til en endelig reaksjonsblanding på 10 pl inneholdende 5 ul av TaqMan PCR masterblanding for ekspresjon, 0,5 ul probe og 3,5 ul av DNase-fri molekylær klasse vann. Forsterker sykluser (utført på en StepOnePlus ™ fra Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) var som følger: 94 ° C i 10 minutter, 40 sykluser ved 94 ° C i ett minutt, 54 ° C i ett minutt, 72 ° C i ett minutt og 30 sekunder, etterfulgt av 72 ° C i 15 minutter. GAPDH ble anvendt for å normalisere mengden av IL-4, IL-6, IL-10, TGF-ß1, TNF-a og IFN-y-mRNA til stede i hver prøve, [39]. Perifere blodmononukleære celler stimulert med fytohemagglutinin i 72 timer ble anvendt for å bestemme den dynamiske rekkevidden kurver av IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α og IFN-γ uttrykk; alle standardkurver ble realisert i tre eksemplarer. Ekspresjonsnivået av mRNA for hvert cytokin estudied ble beregnet ved bruk av relative mengde med sammenlignings Ct (2-ΔCt) metoden, tar GAPDH som det endogene genet. Prøvene ble analysert i duplikat.
Høy throughput sekvensering av 16S rDNA amplikonene
amplikonene av ~ 456 bp inneholder V3-V4 variable regioner fra 16S rRNA gener ble innhentet for DNA-bibliotekene forberedelse. Primere 347F Forward 5′-GGAGGCAGCAGTRRGGAAT-3 «og 803R Reverse 5′-CTACCRGGGTATCTAATCC-3», beskrevet av Nossa, ble brukt [40]. En første, PCR ble utført med følgende betingelser: 50 ng templat fra hver DNA-prøve ble tilsatt til et endelig reaksjonsblanding på 30 pl inneholdende 1 x reaksjonsbuffer, 2,5 mM MgSO
4, 1 mM dNTP, 0,2 U platina Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen) og 5 pmol /ul av primerne. Forsterkningen programmet var følgende: 94 ° C i 3 minutter, og deretter 30 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder, 68 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 68 ° C i 5 minutter. Amplikonene ble visualisert ved elektroforese i agarosegel ved 1%. DNA-båndene ble oppnådd ble renset ved MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland).
amplikonene ble gjen forsterket og behandlet med de samme primerne er koblet til adapteren A i 454 sekvenseringsprotokoll, etterfulgt av en 6- mer multiplex identifikator og av primer 347F. Reversprimeren var den samme for alle reaksjoner knyttet til adapteren B av den 454 sekvenseringsprotokollen. Reaksjonsbetingelsene var som følger: 0,0625 ng av hver DNA-prøve til en endelig reaksjonsblanding på 30 pl inneholdende 1 x reaksjonsbuffer, 2,5 mM MgSO
4, 1 mM dNTP, 0,2 U platina Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen) og 5 pmol /ul primere 347F og 803R. Amplifiseringscykluser var følgende: 94 ° C i 3 minutter, og deretter 15 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder, 68 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 68 ° C i 5 minutter. Gel-elektroforese ble utført i agarosegel ved 1,5% for å visualisere integriteten av de amplifiserte produkter. DNA-fragmenter ble renset ved MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og etterpå kvantifisert og vurdert. Amplikonene ble slått sammen i åtte biblioteker og blandet i en ekvimolar måte. Deretter ble bibliotekene renset med Ampurebeads XP (Beckman Coulter, Inc). Emulsjon PCR titrering og utbytte beregning ble deretter utført for å bestemme volumet av perlene for å laste inn i sekvenseringsplater. Deretter ble massiv sekvensering utført på Genome Sequencer Titanium Roche-454 (AppliedScience) plattform.
Bioinformatikk analyse
Den rå sekvenser av V3-V4-regionen fra 16SrRNA genet generert for hvert fragment ble behandlet med Roche-454 utfyllende programvare, og * .sff filene ble generert. Høy kvalitet lyder ble valgt med følgende kriterier: leser med mer enn fem sammenhengende baser med score under 20 på Qphred skala på en 30 baser bevegelige vinduet ble forkastet. Kvalitetskontroll (QC) ble overvåket med Thomas Girke R-skript som bruker en fastq Quality.R bibliotek for å plotte fordelingen av vurdering tildelt hver grunnlaget i sin posisjon på Qphred logaritmisk skala [41]. Når kvalitet filer og sekvenser ble oppnådd separat fra * .sff råfiler, ble demultiplexing gjennomført i QIIME å identifisere de sekvensene som tilhører hver prøve i henhold til deres molekylær identifikator (MID) [42].
Sekvensene var gruppert i drifts taksonomiske enheter (Otus) ved hjelp av PyNAST algoritme for sekvenssammenstilling. Alle sekvenser som hadde en likhet på 99% eller mer ble ansett som en enkelt otu [43]. En representant sekvens av hver Otu ble valgt for senere taksonomisk identifikasjon. Taksa ble programmert med Uclust algoritmen [44] under anvendelse av den grønne Genes databasen (99% frigjøring mai 2013) som referanse, slik at en hvilken som helst representativ sekvens innrettet med en 99% likhet til en referansesekvens kan være tilordnet den samme artsnavnet [ ,,,0],45].
Sekvenser som ikke er i tråd med referanse ble trukket ut til en annen fil for
de novo
montering og å bli vurdert i mangfoldet kalkulus. For å avgjøre om microbiota sammensetningen var i stand til å klynge prøver ved diagnose, ble en unsupervised hierarkisk clustering basert på Bray Curtis ulikhet mellom Otu overflod av hver prøve (S1 tabell) utført med R pakker og plottet som en heatmap. Alpha mangfold ble beskrevet ved hjelp av et fylogenetisk diversitet (PD) hele treet og Shannon mangfold indeks (H») beregning og deres vakuum,. En avstand matrise og hovedkomponenter (PC) ble beregnet med UniFrac å definere beta mangfold [46]. Videre ble en koordinat analyse (PCoA) tegnes med QIIME skript og visualisert i Emperor [47].
Vi klassifisert microbiota sammensetning ifølge samfunnet state type (CST) basert på dominerende taxa funnet i prøvene. En cervical CST er en klynge av samfunnstilstander (artssammensetning og overflod av en cervical samfunn) som er like i form av slag og relative Forekomsten av de observerte phylotypes [48]. Den clustering av samfunnet statene ble utført ved hjelp av en hierarkisk gruppering basert på Bray Curtis ulikhet mellom alle par av samfunnet stater og en gjennomsnittlig kobling.
Statistisk analyse
Aktuelle variabler ble sammenlignet mellom NCL vs SIL og NCL vs CC, ved hjelp av
χ
2 og Kruskal-Wallis test for kategoriske og kontinuerlige variabler, henholdsvis. T-elev tester ble utført for å bestemme den midlere forskjell mellom Shannon mangfold indeksen eller den fylogenetiske mangfold hele treet og histopatologisk diagnose. Logistisk regresjon modeller ble brukt til å bestemme sammenhengen mellom den histopatologiske diagnose og Shannon mangfold indeksen og histopatologisk diagnose (NCL uavhengig av HPV-status og SIL /CC) og PD hele treet, justering av alder, paritet, prevensjon og HPV-genotype .
Vi estimerte alfa mangfold risiko som en odds ratio (OR) med 95% konfidensintervall (KI). Estimert gjennomsnittlig forskjell på bits enheter (Shannon mangfold indeks) i livmorhalsen mellom SIL eller CC og NCL uavhengig av HPV-status ble vurdert av en lineær regresjonsanalyse justert etter alder, prevensjon og HPV-genotype. Vi evaluerte variasjonen av vektet UniFrac avstander ved hjelp av en Kruskal-Wallis test for å sjekke beta mangfoldet innenfor hver histopatologiske diagnosegruppe. En Wilcoxon Mann-Whitney-testen ble utført for å evaluere den statistiske signifikans av veide UniFrac avstander mellom SIL /CC vs NCL-HPV-negative.
Cervikal ekspresjon av IL-4, IL-6, IL-10, TGF -β1, TNF-α og IFN-γ mRNA ble analysert ved histopatologisk diagnose (NCL vs SIL og NCL vs CC) ved bruk av Wilcoxon Mann-Whitney-testen. Cervikal ekspresjon av IL-4, er IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α og IFN-γ mRNA analysert på tvers CST klynger ved hjelp av Kruskall Wallis test. Til slutt utførte vi direkte korrelasjon mellom analyser Shannon mangfold indeksen og cervical ekspresjon av IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α og IFN-γ mRNA. Vi utførte alle de statistiske analysene ved hjelp av Stata statistisk programvare, versjon 13.0 (StataCorp, Collage Station, TX, USA).
Resultater
Generelt mønster av livmorhals samfunn samplede
etter QC, var det 311 863 høykvalitets leser ulikt fordelt gjennom prøvene. For å løse dette problemet, ble 1000 tilfeldige underutvalg hentet fra rådata for hver prøve, og de ble brukt for videre bioinformatikk analyse. Alpha mangfold vakuum kurver (figur A i S1 File) viser at etter beregning H’in mer enn 400 lyder, gjorde subsample mangfold ikke øke; Derfor, 1000 sekvenser hadde tilstrekkelig sekvense dybde for denne studien. På unsupervised heatmap (figur 1), prøver fra NCL klynge sammen og uavhengig av HPV-status, viste at HPV-negative kvinner hadde en høyere andel av
Lactobacillus crispatus product: (46%) og en mindre av
Lactobacillus iners
(14,9%), mens HPV-positive kvinner hadde andelen 13,3% og 2,1%, henholdsvis. Interessant nok har disse proporsjoner så ut til å veksle med tilstedeværelse av HPV. Videre
L
.
crispatus
ble funnet i mindre andeler i SIL (14,4%) og CC (1,3%), mens
L
.
iners
falt til 2,1% i SIL og ble ikke oppdaget i CC.
Unsupervised heatmap av den relative overflod av mikrobiell taxa funnet i livmor mikrobielle samfunn av 29 fag, basert på Bray Curtis ulikhet beregning. De arter som er tilstede i relative overflod av 1% i minst én prøve er angitt på X-aksen. Den første linjen på venstre side representerer den behandlingen som følger: rød-HPV-negative uten lesjon; blue-HPV-positive uten lesjon; orange-plateepitel intraepitelial cervical lesjon; green-livmorhalskreft. CST er avbildet i den andre venstre barside; pink-CST III, dominert av
Pseudo oleovorans
; cyan-CST II dominert av
L
.
iners
; orange-CST jeg dominert av
L
.
crispatus
; green-CST IV dominert av
Sneathia
; blue-CST V dominert av
G
.
vaginalis
; gul-CST VIII dominert av
Fusobacterium spp.
; rød-CST VI dominert av
S
.
agalactiae
, og lilla-CST VII dominert av
Fusobacterium necrophorum
. Eksempel navn vises på høyre side av grafen. De cladograms på toppen av artene navnene indikerer den omtrentlige evolusjonære relasjonene mellom artene. CST: Felles State Type. Dx. Histopatologisk diagnose
Andre arter av
Lactobacillus
,
L
.
jensenii Hotell og
L
.
vaginalis
ble funnet bare i prøver fra kvinner med NCL.
Gardnerella vaginalis
ble funnet hovedsakelig i HPV-negative kvinner med NCL (11,5%), og den sank gradvis tvers av HPV-positive (6,9%), SIL (8,1%) og CC (3,3%) grupper.
S
.
agalactiae
representert mer enn 90% av bakterieflora sammensetningen av to av prøvene.
Pseudo oleovorans
ble observert i en relativ overflod på 19% bare blant HPV-positive kvinner med NCL. Bakterier fra
Fusobacteriales
orden ble funnet bare i SIL og CC grupper. I SIL gruppen,
Fusobacterium spp
. vises en relativ overflod av 6,3%;
Sneathia spp
, 26,6%.;
Shuttleworhia satelles
, 8,7%; og
Megasphaera elsdenii
, 10,4%; mens den relative overflod av de samme mikroorganismer i CC gruppe var som følger: 14%, 12,9%, 0%, og 2,2%, respektivt.
Fusobacterium necrophorum
ble kun observert i CC-gruppen (14,2%). Dette peker på det faktum at microbiota mangfold og sammensetning er annerledes blant de analyserte gruppene. For å bekrefte dette, ble alfa og beta mangfold analysert.
livmorhals samfunnene ble klassifisert i åtte CSTs henhold til de dominerende bakterier, som vist i Tabell 2. CST jeg isdominated av
L
.
crispatus product: (21%), CST II av
L
.
iners product: (17%), CST III av
Pseudo oleovorans product: (10%), CST IV av
Sneathia spp
. (17%), CST V av
G
.
vaginalis plakater (7%), CST VI av
Streptococcus agalactiae plakater (7%), CST VII av
F
.
necrophorum plakater (7%), og CST VIII av
Fusobacterium spp
. (14%). Med unntak av CST VI, ble alle prøvene gruppert i henhold til histopatologisk diagnose. CST Jeg ble består hovedsakelig av HPV-negative kvinner med NCL; CST II og III ble hovedsakelig sammensatt av HPV-positive kvinner med NCL; CST IV ble hovedsakelig sammensatt av SIL tilfeller; CST V besto hovedsakelig av kvinner med NCL uavhengig av HPV-status; CST VIII ble hovedsakelig bestå av CC tilfeller, og CST VII inkluderte bare tilfeller av CC (fig 2).
Bar diagram av relative overflod av arter per gruppe.
sammenligning av livmorhals microbiota mangfold på tvers av CC stadier
Alpha mangfold.
Selv om vakuum kurver for Shannon indeksen (figur A i S1 File) viste et høyere mangfold i CC og SIL grupper enn blant HPV-negative og -positive kvinner med NCL, fant vi at mangfold i seg selv, som står bare for rikdom og relative overflod, er ikke tilstrekkelig til å fastslå stadium av developmentof CC. Likevel, når det kommer til indekser som vurderer fylogenetiske beregninger som PD hele treet, fant vi en signifikant forskjell om fylogenetisk diversitet mellom HPV-negative NCL og SIL og mellom HPV-negative NCL og CC (p-verdier: 0,006 og 0,036, henholdsvis) (Tabell 3). Med andre ord, sammensetningen av cervical bakterieflora er forskjellig mellom gruppene. Boksplottene i figur 3 viser fordelingen av Shannon mangfold indeksen og PD hele treet over histopatologiske diagnosegrupper. Shannon mangfold Indeksen viser en økende trend, men det er ikke signifikant. PD hele treet viser en signifikant forskjell mellom HPV-negative NCL og SIL og mellom HPV-negative NCL og CC. SIL og CC grupper vise den mest varierte livmorhalsbakterieflora. Vi fant ikke en sammenheng mellom histopatologiske diagnose og Shannon mangfold indeks (NCL uavhengig av HPV-status og SIL /CC), og heller ikke mellom PD hele treet og histopatologisk diagnose i henhold til logistisk regresjonsanalyse (tabell 4). I vurderingen av tilknytningen mellom Shannon mangfold indeks for cervical mikrobiomer prøver og histopatologiske diagnose, var gjennomsnittlig anslåtte forskjellen på bits enheter mellom CC og NCL var 1,11 (95% CI, 0,057 til 2,165, (p = 0,04) (tabell 5) . Dette bekrefter at microbiota mangfold i CC tilfeller er høyere enn i NCL gruppen.
boksplott viser fordelingen av H «(bits enheter) og PD-verdiene på tvers av alle prøvene.
β-mangfold.
PCoA resulterer konsekvent viste at livmorhals mikrobiomer er særlig annerledes i alle faser av den naturlige historien til CC (figur 4A). de tre PC-er hvor plottet i 2D for parvise sammenligningen, PC1 stod for 33,44% av variasjonen mellom prøvene, PC2 for 26,85% og PC3 for 10,38% tilstedeværelsen av
Fusobacterium spp
,
Sneathia spp
. og
Megasphaera spp
. var knyttet til PC1. tilstedeværelsen av
bifidobakterier spp
. og
Pseudomonas spp
. var knyttet til PC2. fraværet av
Pseudomonas spp
.,
Fusobacterium spp
. og tilstedeværelsen av bakterier fra
Bifidobacteriaceae
familie var knyttet til PC3, i henhold til den beregnede faktor lasting matrise (tabell A i S1 File).
A. PCoA profil av histopatologiske diagnosen vises med vektede UniFrac avstander. Hvert tall representerer en prøve farget i henhold til sin histopatologisk diagnose. Røde sirkler representerer HPV-negative NCL prøver; blå firkantene representerer HPV-positive NCL prøver; oransje trekanter representerer SIL og grønne trekanter representerer CC. A1. Hovedkomponent (PC) -1 utgjorde 33,44% av variasjonen i sammensetningen av bakterieflora på grunn av tilstedeværelsen av
Sneathia spp
. og
Fusobacterium spp
. A2. PC-2 utgjorde 26,85% av variasjonen inthe sammensetningen av bakterieflora på grunn av tilstedeværelsen av
Bifidobacteria spp
. og
Pseudomonas spp
. A3. PC-3 utgjorde 10,38% av variasjonen i sammensetningen av bakterieflora på grunn av tilstedeværelsen av
Lactobacillus spp
. og
Streptococcus spp
. B. B1. Variasjon vektet UniFrac avstander innenfor hver histologisk diagnosegruppe. B2.
