Abstract
Bakgrunn
Basert på våre prekliniske funn, vi vurderer effekten av intratumoral injeksjon av dendrittiske celler (DC ) transduced med en adenovirusvektor uttrykker den sekundære lymfoide chemokine (CCL21) genet (Ad-CCL21-DC) i en fase i studie med avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Mens denne tilnærmingen viser immun-forsterkning, ved fremstilling av autologt DC for CCL21 genetisk modifikasjon er tungvint, kostbart og tidkrevende. Vi vurderer en ikke-DC basert tilnærming som utnytter hvelv nanopartikler for intratumoral CCL21 levering til mekle antitumor aktivitet i lungekreft.
hovedfunnene
Her beskriver vi at hvelv nanokapsel plattform for CCL21 leverings utløser antitumoraktivitet med hemming av lungekreft vekst. Vault nanokapsel pakket CCL21 (CCL21-hvelv) demonstrerte funksjonell aktivitet i chemotactic og antigenpresenterende aktivitetsanalyser. Rekombinante hvelv påvirket kjemotaktisk migrasjon av T-celler og denne effekten var overveiende CCL21 avhengig som CCL21 nøytralisering avskaffet CCL21 mediert forbedring i chemotaxis. Intratumoral administrasjon av CCL21-hvelv i mus med lungekreft forbedrede leukocyttisk infiltrater (CXCR3
+ T, CCR7
+ T, IFNy
+ T-lymfocytter, DEC205
+ DC), kreft svulst vekst hemmet lunge og redusert frekvensene av immunsuppressive celler [myeloide avledet suppressor celler (MDSC), T regulatoriske celler (treg), IL-10 T-celler]. CCL21-hvelv indusert systemiske antitumor responser ved å forsterke milt T-celle lytisk aktivitet mot foreldretumorceller.
Betydningen
Denne studien viser at hvelvet nanokapsel kan effektivt levere CCL21 å opprettholde antitumor aktivitet og hemme lunge kreft vekst. Hvelvet nanokapsel kan tjene som en «hyllevare» tilnærming til å levere antitumor cytokiner til å behandle et bredt spekter av malignitet
Citation. Kar Storbritannia, Srivastava MK, Andersson Å, Baratelli F, Huang M, Kickhoefer VA , et al. (2011) Novel CCL21-Vault nanokapsel intratumorale Levering Hemmer Lung Cancer Vekst. PLoS ONE 6 (5): e18758. doi: 10,1371 /journal.pone.0018758
Redaktør: Siyaram Pandey, University of Windsor, Canada
mottatt: 21 desember 2010; Godkjent: 09.03.2011; Publisert: 03.05.2011
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en University of California Discovery Grant (til LHR og VAK) en Jonnson Comprehensive Cancer Center Fellowship til UKK) og av National Institutes of Health Grants (RO1 CA95686 og RO1 CA126944), University of California Los Angeles Lung Cancer Program, Department of Veterans Affairs Medical Research Funds og tobakk relatert sykdom Program Award Program ved University of California (15RT-0207). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i USA og på verdensbasis [1]. Oppdatert med de eksisterende former for terapi, er den samlede langsiktige overlevelse bare 15%. Således blir nye terapeutiske strategier er nødvendig. Vi vurderer en roman hvelv nanokapsel som et bevis på konseptet for levering av immunpoten cytokiner for en «hyllevare reagent» for immunbasert terapi for lungekreft.
Vaults er cytoplasmatiske stedsnærværende ribonucleoprotein partikler først beskrevet i 1986 [2]. Native hvelv er 12,9 ± 1 MDA ovale kuler med dimensjoner på ca 40 nm i bredden og 70 nm i lengde [3], [4], som finnes i nesten alle eukaryote organismer med mellom 10
4 og 10
7 partikler per celle [5]. Til tross for deres cellulære overflod, forblir hvelv funksjon unnvikende selv om de har vært knyttet til mange cellulære prosesser, inkludert det medfødte immunrespons, multiresistens i kreftceller, mangefasetterte signalveier, og intracellulær transport [6].
Som en naturlig forekommende nanokapsel, kan hvelvet partikkel være en ideell struktur til ingeniør som et terapeutisk system for sammensatte innkapsling, beskyttelse og levering. Hvelv er meget stabile strukturer
in vitro
, og en rekke studier indikerer at partiklene er ikke-immunogene [7]. Vaults kan være konstruert og uttrykt ved hjelp av et baculovirus uttrykk systemet og heterologe proteiner kan være innkapslet innsiden av disse rekombinante partiklene ved hjelp av et protein-målsdomene betegnes INT for hvelv samhandling. Flere heterologe proteiner har blitt smeltet til INT domene (f.eks fluorescerende og enzymatiske proteiner) og disse fusjonsproteiner da pakket inn i rekombinante hvelvene, beholder sine opprinnelige egenskaper, og dermed gi nye hvelv egenskaper [8], [9].
CCL21 har blitt identifisert som en lymfoid chemokin som er overveiende og konstitutivt uttrykt ved høye endotelceller venules i lymfeknuter og Peyers patcher, lymfekar og stromale celler i milten og bilag [10]. CCL21 binder seg til kjemokinreseptoren CCR7, og er en kjemoattraktant for modne dendrittiske celler (DC), naive og minne T-celler [11], [12]. Dette kjemokin, sammen med CCL19, er nødvendig for normal lymfoid vev organisasjon som er til syvende og sist avgjørende for effektiv T-celle-DC-interaksjoner. Natural killer (NK) og natural killer T (NKT) antitumor effektorer også uttrykke CCR7 reseptor og er chemo tiltrukket av CCL21. Bruken av kjemokiner til å tiltrekke DC, lymfocytter, NK og NKT-effektorer til svulster kan tjene som en effektiv antitumor-strategi. Basert på dette konseptet, har vi tidligere vist at intratumoral administrasjon av rekombinant CCL21 reduserer tumorbyrde i murine lungekreft modeller [13]. Antitumoraktivitet indusert ved rekombinant CCL21 imidlertid nødvendig med høy og hyppig dosering fordi proteiner administreres intratumorally ikke beholdes lokalt for lengre perioder. Selv om disse studiene beskrevne rollen til CCL21 som et effektivt antitumormiddel, er hyppig høy dose intratumoral administrering klinisk begrensende med potensial for unødvendig systemisk toksisitet. Basert på begrensningene i denne tilnærmingen, undersøkte vi bruk av DC for intratumoral CCL21 levering [14], [15]. I prekliniske studier viste vi at intratumoral administrasjon av CCL21 genmodifisert DC førte til tumor utrydding i murine lungekreft modeller. Etter vår innledende beskrivelse av antitumor-aktivitet av CCL21, har flere grupper rapportert at CCL21 har potent antitumoregenskaper i forskjellige modellsystemer [16], [17], [18], [19], [20]. I alle modellene, CCL21 demonstrert potent tilbakegang av svulster, som ble vist seg å være avhengig av verts T-celle immunitet.
Basert på omfattende pre-klinisk evaluering, begynte vi en NCI finansiert klinisk studie for ett år siden å vurdere intratumoral injeksjon av DC transduced med en adenovirusvektor uttrykker CCL21 genet (Ad-CCL21-DC) i en fase i studie med avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [21]. Mens våre kliniske studier med intratumoral administrasjon av CCL21 genmodifisert DC viser immun ekstrautstyr, er utarbeidelsen av CCL21 uttrykke autolog DC tungvint, kostbart og tidkrevende. En effektiv off-the-sokkel reagens vil lette evalueringen av denne chemokine basert terapi. Mot å nå dette målet, er vi evaluere en ikke-DC basert tilnærming som utnytter hvelv nanopartikler for intratumoral CCL21 levering med det formål å initiere antitumor immunresponser i lungekreft. Vi forventer at bruken av hvelvnanopartikler vil omgå autolog DC forberedelse, minimere parti til parti variasjon og gi rom for sammenlignbarhet og standardisering. I tillegg hvelv nanopartikler konstruert for å slippe CCL21 kan brukes til å behandle et bredt spekter av kreftformer.
I denne studien har vi evaluert effekten av hvelv nanokapsel levering av CCL21 på veksten av Lewis Lung (3LL) svulster
in vivo
. Våre funn tyder på at en enkelt intratumoral administrasjon av CCL21-hvelvnanokapsler rekrutterer antitumor effektorer, induserer potent antitumor aktivitet og hemmer tumorvekst.
Materialer og Metoder
Rekombinante Vaults
CCL21 cDNA ble sammensmeltet i ramme til enten INT eller mCherry-INT [22]. Murine CCL21 ble PCR forsterket med primere: CCL21- frem GCGCGGATCCCCATGGCTCAGATGATG og CCL21- reversere GCGCAGATCTTCCTCTTGAGGGCTGTGTCTG. For å danne mCCL21-mCherry-INT i pFastBac, ble renset CCL21 PCR produkt fordøyd med BamH1 og Bgll og ligert til BamH1 fosfatase behandlet mCherry-INT pFastBac. Menneskelig CCL21 ble PCR forsterket med primere: CCL-21 F-Spel CCCCACTAGTC CAGTTCTCAGTCACTGGCTCTG, CCL-21-NheI CCCCGCTAGCTGGCCCTTTAGGGGTCTGTG, int med NheI CCCCGCTAGCTGCACACAACACTGGCAGGA, INT med XhoI GGGGCTCGAGTTAGCCTTGACTGTAATGGA å danne hCCL21-INT. Rekombinante baculovirus (r) ble samlet som beskrevet [7]. Sf9-celler ble infisert med mCCL21-mCherry-INT, INT-hCCL21 eller CP-MVP koder for baculovirus ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 0,01 til 65 timer. De infiserte celler ble fremstilt som beskrevet [7]. Lysater inneholdende CP-MVP hvelv ble blandet med lysater inneholdende mCCL21-mCherry-INT eller hCCL21-INT, og ble inkubert på is i 30 min for å tillate at INT-fusjonsproteinene til å pakke inne i hvelv. Hvelv ble renset som beskrevet [8], resuspendert i sterilt PBS og proteinkonsentrasjon bestemt ved BCA-analyse (Bio-Rad, CA). Eksempel integritet ble analysert ved hjelp av negativ flekkelektronmikroskopi eller Coomassie-farging av SDS-PAGE, fulgt av Western blot-analyse. CCL21-INT protein i hvelvet ble kvantifisert ved densitometrisk analyse av Western blot mot renset rekombinant INT protein som standard.
Antistoffer
Primære antistoffer for vestlige blot analyser var kanin anti-MVP antistoff (1 /1000 fortynning) [23] eller kanin-anti-VPARP antistoff (1/500 fortynning) [24] og sekundært geite-anti-kanin-HRP-antistoff (1:2000 fortynning) (Amersham). Den CCL21 og CXCR3 (220803) mAb var fra R D, (Minneapolis, MN), primær farging CD3 mAb var fra DAKO (Cytomation, Carpinteria, CA, USA). FITC, PE, APC, PerCP eller PerCP-Cy7-konjugert anti-muse mAbs til CD3 (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53 til 6,7) og isotype kontroll-antistoff var fra BD Biosciences (San Diego, CA), mAbs å oppdage Tregs med CD4 (GK1.5), CD25 (PC61), intranuclear foxp3 (FJK-16) IL-10 (JES5-16E3), IFNy (XMG1.2), DEC205 (205yekta), CCR7 ( 4B12) og EpCAM (G8.8) var fra eBioscience (San Diego, California), mAb CD11b (M1 /70), GR1 (RB6-8C5), var fra BioLegend (San Diego). Bradford protein kvantifisering fargestoff var fra Sigma.
Chemotaxis assay
kjemotakse analyser ble utført ved bruk av 24-brønners plater med 3 um porestørrelse innsatser (Costar /Corning, Corning, New York) i henhold til produsentens instruksjoner. 2,0 × 10
5 T2 celler i serumfritt medium ble lagt i det øvre kammeret. 200 ng /ml CCL21-mcherry-INT /hvelv, 600 ng /ml rCCL21 (R Gjennomsnitt ± SEM, * p 0,05 mellom mCCL21-hvelv og kontroll hvelv eller anti-CCL21 antistoff behandlingsgruppene. B. mCCL21-hvelv forbedret DC APC aktivitet og blokkerer CCL21 reverseres økningen i APC aktivitet. B3Z-celler (1 x 10
5 celler /200 ul /brønn) ble ko-dyrket med DC-2,4 (5 x 10
4 celler /200 ul /brønn) og ovalbumin (350 ug /ml) i nærvær eller fravær av mCCL21-hvelv (200 ng /ml) og anti-CCL21 antistoff (5 pg /ml) eller kontroll-antistoff (5 pg /ml geit-IgG) i 24 timer. Kontroll hvelv ble anvendt ved en konsentrasjon på 200 ng /ml. T-celleaktivering status ble målt ved hjelp av IL-2-produksjon ved hjelp av ELISA. Dataene er representative for 2 uavhengige eksperimenter. barer; Gjennomsnitt ± SEM, * p. 0,05 mellom mCCL21-hvelv og kontroll hvelv eller anti-CCL21 antistoff behandlingsgruppene
CCL21-hvelv forbedre rekrutteringen av leukocyttisk infiltrerer og hemme 3LL tumorvekst
Vi bestemte antitumor aktivitet av mCCL21-hvelv på etablerte 3LL tumor
in vivo
. En enkelt intratumoral injeksjon av mCCL21-hvelv (200 ng) førte til signifikant reduksjon i tumorvekst sammenlignet med tom hvelv (Fig. 3A). Den mCCL21-hvelv behandlingsgruppen viste forbedret intratumorale leukocyttisk infiltrerer sammenlignet med kontroll hvelv (fig. 3B) og immunfarging viste at infiltrater hovedsakelig CD3 uttrykker T-celler (panel Fig. 3 C nederst til høyre). Den antitumor effekt av mCCL21-hvelv ble bestemt i 7-dagers etablert orthotopic 3LL lungekreft modell. mCCL21-hvelv hemmet tumormengde av syv ganger sammenlignet med kontroller (Fig. 4A-B). I kontrollgruppen behandlingsgrupper (fortynningsmidler eller kontroll hvelv), var det 7-9% reduksjon i gjennomsnittlig kroppsvekt på slutten av den eksperimentelle varighet, men ingen signifikant vektendring ble observert i CCL21-hvelv behandlingsgruppe. En evaluering av intratumorale leukocyttisk populasjoner viste økt frekvens av CD4, CD8, CD3 CXCR3, CD3 CCR7 og DEC205 men redusert hyppigheten av MDSC og Tregs (fig. 4C).
A. CCL21-hvelv hemmet tumorvekst og forbedret intratumoral T-celle infiltrerer i lungekreft. C57BL /6 mus med 9 dagers 3LL etablerte tumorer (
s.c.
) Ble behandlet intratumorally med kontroll hvelv (200 ng), mCCL21-hvelv (200 ng) eller fortynningsmiddel normal saltløsning (NS). Halvere Tumordiametere ble målt med målepunktene. B-C. mCCL21-hvelv øket tilstrømning av CD3 uttrykkende T-celler i tumoren sammenlignet med kontroll hvelv. UBC-GFP /BL6 mus med 9-dagers etablerte tumorer ble behandlet intratumorally med kontroll hvelv eller mCCL21-hvelv. Oktober frosne vevet ble seksjonert, fiksert på lysbilder, og kontra med kjernefysisk fargestoff DAPI (blå). Kontroll tumorer (
toppanelet
) viser svært begrenset grønn fluorescens (infiltrerende celler) under en høyeffekts view (forstørrelse, × 400). De fleste grønne fluorescerende celler er store polygonale stromale celler mens kreftceller er kontra blue av DAPI. Immun farging for T-celler viser svært få CD3 uttrykker T-lymfocytter (panel øverst til høyre). I kontrast, fremtredende tumor-infiltrerende lymfocytter, små runde grønne fluorescerende celler er tydelig i svulster fra mCCL21-hvelv-behandlede mus (pil,
nedre panelet
). Immun farging for T-celler viser at de infiltrerer er CD3 uttrykker T-celler (nederst til høyre). Data; Gjennomsnitt ± SEM, * p 0,05 mellom mCCL21-hvelv og kontrollgruppen, n = 10 mus /gruppe
5 × 10
3 3LL-GFP tumorceller ble injisert i venstre lunge. via transtorakal ruten. En uke etter kreft injeksjoner, ble musene behandlet med fortynningsmiddel (NS), kontroll hvelv (2 mikrogram) eller mCCL21-hvelv (2 mikrogram) via transtorakal rute i venstre lunge. Dag 28 innlegg svulst implantasjon, lungene ble høstet for analyse av tumorbelastning og leukocyttisk infiltrerer. A. H 0,05 mellom CCL21-hvelv og kontroll hvelv grupper, n = 10 mus /gruppe
CCL21-hvelv øke svulst infiltrerende T-celler med forbedret IFNy men redusert IL. -10 og øke systemisk T-celle cytolytisk aktivitet
Tumor T lymfatisk infiltrerer fra mCCL21-hvelv behandlet mus hadde økt intracytoplasmatisk IFNy og redusert IL-10 (fig. 4D-E). Intratumoral mCCL21-hvelv indusert systemisk antitumor immun aktivitet:. Milt-T-celler fra mCCL21-hvelv behandlet mus hadde utvidet lytisk aktivitet mot foreldretumorceller
in vitro plakater (Fig. 4F)
Diskusjoner
Vi har tidligere vist at intratumoral rekombinant CCL21 eller CCL21-genet modifisert DC indusere en T-celleavhengig tumor reduksjon i murine modeller av lungekreft [13], [14], [15], [28], [29]. Basert på omfattende preklinisk modellering, har vi oversatt våre intratumoral DC-AdCCL21 tilnærming til behandling av avansert stadium lungekreft i en fase I klinisk studie. Selv om de første resultatene fra denne studien tyder på immun ekstrautstyr, evaluerer vi CCL21 leveringsmekanismer som vil eliminere behovet for å isolere og kultur autolog DC. For å oppnå dette har vi evaluert CCL21-hvelv nanokapsler som en «hyllevare» terapeutisk plattform mot tumorvekst
in vivo
utnytte godt karakterisert 3LL kreft modell. Vår begrunnelse for administrasjon av intratumorale CCL21-hvelv nanokapsler er å fremme rekruttering av T-lymfocytter og DC inn i svulsten mikromiljøet for en robust antitumor aktivitet.
Som en naturlig forekommende, ikke-immunogen, proteinbasert nanoskala kapsel, har hvelvet partikkel potensiale til å tjene som en fleksibel terapeutisk levering kjøretøy. Konstruert i baculovirus-systemet, partikkel selv setter sammen fra en enkelt uttrykte protein som kan modifiseres for å tillate celle målretting, spesifikk endocytose og endosomet penetrering [7], [8], [9], [30]. Proteiner og peptider smeltet til et hvelv rettet mot domene er pakket i partikkelen, beskyttet mot ytre miljø og sluppet sakte. Dette er den første studien som beskriver at hvelv nanokapsler kan være konstruert for å pakke og beholde biologisk aktive CCL21. Våre resultater viser at selv om tomme hvelv og rCCL21 er hver kjemotaktisk, emballasje chemokine i hvelvet synergistisk øket T-celle migrasjon, noe som tyder på at den vedvarende frigjøring av CCL21 av hvelv partikkelen kan etablere en bratt chemotatic gradient. Nøytraliserende antistoffer mot CCL21 avskaffet kjemotaktisk aktivitet av CCL21-hvelv som viser at den kjemotaktiske aktiviteten var overveiende CCL21 avhengig. Basert på resultatene av kjemotaktiske eksperimenter, vurderte vi effekten av CCL21-hvelv på DC APC aktivitet. CCL21-hvelv utvidet DC APC aktivitet og nøytralisering av CCL21 avskaffet denne aktiviteten. I forhold til rCCL21, CCL21-hvelv stimulert DC APC aktivitet til høyere nivåer på en tiendedel av konsentrasjonen av rCCL21, noe som tyder på en større DC affinitet for CCL21-hvelv nanokapsel.
Basert på vår
in vitro
funn, CCL21-hvelv ble evaluert i en terapeutisk lungekreft modell
in vivo
. Våre resultater viser at hvelvet utforming er effektiv til å inhibere veksten av etablerte tumorer. En enkelt intratumoral injeksjon av CCL21-hvelv førte til signifikant hemming i tumorvekst sammenlignet med kontroller. Våre data antyder at CCL21-hvelv formulering er så effektiv i forhold til de hyppige høye doser av rCCL21 [13]. I både subkutan og ortotopiske lungetumormodeller av CCL21-hvelv terapi ble administrert intratumorally. I fremtidige studier ved evaluering av effekten av svulst antigen spesifikke hvelv nanocaspsules vaksinasjons ruter i verne- og terapeutiske innstillinger med
iv
eller
ip
levering ruter, endringer i plasma /serum transaminaser nivå vil være kvantifisert for hvelv effekter på leverfunksjonen. Selv i migrasjon analysen, kontroll hvelv demonstrerte kjemotaktisk aktivitet, fikk kontroll hvelv ikke påvirke tumorvekst sammenlignet med fortynningsmidler behandlingsgruppen. Dette tyder på at CCL21 er den kritiske komponent i hvelvet nanokapsel for induksjon av antitumoraktivitet. I det videre arbeidet vil vi skjerme både pro-apoptotiske og anti-apoptotiske proteiner i svulstene å oppfatte endringer i respons på CCL21-hvelv nanokapsel terapi for å mechanistically utforske apoptotiske programmer indusert av denne behandlingen.
In vivo
, menneske CCL21 inneholder hvelv var så effektiv som den murine CCL21-hvelv redusere 3LL tumorvekst (data ikke vist). I forhold til kontroller, CCL21-hvelv behandling resulterte i omfattende tumor T og DC leukocyttisk infiltrerer.
