Abstract
alkoholisk steatohepatitis (NASH) er relatert til metabolsk feilregulering og endringen av endoplasmatiske retikulum (ER ) homeostase som ofte utvikler seg til leverkreft (HCC). Gp78 er E3 ligase som regulerer endoplasmatiske retikulum-assosiert degradering (erad) ved ubiquitinylation av misfoldede ER proteiner. Her rapporterer vi at ved aldring (12 måneder), gp78
– /- mus utviklet fedme, rekapitulere aldersrelatert menneskelig NASH. Leverhistologi av gp78
– /- mus viste typisk steatose, leverbetennelse og fibrose, etterfulgt av progresjon til hepatocellulære svulster. Akutt ER stress avslørte at tap av gp78 resultater i opp regulering av utfoldet protein respons (UPR) stier og SREBP-en regulerende
de novo
lipogenese, ansvarlig for fettlever. Tissue rekke menneskelige leverkreft (HCC) viste at uttrykket av gp78 ble omvendt korrelert med kliniske graderinger av kreft. Her har vi beskrevet den generasjon av den første prekliniske eksperimentelle modellsystem som spontant utvikler aldersrelatert NASH og HCC, linke erad til hepatosteatosis, skrumplever og kreft. Det tyder på at gp78 er en regulator av normal leveren homeostase og en tumor suppressor i human lever
Citation. Zhang T, Kho DH, Wang Y, Harazono Y, Nakajima K, Xie Y, et al. (2015) Gp78, en E3 ubiquitin ligase Fungerer som en gatekeeper Demper Nonalcoholic steatohepatitis (NASH) og leverkreft. PLoS ONE 10 (3): e0118448. doi: 10,1371 /journal.pone.0118448
Academic Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES
mottatt: 03.10.2014; Godkjent: 16 januar 2015; Publisert: 19 mars 2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
alkoholisk fettleversykdom (NAFLD) er den mest dominerende lever manifestasjon av metabolsk syndrom og er en sykdom med flere egenskaper inkludert enkel steatose og alkoholisk steatohepatitis (NASH). NASH er preget av overflødig fett i leveren, betennelse, skade og fibrose, som kan utvikle seg til skrumplever og leverkreft (HCC) [1,2]. Steatose er definert som tilstedeværelse av lever triglycerid (TG) dråper i mer enn 5% av hepatocytter [2]. Dette scenariet fra NASH til kreft er ikke endelig bestemt, selv om tidligere musemodeller ble opprettet for å rekapitulere funksjoner i en menneskelig sykdom kontinuum [2,3]. I molekylære mekanismer som ligger til grunn NAFLD, har det endoplasmatiske retikulum (ER) stressrespons nylig blitt foreslått å spille en avgjørende rolle [4,5]. Det endoplasmatiske retikulum (ER) er et membrannettverk ansvarlig for syntese, modning, og protein sortering til plasmamembranen eller ekstracellulær
milieu product: [6]. Utbrettet protein respons (UPR) er aktivert for å takle patofysiologiske agenter eller vilkår for å lokke fram ER stress ved å redusere proteinsyntesen, tilrettelegging protein degradering, og øke produksjonen av anstand og foldases som styrer begynnende eller misfolded protein for å kaste riktig [7]. Tre store armer UPR er evolusjonært konservert fra gjær til metazoans og fungere som proksimale sensorene ER stress, som er membran-dekkende proteiner inkludert aktivere transkripsjonsfaktor 6 (ATF6), inositol-krever enzym 1 (IRE1), og dobbelttrådet RNA -aktivert proteinkinase-lignende ER kinase (PERK) [7]. Hvis misfoldede proteiner ikke er funksjonelt løst, blir de translocated fra det endoplasmatiske retikulum (ER) til cytosolen hvor de brytes ned av de ubiquitin-proteasom-maskiner, kjent som ER-assosiert degradering (erad) [8,9]. Men forsinket eller utilstrekkelig UPR kan slå fysiologiske homeostase til patofysiologiske utfall, inkludert fettansamlinger, betennelse, fibrose og apoptose, systemisk fører til kroniske stoffskiftesykdommer som fedme, insulinresistens og type 2 diabetes [6]. Kobling av UPR veier til forebygging av steatose, har vært belyst i knockout mus som blir forstyrret av en enkelt UPR sensorarmen eller umiddelbar nedstrøms genet, som fører til leversteatose som knockout mus av ATF6α, lever spesifikk Ire1αand GRP78 anstand [10]. Mekanismene bak ER stress-indusert steatose inkluderer aktivering av sterol regulatorisk element bindende proteiner (SREBPs); transkripsjonsfaktorer som er involvert i
de novo
lipid biosyntesen. Forhøyet SREBP-1c korrelerer med leversteatose i menneskelige NAFLD pasienter [11]. Ved langvarig belastning, ble rollen til C /EBP homologe protein (CHOP) i ER stress-indusert apoptose illustrert i hogge
– /- mus hvori CHOP mangel gir delvis motstand mot ER stress-indusert apoptose [12]. Bidraget av UPR-mangel og langvarig ER stress til patogenesen av HCC har blitt belyst i kjemiske kreftfremkallende-indusert CHOP knockout mus og induksjon av CHOP er ofte observert i transposon-indusert leversvulster [13].
erad er ofte på som en konstitutiv prosess på grunn av de sporadiske feil som kan oppstå under syntesen og folding av proteiner. Den regulerer også omsetningen av visse foldede proteiner som regulerer stoffskiftet [14]. Den kobler seg med UPR ved å eliminere misfoldede proteiner og på grunn av dette, gener av erad maskiner er oppregulert ved ER stress og UPR trasé [15]. Genetisk ablasjon av et antall erad komponenter fører til embryonisk dødelighet i mus av Hrd1 /synoviolin E3 ligase og p97 (VCP /CDC48) ATPase [16,17], som fremhever den funksjonelle nødvendigheten av erad. Således er mangel på erad foreslått å munne ut i akkumulering av misfoldede proteiner i lumen og membran av ER, en tilstand kjent som kronisk ER stress, som er felles for flere sykdommer [18].
gp78 var ved først identifisert som en reseptor for autokrin motilitet faktor (AMFR) og ble deretter karakterisert som et RING-avhengig og eR membran-forankret E3 ligase hvis katalytiske domener som befinner seg i cytoplasma [19]. Det har også multippelmembran som spenner over domener, involvert i ubiquitinering-mediert nedbrytning av forskjellige substrater, inkludert CD3-δ, ApoB lipoprotein, cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR), og den metastase suppressor KAI1 [20,21]. Andre har rapportert at gp78 kan ubiquitinate visse kastet proteiner og kan fungere som en metabolsk regulator av gener som HMG-CoA reduktase (HMGCR) og Insigs involvert i lipidmetabolisme. På den annen side, gitt den kritiske rolle av gp78 i erad regulerende ER homeostase, er det tenkelig at en feil av gp78-mediert erad prosesser kan føre til kroniske ER stress og har en betydelig innvirkning på cellenes levedyktighet, spesielt for celler som bærer en tyngende misfoldede proteiner og kan være assosiert med NASH.
formålet med studien var å undersøke den spontane fenotype av gp78-knockout mus eksponert for normale kosten forhold. Vi har funnet en aldersrelatert gp78 rolle i forbindelse med feilregulering av metabolisme og ER homeostase i leveren av gp78 knockout mus. Genetisk avbrudd av gp78 hos mus utviklet fettlever, betennelse og spontan leverkreft hos eldre mus.
Resultater
Bygging av gp78-KO mus og gp78 opp regulering i respons til ER stress
Gp78 heterozygote mus ble oppnådd med ES-cellelinje, generert av genomisk innsetting av et gen som fangende vektor. Genet fang vektor ble innsatt i det første intron nedstrøms for ATG kodonet mellom de første og andre eksoner, som blokkerer produksjonen av endogent transkripsjon (Fig. 1A). For å undersøke nødvendigheten av gp78 under embryonal utvikling, intercrosses mellom
gp78
+/-
heterozygote progenies ble utført og gitt levedyktig
gp78
– /- homozygot
mus ved en normal mendelsk frekvens. For å utelukke tilstedeværelse av avkortede gp78 protein nedstrøms for avbrudd nettstedet i gp78-KO celler, ble RT-PCR og protein analyser utført og bekreftet at gp78-KO mus ikke uttrykte gp78 mRNA eller protein i embryonale lysat eller levervev (Fig . 1B). Heretter disse musene ikke uttrykker gp78 er referert til som gp78-KO. Av notatet, ble endogent gp78 protein i villtype (WT) celler og vev ikke oppdaget i vanlige vestlige blotter, uavhengig av maksimal lasting og bruk av ulike anti-gp78-antistoffer. Gp78 protein kunne visualiseres i villtype-mus etter anrikning ved immunoutfelling med anti-gp78-antistoff, noe som tyder på at gp78 uttrykk ikke er allestedsnærværende i hepatocytter og /eller er vanligvis meget lav. Konsekvent, immunhistokjemi viste at gp78 ble farget i villtype hepatocytter rundt portvenen (Fig. 1C). Deretter rettet vi regulering av gp78 uttrykk i udødeliggjort leverceller og kreftceller. For å undersøke hvorvidt gp78 uttrykket er involvert i ER stress-indusert erad i levercellene, behandlet vi cellene med tunicamycin (TM) for å indusere ER stress, noe som resulterer i oppregulert gp78 uttrykk (Fig. 1 D), noe som tyder på at gp78 uttrykk og sin aktivitet er nødvendig for å lindre avbrudd av eR homeostase. Kryssing med inter- og intra-genotyper viste at homozygote viste ingen åpenbare fenotyper, som de er levedyktig, grovt normal og fruktbar. Det er overraskende at gp78 er ikke avgjørende for embryoutvikling eller overlevelse, med tanke på funksjonen og viktigheten av erad maskiner og dens konstitutive prosessen [16,17].
(A) Skjematisk fremstilling av gp78-målrettingsstrategi. Den gp78-allelet påvirket ved innføring av et gen felle vektor (OmniBank Vector 76) i den første intron. Genomisk DNA isoleres fra WT, heterozygot og homozygot ble genotypet ved PCR. Primer sett inkludert doble reverse primere designet for intern PCR kvalitet. (B) Total RNA og lysater ble fremstilt i embryo og voksen lever og ble analysert i RT-PCR (Topp), ble begge lysater immunopresipitert med kanin anti-gp78-antistoffer (epitop: 524-537) og deretter immunoblottet med monoklonalt anti-gp78 antistoffer (epitop: 451-551) for å identifisere gp78 protein (nederst). (C) Immunhistokjemi (IHC) av leveren med monoklonalt anti-gp78-antistoff. Pil viser gp78 positiv flekken. PV, portvenen. Originalbilde, x400. (D) Oppregulering av gp78 som reaksjon på ER stress. Udødeliggjort thle-3 og kreft HepG2 leverceller ble behandlet med tunicamycin (1 ug /ml) i 24 timer. og lysater ble immunopresipitert med anti-gp78-antistoff og immunoblottet. GRP78 /BIP, et chaperon av UPR veier. (F) Fotografi av magen av en-åringen mus (til venstre). Sammenligning av kroppsvekten av WT og gp78-KO mus på 3 måneder (n = 25), 6 måneder (n = 25), 12 måneder (n = 25) old (høyre). Stjerne indikerer en betydning bestemmes av Student test (*, p 0,05).
ablasjon av gp78 induserer leversteatose og betennelse hos eldre mus
Aldring er uten tvil den mest universelle risikoen faktor for de fleste av de vanligste sykdommer, inkludert type 2-diabetes mellitus (diabetes mellitus type 2), neurodegenerering og kreft som ofte assosiert med metabolske feilregulering og /eller akkumulering av misfoldede proteinaggregater [22]. Derfor forventet vi at aldring relaterte stoffskiftesykdom og feilregulering av protein homeostase potensere gp78 taps knytte erad mangel på grunn av foreslåtte gp78 roller
in vitro
som en metabolsk regulator og /eller en gatefeier for misfoldede proteiner. Det var en bemerkelsesverdig observasjon at mer enn 70% av gp78-KO mus vokse fett med abdominal fedme i en alder av rundt ett år (Fig. 1E). Visceral fedme er assosiert med lipiddysregulering, insulinresistens, og NAFLD [2]. I tillegg, er leveren det organ som har ansvar for
de novo
lipogenese og systemisk styrer overtagelse og fjerning av triacylglyserol (TG), som stammer fra tre kilder (diett,
de novo syntese
og fettvev ). Således har vi undersøkt utvikling av leversykdom i gp78-KO mus, og undersøkt genekspresjon i forhold til lipidmetabolisme og ER stress markører i levervev av 12 måneder gamle overvektige gp78-KO mus, noe som resulterer i ingen signifikant forskjell av genekspresjon mønster (S1A fig.). I henhold til tidligere studier i dyrkede celler med eksogent kolesterol, ubiquitinates gp78 HMGCR, som er et hastighetsbegrensende trinn i kolesterolbiosyntesen og også Insig-2, som hindrer aktivering av SREBPs (SREBP-1a, 1C), fremme transkripsjon av gener relative til lipid biosyntesen og mobilisering [23-25]. Imidlertid opp regulering av HMG-CoA-reduktase og undertrykkelse av SREBP-1 ble ikke signifikant observert selv om Insig-2 oppregulering er konsekvent observert i våre gp78-KO hepatocytter. Etter avtale med en rapport over andre gp78-KO embryonale fibroblast celler [26], gp78-KO mus viser heller ingen bevis for at gp78 er direkte innblandet i kolesterolsyntesen gjennom HMGCR degradering. Neste, vi farget med hematoxylin og eosin (H E) for å undersøke dyslipidemi i flere lever fliker av fettstoffer gp78-KO mus. Forbløffende nok observerte vi lipid dråper av hepatocytter sammen med inflammatorisk infiltrasjon utelukkende på lokale områder av leverlappene og ikke hele regioner (Fig. 2A). Bevis recapitulating NASH i gp78-KO mus viser at hepatocytter fra gp78-KO er vesentlig forstørret, utspilt ved store enkle eller multiple veldefinerte dråper av fett, sterkt forskjellig fra de WT hepatocytter som har utpreget runde kjerner med en eller to fremtredende nukleoli ( fig. 2A, a). Deretter ble akkumulering av lipider i leveren av gp78-KO mus bekreftet ved olje-rød O-farging (fig. 2B). Masson s Trichrome flekken for validering av progressiv NASH avslørte en uregelmessig fordeling av kollagenfibre i leveren av gp78-KO, en indikasjon på leverskade og fibrose (Fig. 2C). En annen merkbar fenotype av gp78-KO mus er hepatisk inflammasjon, karakterisert ved infiltrasjon av inflammatoriske celler i hvilke lymfocytter infiltrere, samles, og grensesnitt mellom lever lobules i gp78-KO lever uavhengig av fettakkumulering (fig. 2A, c og S2 fig. ). Derfor er denne hepatitt av gp78-KO mus er sannsynlig å være uavhengig av steatohepatitis progresjon. I sammendraget, leveren av all-obese gp78-KO mus utviklet enkle steatose og /eller leverbetennelse selv i varierende grad (Fig. 2D). Disse resultater viser at gp78 spiller en undertrykkende rolle i abnormal fettakkumulering og dens uttømming som fører til ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH) hos eldre mus. I mellomtiden, ulike grader av steatose henhold til gp78-KO lever hindret oss i å identifisere molekylære relevans til lipogenese og ER stress i immunoblotter (S1 A Fig.). Men det åpner for muligheten for at leverceller med samme gp78 null genetisk bakgrunn er forskjellig i fare for steatose og gp78 sletting av seg selv ikke er tilstrekkelig for NASH fremgang, som samtidig indusert av aldersavhengig «andre hit «.
(A) Livers av 1-åringen gp78 KO mus, vokst med normal diett ble farget med H E og visualiseres som indikert forstørrelse. (A) steatohepatitis viser hevelse cytoplasma med fettdråper (svart pil) og infiltrere celler. (B) Milde lipid dråper og infiltrere celler (rød pil). (C) infiltrere celler samles i fravær av lipid-dråper. (B) Olje rød flekk. Pil viser lipid dråper. (C) Trichrome flekk ble utført for å identifisere blå farget kollagenfibre. PV; portal vene, FL; fettlever området. (D) Prosent av forekomsten inkludert mild fettlever, betennelse i en år-gamle KO mus (n = 25 mus per hver gruppe).
Tap av gp78 etter akutt ER stress fører til ER stress -mediert steatose gjennom SREBP-en aktiverings
Vi først ønsket å forstå mekanismen (e) der knockout av gp78 gir opphav til høye forekomsten av NASH hos eldre mus. Som vi en hypotese om at både gp78 sletting og «aldersrelatert andre hit» er ansvarlig for NASH utvikling i gp78-KO mus, det kjørte oss til å undersøke hvorvidt en aldersrelatert andre treffet er spontan og tilfeldig ER stress, vises i ulike karakterer gjennom lever. Således forventet vi at hele gp78-KO lever ville akkumulere lipiddråper som reaksjon på tunicamycin, en akutt ER stress-indus. Vi injisert en sub-letal dose av tunicamycin (TM) intraperitonealt til 6 måneder gamle gp78-KO mus, som var umulig å skille fra WT mus. Som forventet, musene raskt mistet vekt etter TM behandling, med et større tap i gp78-KO enn WT mus (Fig. 3A). TM-injisert lever var brun farget på 3 dager (fig. 3B). Liver fargen gp78-KO på 11 dager ikke helt tilbake til det av kontrollene. Histologisk analyse visualisert en markert forskjell mellom leveren av WT og gp78-KO mus etter TM injeksjon. Mens mindre lipid dråper ble observert i TM-behandlet WT lever under høyt forstørrelse, ble lipid dråper sammen med celleballong lett oppdages gjennom hele gp78-KO leveren (fig. 4C). TM-indusert steatose av gp78-KO vist på hele leveren, sammenlignet med lokale og partielle områder i spontan steatose av alderen gp78 KO leveren (fig. 2A og C). Det sterkt antydet at spontan NASH i alderen gp78-KO mus er forårsaket av spontan og tilfeldig ER stress. Deretter utførte vi immunoblot analyse med leverlysatene å belyse molekylære mekanismene bak fettlever av gp78. I tråd med arbeidet med cellelinjer (Fig. 1D), Den defensive rollen gp78 mot akutt ER stress var underforstått, basert på observasjon at gp78 uttrykket ble også opp regulert
in vivo
etter TM behandling (S1B fig.). Sammen med dette, GRP78 chaperon, beskytte misfoldede proteiner viste høyere uttrykk i TM-injisert gp78-KO enn WT mus. Tidligere rapporter viste at kronisk ER stress er involvert i patogenesen av steatose [5,10]. De molekylære mekanismene som ligger til grunn ER stress-mediert steatose omfatte opp regulering av transkripter og aktivering av SREBP-1, som er en hovedregulator av fettsyre og triglyserid-biosyntese, mens Insig-2 er et samspill suppressor av SREBP-1 på ER membranen [ ,,,0],24]. Dermed under kronisk ER stress, nedregulering av Insig-2 fører til SREBP-en aktivering etterfulgt av
de novo
lipogenese og lever steatose [10,24]. Vi undersøkte nedregulering av Insig-2 etterfulgt av opp regulering av spaltede form av SREBP-en i henhold TM stimulans og observert flere aktivering av SREBP-1 i TM-behandlet gp78-KO leveren (S1B fig.). Dermed SREBP-mediert lipogenese er delvis ansvarlig for TM-indusert fettlever av gp78-KO. Det neste spørsmålet var om tregere utvinning av kroppsvekt i gp78-KO mus (Fig. 3A) er på grunn av langvarig ER stress der protein misfolding er vedvarende eller overdreven. Vi analyserte 11 dager gamle mus injisert med TM å undersøke leveren status. Resultatene tyder på vedvarende steatose samt progresjon av fibrose i gp78-KO leveren, mens WT var fullt restituert til sine ikke-injisert status (Fig. 3D). Konsekvent, immunoblotter viste at SREBP-1, som regulerer lipogenese ble fortsatt aktivert på 11 dager med gp78-KO leveren, mens nivået av WT ble gjenvunnet til nivået i ubehandlet mus (Fig. 3E). I tillegg TM-behandlet gp78-KO på 11 dager viste lengre halveringstider på GRP78, PDI, og UPR sensorer (IRE, ATF6, og perk), indirekte markører for opphopning av misfoldede proteiner, enn WT kolleger. Opprettholdt uttrykk for UPR forstått forlenge ER stress i TM-eksponerte gp78-KO leveren. Når ER-funksjonen er alvorlig svekket ved langvarig ER stress, utløser organeller apoptotiske signaler og C /EBP homologe protein (CHOP) er en avgjørende faktor av komponentene i ER stress-mediert apoptose reaksjonsvei [12]. For å undersøke om tap av gp78 påvirker cellenes levedyktighet grunn til å forlenge ER stress, isolert vi gp78-KO embryonale fibroblast celler (MEFs). Vi undersøkte om levedyktigheten til gp78-KO MEFs er følsomme for TM behandling (Fig. 3F). Reduksjon av overlevelse i gp78-KO MEF celler er molekylært støttet av en liten opp regulering av GRP78, PDI, og betydelig uttrykk for pro-apoptotisk CHOP i gp78-KO MEF celler (Fig. 3F). Sikkert, disse resultatene overbeviste oss om at tapet av gp78 faller inn i en tilstand av kronisk ER stress følgende indre eller ytre faktorer av ER stress i eldre mus. Med andre ord, spiller gp78-E3-ligase en kritisk rolle i ER stress-mediert erad i alderen hepatocytter.
(A) 1 mg /kg kroppsvekt av tunicamycin (TM) ble injisert intraperitonealt til 6 måneder gamle gp78 -KO mus. Kroppsvekt representert etter normalisering til utgangsvekten som de mente ± SE (n = 3 per gruppe). (B) Reddik lever er brun farget etter TM injeksjon. Lever av gp78-KO på 11 dager ble ikke gjenopprettet. (C) Akutt ER stress forsterker hele fettlever av gp78-KO. H E flekk på 3 dager etter TM injeksjon. Ballong celler (b) er vanligvis større størrelse enn WT hepatocytter (a). Cytoplasmatiske lipid dråper (pil) (40x). (D) Langvarig fettlever og fibrose i gp78-KO. H E, olje røde og Trichrome flekker på 11 dager etter TM injeksjon. Hvit ballong celler (piler) ble opprettholdt på H E (200x). Frosne vev ble farget med olje-rød O. Uregelmessig fibrose ble utvidet fra bindevev i portvene rundt akkumulerte lipid dråper (hvite flekker) på rosa gp78-KO leveren (100x). (E) Vedvarende SREBP-en aktivisering sammen med UPR opp regulering er ansvarlig for fettlever av gp78-KO. TM-injiserte mus ble scarified henholdsvis (n = 3). Lever ekstrakter på angitte dager ble utsatt for immunoblotter. GRP78, Glukose-regulert Protein; PDI, Protein disulfide isomerase, SERBP; Sterol Regulatory Element Bindende transkripsjonsfaktor; Insig, Insulin Induced Gene. (F) hogge-mediert apoptose. Celle overlevelse ble analysert med levedyktig telling i gp78-KO mus embryonale fibroblast (MEF) celler behandlet med TM (1 ug /ml) som angitt ganger (øverst). Induksjon av UPR ble analysert i immunoblot og gp78-ekspresjon ble visualisert etter dens immunoutfelling (nederst). Hugge; ER stress-mediert apoptose markør.
(A) Photography i gp78-KO mus huse to leversvulster. (B) H E flekken. Pilen viser karakteristisk for leverceller og flere nucleoli per kjerne. (C) Skrumplever i gp78 leveren. Trichrome flekken i en annen tilstøtende flik av leveren peiling svulst. Blå farge viser fibrose. (D) Serial deler av gp78-KO lever husing tumor (T) og tilstøtende normalt levervev (NT) ble underkastet analyse IHC med antistoffer som er spesifikke til ki-67, men da spredning; glypican-3, human HCC markør; β-catenin, avvik Wnt signal markør hhv. (E) Gp78 nedregulering i IHC rekke menneskelige HCC. Duplisert eksemplarer per pasient ble farget med anti-gp78 antistoff. A, normal lever (mer enn 50% flekk); b, stadium I ( 50% flekken); c, stadium II ( 10% flekken); d, stadium III (0% flekken). Grafen representerer nivået av gp78 uttrykket i henhold til tumor klasse (normal lever, n av pasientens = 10, trinn I, n = 3, trinn II, n = 40; stadium III, n = 46). En score ble beregnet (0, negativ, 1, 10%; 2, 10% til 50%, 3, 50% positive flekker). (F) hypotetisk mekanismen bak NASH og HCC patogenesen i gp78-KO mus. Gp78-mediert erad virkningsgrad gir opphav til overfølsomhet reaksjon på akutt ER stress følgende aldring, som fører til kronisk ER stress der misfoldede proteiner er vedvarende og indusere Chop-mediert apoptose, SREBP-mediert lipogenese, til slutt fører til betennelse, NASH, og kreft.
Gp78 spiller rollen som en tumor suppressor i leverkreft
NAFLD, spesielt aggressive stadium av alkoholisk steatohepatitis (NASH) er assosiert med økt risiko for leverkreft og retrospektive data tyder på at ca 27% av tilfellene av NASH forvandle til HCC etter at utviklingen av skrumplever, et sent stadium av arrdannelse (fibrose) [27]. Interessant, observerte vi at den samlede, ved 20% (6/25 mus) av gp78-KO mus utviklet leversvulster, mens alle WT mus som ble undersøkt var kreft ledig på den tid linjen undersøkes (figur 4A.). H E-analyse viste at disse eldre mus hadde dysplastiske foci (fig 4B og S3 fig.), Men vi fikk ikke observere svulster i andre organer, noe som tyder primær svulst i leveren. Deretter undersøkte vi fibrose i leveren som bærer tumorer, som cirrhose er en forutsetning for leverkreft og funnet alvorlig fibrose (2/6 mus) i en annen leverlapp fjernt fra tumor-regionen (Fig. 4C). For å undersøke opprinnelsen til kreftsvulster, utførte vi immunhistokjemisk (IHC) analyse på seriesnitt ved hjelp av et antistoff mot ki-67, en prolifererende markør og glypican-3, en diagnostisk markør for human HCC (fig. 4D). Den etiologiske koblingen mellom Wnt signalering og leveren ble opprinnelig etablert gjennom den demonstrasjon at p-catenin aktiverende mutasjoner forekommer i 20% til 40% av human leverkreft (HCC) [28]. Tar et hint fra tidligere funn om menneskelig HCC, undersøkte vi om aktivering av β-catenin var involvert i gp78-KO kreft, noe som resulterer i overlappende farget regioner med ki-67 i heterogene svulstvev (fig. 4D). Ettersom gp78 synes å være en tumor suppressor i tidlig tumorigenesis hos eldre mus, kan det betraktes som en progresjon markør og /eller potensielt mål i human HCC. Således, ved hjelp av en vev matrise, som inneholdt normale vev og hepatocellulært karsinom vi undersøkte ekspresjonen av gp78 i human HCC i henhold til den kliniske grad av tumorer. Vi har funnet at ekspresjonen av gp78 HCC var betydelig lavere enn den normale levervev (fig. 4E). Analysen i menneskelige HCC prøvene tyder etiological knytte gp78 tap for HCC og antatte svulst undertrykkelse selv om de nøyaktige molekylære mekanismene bak utviklingen av NASH til kreft er ennå ikke bestemt i gp78-KO mus.
Diskusjoner
i denne studien, vurderte vi nøkkelen antatte suppressor genet er ansvarlig for NASH og leverkreft (HCC) som oppsummert i fig. 4F. For første gang gir gp78-KO mus modell en kobling av erad mangel på spontan NASH og HCC progresjon, siden fenotype av gp78-KO mus ligne steatose, steatohepatitis, skrumplever og leverkreft av menneskelig lever patogenesen. NASH er en metabolsk sykdom forårsaket av lever lipogenese og levering av lav-tetthets lipoprotein (LDL), så vel som strømmen av frie fettsyrer (FFA) som kommer fra tarm adipocytt og vev [2]. Det er ikke avklart hvordan gp78 tap i tarmen og gp78-KO fedme påvirker NASH, selv om vi viste at kronisk ER stress og SREBP-mediert
de novo
lipogenese i leveren er ansvarlig for NASH av gp78-KO (Fig . 3E og S1B fig.). Merkbart, denne observasjonen av gp78 null mus motsier forrige rapport som viser at leverspesifikke gp78-KO mus er motstandsdyktig mot normal chow diett og Vest-type diett-indusert fedme på grunn av undertrykt SREBP med opp regulering av dens negative regulatorer, Insig-en /-2 [29]. Selv om det ikke er lett å forene molekylære mekanismer i både mus, mulige forklaringer inkluderer at gp78 knockout i hele mus kan overvinne metabolsk stress observert i leveren spesifikke gp78-KO under embryonale utviklingsstadier og tidlig vekst. Således er det motsatte fenotypen i både mus som kreves for å bli ytterligere bekreftet gjennom undertrykkelse og add-back undersøkelser, innbefattende tverr avl og
in vitro
cellekultur. Samtidig oppstår som gp78-KO avledet NASH i en aldersavhengig måte, kan det forsterkes på grunn av aldersbundet nedgang i uttrykk og aktivitet av sentrale ER molekylære anstand og folding enzymer som kompromiss riktig protein folding og adaptive respons av UPR [30]. Enkelt hepatitt (Fig. 2A, c og S2 figur) ble observert i gp78-KO lever som ikke viser steatose. Dette kan tilveiebringe bevis for den foreslåtte risikoen for erad mangel hvori defekte sekretoriske og transmembrane proteiner er gitt ut eller er eksponert på celleoverflaten for å interferere med celle-celle-kommunikasjon og fremme autoimmunitet ved erkjennelsen av selv-antigen [31].
som gp78 bidrar til tumorprogresjon som rapportert i sarkom metastase ved å målrette KAI1 for degradering [32] og melkekjertlene hyperplasi av MMTV-drevet 78 transgen overekspresjon [33], vil trolig spille en motstridende roller svulst undertrykkelse eller forfremmelse gp78 ifølge vev sammenheng og kreft etapper. Selv gp78 spiller avgjørende roller i leveren homeostase og undertrykker utviklingen av leveren svulst, tumor-fremme eller undertrykke gp78 roller forbli klart i humane lever karsinom etiologisk som følge av ulike årsaker.
In vitro
, cellebaserte studier viste at AMF er et mål ubiquitinmolekyler av gp78 [34] og AMF /PGI beskyttelse mot ER stress er mediert av gp78 /AMFR reseptor [35]. Vi har imidlertid ikke observere støtte bevis i AMF /PGI opp regulering i leveren og MEF celler av gp78-KO i tidligere funn (data ikke vist).
erad er involvert i UPR for ER homeostase ved å eliminere misfoldede proteiner [36], men knockout modell av erad er ikke fastslått med hensyn til NASH og HCC progresjon. Siden Hrd1 /synoviolin av gp78 homolog og gp78-samspill ATPase p97 knockout mus er embryonically dødelig [16,17], link fra erad til NASH og leverkreft kan ikke bli avdekket. Men gp78 er ikke avgjørende for embryoutvikling basert på fødselen og overlevelse av gp78-KO mus. Ironisk nok, gp78-KO mus rømmer trussel og naturlig utvalg i utviklingsstadiet er sannsynlig å generere alder bundet leversykdom. Våre funn er i samsvar med beskyttende rolle gp78 mot ER stress i sebrafisk lever [37].
Forskning fremgang har belyst den positive rollen UPR å overleve i kreft som har risiko for kronisk ER stress på grunn av en rask vekst og fører til dårlig vaskularisering av tumormasse, lav oksygentilførsel, næringsmangel, og pH-endringer [36,38]. De relaterte funn har tatt opp muligheten for målretting UPR komponenter som en effektiv strategi for kreftbehandling og overvinne narkotika motstand. I mellomtiden har det blitt foreslått at inhibering av erad induserer UPR, som effektivt gjenoppretter cellulær homeostase, skiftende dens overlevelse funksjon mot proapoptotiske aspekter av UPR. Tvert imot, våre funn at gp78 fungerer som lever bestemt tumor suppressor, åpnes et uutforsket forskning vindu for å studere en etiologisk kobling av erad for sykdomsforebygging og bedre resultater i humane pasienter;
