Abstract
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) og vaskulær endotelial vekstfaktor-reseptor 2 (VEGFR2) har dukket opp som to effektive kliniske mål for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). I denne studien fant vi at delphinidin, en anthocyanidin, til stede i pigmenterte frukt og grønnsaker, er en potent hemmer av både EGFR og VEGFR2 hos NSCLC celler som overuttrykker EGFR /VEGFR2. Ved hjelp av disse cellene, vi Deretter ble virkningene av delphinidin på cellevekst og apoptose
in vitro
og på tumorvekst og angiogenese
in vivo
. Delphinidin (5-60 mm) behandling av NSCLC celler hemmet aktivering av PI3K, og fosforylering av AKT og MAPKs. I tillegg er behandling av NSCLC-celler med delphinidin resulterte i inhibering av cellevekst uten å ha signifikante toksiske effekter på normale humane bronkiale epitelceller. Nærmere bestemt, behandling av NCI-H441 og SK-MES-1 celler med delphindin (5-60 pM) førte til (i) spalting av PARP-protein, (ii) aktivering av kaspase-3 og -9, (iii) nedregulering av anti -apoptotic proteiner (BCL2, BCL-XL og MCL-1), (iv) oppregulering av pro-apoptotiske proteiner (Bax og Bak), og (v) redusert uttrykk for PCNA og cyclin D1. Videre er det i atymiske nakne mus subkutant implantert med humane NSCLC-celler, forårsaket delphinidin behandling a (i) signifikant inhibering av tumorveksten, (ii) reduksjon i ekspresjonen av markører for celle-proliferasjon (Ki67 og PCNA) og angiogenese (CD31 og VEGF) og (iii) induksjon av apoptose, sammenlignet med kontrollmus. Basert på disse observasjonene, foreslår vi at delphinidin, alene eller som adjuvans til dagens behandlingsformer, kan brukes for behandling av NSCLC, spesielt de som overuttrykker EGFR og VEGFR2
Citation. Pal HC, Sharma S, Strickland LR, Agarwal J, Athar M, Elmets CA, et al. (2013) delphinidin Reduserer celleproliferasjon og induserer apoptose av ikke-småcellet lungekreft celler ved målretting EGFR /VEGFR2 signalveier. PLoS ONE 8 (10): e77270. doi: 10,1371 /journal.pone.0077270
Redaktør: Xianglin Shi, University of Kentucky, USA
mottatt: 03.08.2013; Akseptert: 9. september 2013, Publisert: 04.10.2013
Copyright: © 2013 Pal et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant AT004966 og National Cancer Institute CA13148-39 UAB Comprehensive Cancer Center Junior fakultet Development Grant Program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er et stort helseproblem i USA står for ca 28% av alle kreftrelaterte dødsfall. Videre totalt 228,190 nye krefttilfeller og 159,480 dødsfall av lungekreft har blitt anslått til å skje i USA i 2013 [1]. De to hovedformer av lungekreft er små-celle lungecancer (SCLC) og ikke-små-celle lungekreft (NSCLC), som utgjør henholdsvis ca. 15 og 85% av alle tilfeller. Lungekreft har vist seg vanskelig å kontrollere med konvensjonelle terapeutiske og kirurgiske metoder som fører til dårlig prognose. Indikerer dette dårlig prognose, er den samlede fem års overlevelse bare 15% for NSCLC [2,3]. Åpenbart er etterforskning av alternative behandlingstilbud for NSCLC garantert og vil forhåpentligvis føre til lindring av denne store byrden av dødelighet.
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR /HER1 /ErbB1) er en type en transmembrane reseptor tyrosin kinase (RTK) av ErbB-familien. Det er sammensatt av et ekstracellulært-bindende domene og et intracellulært domene inneholdende tyrosin-kinase-aktivitet [4]. Det er godt etablert at EGFR er overuttrykt i ca. 95% av alle faste tumorer [5,6]. Videre er det kjent for å være en kritisk onkogen driver som oppstår i over 60% av tilfellene NSCLC [7] og ca. 30% av bryst-kreft [8]. I tillegg har vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 2 (VEGFR2) blitt rapportert å være overuttrykt i mange tumorer inkludert lungekreft [9]. Videre er overekspresjon av både EGFR og VEGFR2 forbundet med chemoresistance og er korrelert med en dårlig prognose [10,11]. Avvikende aktivering av EGFR og VEGFR2 utløser fosforylering av et mangfold av proteiner, inkludert PI3K /AKT og MAPK veier som er involvert i celleoverlevelse, apoptose og angiogenese [12,13]. På grunn av potensiell crosstalk og en veletablert rolle i tumorvekst og angiogenese, hemming av både EGFR og VEGFR2 signale kan forbedre det kliniske utfallet av avansert NSCLC pasienter. Ulike tilnærminger har blitt vedtatt å samtidig blokkere EGFR og VEGFR2 signalering. Kombinasjoner av to spesifikke hemmere og enkle midler som er rettet mot disse reseptorene er brukt; men deres bruk hos pasienter møtt med uakseptable toksisitet.
Det er et presserende behov for å utvikle multi-målrettet terapeutisk naturlig middel som blokkerer RTK aktiviteter og nedstrøms signalisering av både EGFR og VEGFR2 å bedre terapeutisk effekt og minimere giftighet for normal vertsceller. Et slikt middel er delphinidin, et kosttilskudd anthocyanidin kjent for å være rikelig tilstede i mange pigmenterte frukt (granatepler, bær og mørke druer) og grønnsaker (auberginer, tomater, gulrøtter og rødløk) [14]. Det har anti-oxidant [15], anti-inflammatorisk [16,17], anti-proliferative [18] og anti-kreft-aktivitet [19]. I tillegg har delphinidin blitt vist å inhibere EGFR signalveien, så vel som invasjon av brystkreftceller [20]. Imidlertid er de fleste av anti-kreft og anti-angiogene aktiviteter rapportert i litteraturen basert på
in vitro
studier. Målet med denne studien var å fastslå effekten av delphinidin på cellevekst og apoptose
in vitro Hotell og på tumorvekst og angiogenese
in vivo
i NSCLC celler. Våre resultater viste at delphinidin er en potent inhibitor av både EGFR og VEGFR2 i NSCLC-celler. I tillegg delphindin inhiberte aktiveringen av PI3K, og fosforylering av AKT og MAPK. Dette resulterte i hemming av cellevekst og induksjon av apoptose i NSCLC-celler. Videre delphindin behandling hemmet veksten av NSCLC-xenotransplantater i nakne mus som var forbundet med en reduksjon i ekspresjonen av markører for celleproliferasjon og angiogenese, så vel som en induksjon av apoptose.
Materialer og Metoder
Materialer
delphinidin ( 98% ren) ble kjøpt fra Extrasynthase (Lyon, Frankrike). De monoklonale og polyklonale antistoffer for EGFR og fosfo-EGFR, VEGFR2 og fosfor-VEGFR2, ERK1 /2 (fosfor-P44 /42, Thr
202 /Tyr
204), JNK1 /2 (fosfo-P54 /46 , Thr
183 /Tyr
185), p38 (fosfor-p38, Thr
180 /Tyr
204), PI3K, phopho AKT, BCL2, BCL-XL, Mcl-en, Bax, Bak, cyklin D1, PARP, caspase-3 og -9 ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Polyklonale antistoffer for VEGF, PCNA og Ki67 ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, California). Anti-muse-CD31-antistoff ble oppnådd fra BD Biosciences (San Jose, CA). Anti-mus eller anti-kanin sekundært pepperrot-peroksidase-konjugat ble oppnådd fra Millipore Corporation (Billerica, Massachusetts).
Behandling av celler
human NSCLC-celler NCI-H441, SK-MES-1, og A549 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). NCI-H441-celler ble dyrket i RPMI1640 medium (HyClone Laboratories Inc., Logan, UT), SK-MES-1 celler ble dyrket i EMEM-medium (HyClone Laboratories Inc., Logan, UT), og A549-celler ble dyrket i Hams F -12K medium (Mediatech Inc, Manassas, VA) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum og 100 mg /ml penicillin-streptomycin. Normal menneskelig bronkial epitel (NHBE) celler ble hentet fra Clonetics Airways epitelcelledifferensiering Systems (Cambrex Bio Science, Walkers Inc., MD) og dyrket i Bronchial epithelial Vekst Media supplert med vekstfaktorer (Cambrex Bio Science, Walkers Inc., MD). Cellene ble holdt under standard cellekulturbetingelser ved 37 ° C og 5% CO
2 i et fuktig miljø. Delphinidin (oppløst i DMSO) ble benyttet for behandling av cellene. Sluttkonsentrasjonen av DMSO som ble anvendt var 0,1% (v /v) for hver behandling. For doseavhengig studier NCL-H441 og SK-MES-1 celler ble behandlet med delphinidin (5-60 mm) for 3 og 48 timer i fullstendig celle medium. Kontrollceller ble behandlet med bærer alene. I ytterligere forsøk, serumsultede NCL-H441 og SK-MES-1-cellene ble behandlet med delphinidin (5-60 uM) i 3 timer og deretter inkubert uten eller med EGF (50 ng /ml; 15 min) eller uten og med VEGF (20 ng /ml; 30 minutter).
Fremstilling av cellelysatene
Når cellen behandling med delphinidin, ble mediet aspirert og cellene ble vasket med PBS (10 mmol /l, pH- 7,45). Cellene ble deretter inkubert i en iskald lyseringsbuffer (10 mM HEPES (pH 7,9), 100 mM KCI, 10 mM EDTA, 20 mM EGTA, 100 mM DTT, 20 mM PMSF, 0,5% NP-40 med ferskt tilsatt proteasehemmere leupeptin, aprotinin og benzamidin) i 20 min. Cellene ble høstet og lysatet ble oppsamlet i et mikrosentrifugerør og ført gjennom en 21,5-G nål for å bryte opp celle-aggregater. Lysatet ble fjernet ved sentrifugering ved 14,000g i 10 min ved 4 ° C, og supernatanten (totalt cellelysat) oppsamlet, alikvotert og deretter brukes samme dag for fremstilling eller umiddelbart lagret ved -80 ° C for bruk på et senere tidspunkt .
Western blot analyse
for western blotting, ble 30-50 mikrogram protein løses over 8-12% Tris-glysin gels og overført til en nitrocellulosemembran. Kort fortalt ble membranen blokkert og undersøkt med riktig primær og sekundær antistoff HRP-konjugat fulgt av chemiluminescence og autoradiografi som beskrevet tidligere [20].
Celleviabilitet analysen
Effekten av delphinidin på celle levedyktighet ble bestemt ved å 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) assay. Celler (NHBE, NCI-H441, A549 og SK-MES-1) ble sådd ut i en 96-brønners mikrotiterplate og behandlet med 5-100 pM konsentrasjoner av delphinidin i 48 timer. 1/10 volum av 10xMTT oppløsning (5 mg /ml i PBS) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 2 timer, og absorbans ble registrert på en mikroplateavleser ved 540 nm etter oppløseliggjøring reduseres MTT med DMSO. Effekten av delphinidin på veksthemming ble vurdert som prosent celleviabilitet hvor DMSO-behandlede celler ble tatt som 100% levedyktig.
Behandling av atymiske nakne mus
Fire-fem uker gammel kvinnelig atymiske ( nu /nu) nakne mus ble kjøpt fra NCI-Frederick National Laboratory for kreftforskning og holdt under patogen-frie forhold med en 12 timer lys /12 timer mørke planlegge i Animal Resource Facility ved University of Alabama i Birmingham i samsvar med institusjonelle Animal Care og bruk komité retningslinjer. Dyret protokoll som brukes i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Alabama i Birmingham, og dyret protokollnummeret er 120609365. Dyrene ble fôret med fytokjemisk diett AIN-76 SEMI PD (Test Diet, Richmond, Indiana)
ad libitum
. Musene ble injisert subkutant med et fast antall av NCI-H441-celler (4×10
6 i 50 ul RPMI + 50 ul matrigel) på hver flanke for å initiere tumorvekst. Dyrene ble deretter tilfeldig delt i tre grupper med 6 dyr i hver gruppe. Den første gruppe av dyr fikk en i.p. injeksjon av DMSO (100 ul) og tjente som en kontroll. Dyrene i gruppe 2 og 3 fikk en i.p. injeksjon av delphinidin (1 mg /dyr og 2 mg /dyr henholdsvis) i 100 ul DMSO tre ganger /uke. Tumor størrelser ble målt to ganger i uken, og tumor volum ble beregnet ved formelen ½ (
L
1 ×
L
2 ×
H
) , hvor
L
en er den lange diameter,
L
2 er den korte diameter, og H er høyden av tumoren. Alle dyr ble avlivet ved CO
2 innånding og død ble bekreftet ved cervikal forvridning når tumorene nådde et volum på omtrent 1200 mm
3 i kontrollgruppen. Tilsvarende forsøk ble deretter utført med SK-MES-1 celler. Alle prosedyrer gjennomført var i samsvar med retningslinjer for bruk og stell av forsøksdyr og godkjennes av IACUC.
Immunohistochemistry og immunfluorescens farging
Fem mikrometer seksjoner ble kuttet, deparaffinized i xylen, rehydrert i etanol, og vasket i fosfat-bufret saltløsning. For antigen gjenfinning ble snittene oppvarmet ved 95 ° C i 30 minutter i citrat-buffer (pH 6,0). I korthet delene ble deretter inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med en spesifikk pepperrot peroksidase-merket sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble seksjonene inkubert med diaminobenzidene peroksydasesubstrat løsning i 2 minutter og motfarget med Mayer Hematoxylin-løsning. For immunfluorescens farging etter antigen gjenfinning ble snittene inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med Alexafluor-488-merket sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Objektglassene ble montert med Vectashield monterings medier som inneholder DAPI og ble analysert i henhold til fluorescens mikroskop.
Statistisk analyse
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse av alle data ble utført ved t-test.
p
verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
delphinidin behandling hemmer konstituerende og EGF-indusert fosforylering av EGFR i NCL-H441 celler
.
Aberrant aktivering og overekspresjon av EGFR fører til feilregulering av signalveier avgjørende for celledeling, overlevelse, kreft progresjon, angiogenese og metastatis [21]. EGFR overekspresjon NCI-H441-celler ble behandlet med delphinidin (5-60 uM, 3 timer) for å bestemme dens virkning på EGFR-ekspresjon. Som vist i figur 1A, delphinidin behandling signifikant redusert ekspresjon og fosforylering av EGFR i NCI-H441-celler. I tillegg har overekspresjon av dens ligand EGF, som aktiverer EGFR, spiller en viktig rolle i tumorgenese av NSCLC [22]. Vi har fastslått derfor effekten av delphinidin på EGF-indusert fosforylering av EGFR og fant at dens behandling signifikant inhiberte EGF-indusert aktivering og fosforylering av EGFR (figur 1A). En tilsvarende effekt av delphinidin på fosforyleringen av EGFR ble også observert i SK-MES-1-celler (data ikke vist). Dette viser at delphinidin behandling reduserer både konstituerende og EGF-indusert fosforylering av EGFR.
[A] NCL-H441-celler ble behandlet med delphinidin (5-60 mm) for 3 timer i fullstendig celle medium (venstre panel) . I panelet til høyre, ble serum sultet NCL-H441 celler behandlet med delphinidin (5-60 mm) for 3 timer og deretter inkubert uten eller med EGF (50 ng /ml) i 15 min. Etter behandling ble cellene høstet og cellelysatene ble fremstilt og uttrykket EGFR og fosforylert-EGFR ble bestemt. [B] NCL-H441-celler ble behandlet med delphinidin (5-60 mm) for 3 timer i fullstendig celle medium (venstre panel). I panelet til høyre, ble serum sultet NCL-H441 celler behandlet med delphinidin (5-60 mm) for 3 timer og deretter inkubert uten eller med VEGF (20 ng /ml) i 30 min. Etter behandling ble cellene høstet og cellelysatene ble utarbeidet og uttrykket VEGFR2 og fosforylert VEGFR2 ble bestemt. Lik belastning av protein ble bekreftet ved stripping immunoblot og reprobing det for β-aktin. De immunoblotter vises her er fra et representativt eksperiment gjentatt tre ganger med samme resultat.
delphinidin behandling hemmer konstituerende og VEGF-indusert fosforylering av VEGFR2 i NCL-H441 celler
I likhet med EGFR, overekspresjon og avvikende aktivering av VEGFR2 har også blitt rapportert i flere kreftceller, inkludert NSCLC [23]. Som EGFR, gjennomgår VEGFR2 dimerization og VEGFR ligand-avhengig fosforylering og aktivering resulterer i feilregulering av nedstrøms signalering. Dette utløser så mitogene, kjemotaktiske, og pro-overlevelsessignaler, sammen med stimulering av tumordannelse fartøyet [24]. Derfor evaluerte vi også effekten av delphinidin (5-60 uM, 3 timer) med ekspresjon av VEGFR2 i NCH-H441-celler, og funnet ut at dens behandling betydelig redusert ekspresjon av VEGFR2 i NCI-H441-celler (figur 1B). I tillegg delphinidin behandling hemmet VEGF- indusert aktivering og fosforylering av VEGFR2 (figur 1B). En tilsvarende effekt av delphinidin på fosforyleringen av VEGFR2 ble også observert i SK-MES-1-celler (data ikke vist). Disse resultatene viser tydelig at delphinidin behandling hemmer konstituerende og VEGF-indusert fosforylering av VEGFR2.
delphinidin behandling hemmer protein uttrykk for PI3K og fosforylering av AKT og MAPKs i NCL-H441 og SK-MES-1 celler
Motstand mot EGFR-hemmere er forbundet med aktivering av PI3K /AKT og MAPK signalveier [25]. EGFR /PI3K /AKT /MAPK-signalering spiller en sentral rolle i tumorgenese, forsterket celleproliferasjon, angiogenese og inhibering av apoptose i forskjellige humane kreftformer, inkludert NSCLC [21,26]. Når PI3K /AKT signale aktiveres av EGFR, phosphorylates det flere nedstrøms mål er involvert i viktige cellulære prosesser, inkludert celleproliferasjon og apoptose. Behandling av delphinidin (5-60 mikrometer, 48 timer) resulterte i redusert uttrykk av P85 (et regulatorisk subenhet) og p110α (en katalytisk subenhet) av PI3K i NCI-H441 og SK-MES-1 celler (Figur 2A). PI3K regulerer fosforylering og aktivering av AKT, som fremmer celleoverlevelse ved blokkering av funksjonene til pro-apoptotiske proteiner og fremme induksjon av celleoverlevelse proteiner [27]. Som en konsekvens av PI3K inhibering av delphinidin, ble AKT-fosforylering betydelig redusert både i NCI-H441 og SK-MES-1-celler (figur 2A).
[A] NCI-H441 og SK-MES-1 celler ble behandlet med 5-60 uM delphindin i 48 timer for å bestemme dens virkning på protein ekspresjon av PI3K, fosforylering av AKT og MAPK. Etter behandling ble cellene høstet, ble cellelysater fremstilt, og protein ble underkastet SDS-PAGE etterfulgt av immunblotanalyse og kjemiluminescens deteksjon. Lik belastning av protein ble bekreftet ved stripping immunoblot og reprobing det for β-aktin. De immunoblotter vises her er fra et representativt eksperiment gjentatt tre ganger med samme resultat. [B] celleviabilitet av A549, NCI-H441, SK-MES-1 og NHBE-celler behandlet med 5-100 uM av delphinidin i 48 timer, ble bestemt ved MTT-analyse som beskrevet i «Materialer og metoder». Dataene som vises, er gjennomsnitt ± SEM fra tre separate forsøk hvor hver behandling ble gjentatt i 10 brønner. [C] NCI-H441 og SK-MES-1-cellene ble behandlet med 5-60 uM delphindin i 48 timer for å bestemme dens virkning på protein ekspresjon av PCNA og cyclinD1. Etter behandling ble cellene høstet, ble cellelysater fremstilt, og protein ble underkastet SDS-PAGE etterfulgt av immunblotanalyse og kjemiluminescens deteksjon. Lik belastning av protein ble bekreftet ved stripping immunoblot og reprobing det for β-aktin. De immunoblotter vises her er fra et representativt eksperiment gjentatt tre ganger med samme resultat.
MAPKs veien er en annen signalkaskade som aktiveres av EGFR og spiller en viktig rolle i reguleringen av mange cellulære responser inkludert celleproliferasjon og apoptose [28]. Den MAPK familien består av tre viktige undergrupper: ERK (ekstracellulære signalregulerte protein kinase), JNK (c-Jun N-terminal kinase) og p38 MAPK [29]. ERK er hovedsakelig involvert i reguleringen av mitogenaktiverte spredning /differensieringsfaktorer, mens JNK og p38 MAPK utføre funksjoner knyttet til apoptotisk celledød [30]. Derfor vurderte vi også effekten av delphinidin på MAPKs signalanlegg i NSCLC celler. Vi fant at delphinidin behandling signifikant redusert fosforylering av ERK1 /2, JNK1 /2 og p38 både i NCI-H441 og SK-MES-1-celler (figur 2A).
delphinidin behandling hemmer veksten av NSCLC-celler
Siden overekspresjon og avvikende aktivering av EGFR og nedstrøms signalveier hemmes av delphinidin, vi neste undersøkt dens effekt på cellulær proliferasjon av NSCLC-celler ved anvendelse av et MTT-assay. NSCLC A549, NCI-H441 og SK-MES-1 celler som overuttrykker EGFR og VEGFR2 ble behandlet med delphinidin (5-100 mikrometer, 48 timer). Resultater av MTT-analysen viste at delphinidin var effektiv på betydelig hemme cellevekst av A549 (4-70%; p 0,05 til 0,01), NCI-H441 (6-59%; p 0,05 til 0,01) og SK-mel- 1 celler (9-73%; p 0,05 til 0,01) (figur 2B). IC
50 verdier av delphinidin ble anslått til å være 55, 58 og 44 mikrometer for A549, henholdsvis NCI-H441 og SK-MES-1 celler. Vi undersøkte også effekten av delphinidin på veksten av normale humane bronkiale epitel (NHBE) celler under lignende betingelser, og funnet at disse dosene har bare marginal effekt på vekst av disse celler (figur 2B).
delphinidin behandling inhiberer protein ekspresjon av cyclin D1 og PCNA i NCL-H441 og SK-MES-1 celler
de signalbaner som er involvert i aktiveringen av MAPK aktiverer også flere kjerneproteiner, som spiller en avgjørende rolle i cellesyklusprogresjon fra G1 til S-fasen. Nærmere bestemt har cyklin D1 blitt identifisert som en nøkkel nedstrøms effektor av EGFR-signalisering i resistente NSCLC-celler. Videre EGFR muterte NSCLC celler har høyere uttrykk for cyclin D1 [31]. Behandling av NCI-H441 og SK-MES-1 NSCLC-celler med delphinidin (5-60 pM; 48 timer) resulterte i en signifikant reduksjon av cyclin D1 protein ekspresjon i en doseavhengig måte (figur 2C). PCNA er en kjent markør av cellulær proliferasjon aktiv i løpet av S- og G2 fasene av cellesyklusen, og spiller en viktig rolle i initieringen av celleproliferasjon [32]. Den økte ekspresjon av PCNA hos kreftpasienter er blitt assosiert med en dårlig overlevelse. I tillegg EGFR fungerer også som en transkripsjonsfaktor og forbedrer celleproliferasjon ved å aktivere og stabilisere PCNA [33]. Vi undersøkte derfor effekten av delphindin på PCNA uttrykk og funnet ut at det betydelig redusert PCNA protein uttrykk i både NCI-H441 og SK-MES-1 celler (figur 2C).
delphinidin behandling modulerer BCL2 familien protein uttrykk , og induserer spaltning av kaspaser og PARP i NCL-H441 og SK-MES-1-celler
Aktivering av PI3K /AKT og MAPK signalering av EGFR resulterer i økt celleproliferasjon og angiogenese, så vel som inhibering av apoptose. Behandling av EGFR overuttrykke NSCLC-celler med delphinidin resulterte i en signifikant inhibering av PI3K /AKT og MAPK signalveier. Vi neste undersøkte effekten av delphinidin på BCL2 familie proteiner nedstrøms PI3K /AKT. Behandling av NCI-H441 og SK-MES-1 celler med delphinidin sterkt redusert ekspresjon av anti-apoptotiske proteiner som BCL2, Bcl-xL og Mcl-1 (figur 3A). I tillegg fant vi at uttrykket av pro-apoptotiske proteiner Bak og Bax ble betydelig økt i delphinidin behandlet NCI-H441 og SK-MES-1 celler (figur 3A). Apoptose er en svært regulert prosess som involverer en kaskade av hendelser, inkludert proteolytisk aktivering av kaspaser. Innenfor apoptotiske prosessen caspases kan fungere enten som initiativtakerne eller bødler. Bøddel caspases aktiveres fra deres pro-enzymatisk skjema ved påvirkning av andre caspases innenfor en kaskade-reaksjon. Når aktivert, caspaser spalte en rekke intracellulære proteiner, så som PARP og forskjellige proteinkinaser [34]. Derfor neste undersøkte vi om delphinidin behandling (5-60 mikrometer, 48 timer) forårsaket aktivering av caspases eller spalting av PARP, som begge er kjennetegnene ved apoptose. Vi fant at delphinidin behandlingen resulterte i aktiveringen av caspase-9, caspase-3, og den derav følgende spaltning av PARP i både NCI-H441 og SK-MES-1cells (figur 3B)
[A B] NCI-H441 og SK-MES-1-cellene ble behandlet med 5-60 uM delphindin i 48 timer for å bestemme dens virkning på ekspresjon av BCL2 familie proteiner og spalting av kaspaser og PARP. Etter behandling ble cellene høstet, ble cellelysater fremstilt, og protein ble underkastet SDS-PAGE etterfulgt av immunblotanalyse og kjemiluminescens deteksjon. Lik belastning av protein ble bekreftet ved stripping immunoblot og reprobing det for β-aktin. De immunoblotter vises her er fra et representativt eksperiment gjentatt tre ganger med samme resultat.
delphinidin behandling hemmer tumorigenicity av humane NSCLC celler implantert i atymiske hårløse mus
Siden delphinidin effektivt redusert cellevekst og indusert apoptose av NSCLC celler
in vitro
, vi neste fastsatte virkningene av delphinidin på en
in vivo
xenograft mus modell implantert med NCI-H441 eller SK-MES-1cells. I atymiske nakne mus implantert med EGFR og VEGFR2 overekspresjon NSCLC-celler, delphinidin behandlingen resulterte i signifikant inhibering av tumorvekst. Delphinidin behandlede mus implantert med NCI-H441-celler viste sterk tumorvekstinhibering (p 0,05 til 0,001) ved 27,92 og 45,37% ved en dose på 1 og 2 mg /dyr henholdsvis sammenlignet med den ubehandlede kontrollgruppen (figur 4A). Den gjennomsnittlige tumorvolum til kontrollgruppen var 1268.62 mm
3, mens det i de delphindin behandlede grupper de gjennomsnittlige tumorvolum var 914.38 mm
3 og 693.01 mm
3 i mus som mottok 1 og 2 mg /dyr delphinidin henholdsvis (figur 4A). I tillegg delphinidin behandling resulterte også i signifikant tumorvekst-inhibering i atymiske nakne mus implantert med SK-MES-1 celler. Behandling av delphinidin (1 og 2 mg /dyr) resulterte i 26,34 og 46,01% tumorvekst-inhibering sammenlignet med kontrollmus. Disse funnene var statistisk signifikant (p 0,05 til 0,001). Gjennomsnittlig tumorvolum i delphinidin behandlede gruppene var signifikant redusert (913,42 mm
3 og 671.18 mm
3) sammenlignet med den ubehandlede kontrollgruppe (1241.18 mm
3) (figur 4B).
[A] Atten atymiske (
nu /nu
) kvinnelige nakne mus ble subkutant injisert med 4×10
6 NCI-H441 celler (i 50 ul RPMI + 50 ul Matrigel) i hver flanke av musen til å sette i gang tumorvekst og deretter tilfeldig delt inn i tre grupper (seks mus i hver). Tjuefire timer etter celle implantasjon, mus i den første gruppe fikk i.p. injeksjon av DMSO (100 ul) og tjente som kontroll. Musene i gruppe 2 og 3 fikk i.p. injeksjon av delphinidin 1 mg /dyr og 2 mg /dyr henholdsvis i 100 ul DMSO tre ganger /uke. [B] Lignende eksperimenter ble utført med SK-MES-1 celler. Når tumorer begynte å vokse, ble deres størrelser målt og tumorvolum ble beregnet ved formelen ½ (
L
1 x
L
2 x
H
), hvor
L
en er den lange diameter,
L
2 er den korte diameter, og
H
er høyden av tumoren . Alle dyrene ble avlivet når tumorene nådde et volum på 1200 mm
3 i kontrollgruppen. Gjennomsnittlige tumorvolumer for kontroll og delphindin-behandlede grupper ble nedtegnet i løpet av dager etter tumorcelle-inokulering. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM. * P 0,05, ** p 0,01, og *** p. 0,001 versus kontrollgruppen
delphinidin behandling hemmer markører for spredning og induserer apoptose i svulster i atymiske nakne mus implantert med NSCLC celler
Deretter undersøkte vi uttrykket av molekyler assosiert med celleproliferasjon og apoptose i tumorxenotransplantater ved å bruke immunhistokjemi. Som vist i figur 5, Resultatene av histokjemisk analyse av tumorsnitt viste at det var en signifikant reduksjon i antallet og intensiteten av celleproliferasjon markører som Ki67 og PCNA i delphinidin behandlede tumorer sammenlignet med deres respektive ubehandlede kontrollgrupper. I tillegg, når disse tumorene ble evaluert for farging av aktiv caspase-3, et kjennetegn på apoptose, har vi funnet at det var en signifikant økning i antallet og intensiteten av aktiv caspase-3 farging i svulster delphinidin behandlede mus (figur 5A og 5B).
atymiske nakne mus ble implantert med [A] NCI-H441, og [B] SK-MES-1 celler. Mus ble behandlet med delphinidin, ble tumorvev samlet opp i 10% formalin og blokkene ble fremstilt i parafin og immunofarging av Ki67, PCNA og spaltet caspase-3, ble utført som beskrevet i «Materialer og metoder». Photomicrographs viser representative bilder fra tre uavhengige tumorprøver. Bar = 20 mikrometer.
delphinidin behandling hemmer markører for angiogenese i svulster i atymiske nakne mus implantert med NSCLC celler
Solide svulster rekruttere nye blodårer til vekst, vedlikehold og metastasering. Derfor er anvendelse av midler som hemmer tumor-indusert utvikling av nye blodkar ansett som en viktig strategi for behandling av kreft. Derfor målrette mange aktuelle kliniske behandlings vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og CD31. Tumorsnitt farget med anti-VEGF og anti-CD31-antistoffer, viste redusert intensitet av farging i de delphinidin behandlede grupper. Denne studien viste tydelig at delphinidin behandling signifikant redusert ekspresjon av VEGF og CD31 sammenlignet med tumor deler av kontrollmus (Figur 6A og 6B).
Athymiske nakne mus implantert med [A] NCI-H441, og [ ,,,0],B] SK-MES-1 celler. Mus ble behandlet med delphinidin, ble tumorvev samlet opp i 10% formalin og blokkene ble fremstilt i parafin og immunfluorescens av CD31 og immunhistokjemi av VEGF ble utført som beskrevet i «Materialer og metoder». Photomicrographs viser representative bilder fra tre uavhengige tumorprøver. Bar = 20 mikrometer
Diskusjoner
Det har vært store fremskritt i å rakne mysterier kreft genetikk og biologi.; Men den viktigste oppgaven er å oversette disse funnene til nye behandlingsformer som vil forbedre pasientens utfall. Målrettet behandling er fremtiden for kreftbehandling og utvikling av nye terapeutiske hemmere av signaltransduksjon molekyler, spesielt RTK, er fokus for omfattende forskning. Overekspresjon og avvikende aktivering av RTK som EGFR og VEGFR2 er assosiert med høyere sprednings priser, redusert apoptose, økt angiogenese og metastasering [35]. De presenterer dermed et attraktivt mål for legemiddelutvikling mot NSCLC [36,37].
