Abstract
Bakgrunn
Survivin er uttrykt i prostatakreft (PCA), og dens downregulation sensitizes PCA celler til kjemoterapeutika
in vitro Hotell og
in vivo
. Små membranbundne vesikler kalt exosomes, utskilt fra endosomal membranrommet, inneholder RNA og protein som de lett transportere via exosome intern til mottakercellene. Nyere fremgang har vist at tumor avledet exosomes spille flere roller i tumorvekst og metastasering og kan produsere disse funksjonene via immun flukt, tumorinvasjon og angiogenese. Videre kan exosome analyse gi nye biomarkører for å diagnostisere eller overvåke PCa behandling.
Metoder
Exosomes ble renset fra plasma og serum fra 39 PCA pasienter, 20 BPH pasienter, 8 prostatakreft tilbakevendende og 16 friske kontroller ved hjelp av ultrasentrifugering og deres mengder og kvaliteter ble kvantifisert og visualisert fra både plasma og de rensede exosomes ved hjelp av ELISA og Western blotting, henholdsvis.
Resultater
survivin ble betydelig økt i svulsten avledede prøvene, sammenlignet med de fra BPH og kontroller med nesten ingen forskjell i mengden av survivin oppdaget i exosomes samlet fra nydiagnostiserte pasienter utviser lave (seks) eller høy (ni) Gleason score. Exosome Survivin nivåene var også høyere hos pasienter som hadde tilbakefall på kjemoterapi sammenlignet med kontroller.
Konklusjoner
Disse studiene viser at Survivin eksisterer i plasma exosomes fra både normale, BPH og PCA fag. De relative mengder av exosomal Survivin ved PCA plasma var betydelig høyere enn i de med pre-inflammatorisk BPH og kontroll plasma. Denne differensial uttrykk for exosomal Survivin ble sett med både nydiagnostiserte og avanserte PCA personer med høy eller lav grad kreft. Analyse av plasma exosomal Survivin nivåer kan tilby et praktisk verktøy for å diagnostisere eller overvåking PCa og kan, som det er forhøyet i lav samt høy Gleason scoret prøver, brukes for tidlig deteksjon
Citation. Khan S, Jutzy JMS, Valenzuela MMA, Turay D, Aspe JR, Ashok A, et al. (2012) Plasma-avledet Exosomal Survivin, en plausibel biomarkør for tidlig deteksjon av prostatakreft. PLoS ONE 7 (10): e46737. doi: 10,1371 /journal.pone.0046737
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 03.04.2012; Godkjent: 04.09.2012; Publisert: 16 oktober 2012
Copyright: © Khan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært finansiert delvis fra en sjenerøs starte opp fondet til PI (NRW) ved Senter for molekylærbiologi og Gene Therapy som siden har blitt omdøpt til Senter for helseforskjeller og molekylærmedisin og fra Loma Linda University. PI har også bidratt med midler fra hans personlige konto. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Worldwide, prostatakreft (PCA) er den nest hyppigst diagnostisert kreft og den sjette største årsaken til kreftdød i menn [1], [2]. Økende alder, etnisitet og familiens historie er de eneste etablerte risikofaktorer, og det er ingen kjente forebygges risikofaktorer dags dato etablert [2]. Prostatakreft (PCA) er vanligvis saktevoksende kreftformer som er preget av en ubalanse i satsene for celledeling og celledød [3]. Kirurgi og strålebehandling er effektive for lokalisert sykdom, men det er ingen effektiv behandling strategi for residiverende eller metastatisk PCa som har sviktet kirurgi, stråling eller hormonbehandling [4]. En viktig utfordring å utvikle behandlinger som er mer effektiv, avhenger av vår forståelse av den molekylære mekanisme (r) av PCa progresjon, noe som vil føre oss å identifisere mange potensielle terapeutiske målgener og prosesser som er involvert i apoptose, celleproliferasjon, metastase, og vekstfaktor signalering. Total prostataspesifikt antigen (PSA) har revolusjonert PCa screening og har resultert i en generell nedgang i PCa metastaser og død [5]. Dessverre har anvendelsen av PSA screening også ført til over-deteksjon og overbehandling som PSA er verken kreft spesifikk eller en surrogat for den biologiske oppførsel av PCa [5], [6]. Økninger i PSA-nivåene kan reflektere en kreft nærvær, men kan også være tilstede som et resultat av infeksjon, kronisk betennelse eller benign prostatahyperplasi (BPH) [7], [8]. BPH er blitt vist å eksistere i mer enn 70% av menn over 70 år, men anses ikke for å være en forløper for prostatakreft skjønt de ofte eksistere [9]. Det er derfor nødvendig å fortsette å screene for biomarkører som er kreft-spesifikke og som er detekterbare tidlig i sykdomsforløpet.
prosesser av både celleoverlevelse og celledød er involvert regulerte signalveier som er for tiden gjenstand for intens etterforskning. Det er kjent at regulering av apoptose har en sentral rolle i utviklingen av prostatakreft og dens progresjon til en androgen uavhengig tilstand, som skyldes, delvis opp regulering av antiapoptotic gener etter androgen deprivasjon [10] – [12]. Flere linjer av bevis tyder på at en av de viktigste hendelser assosiert med progresjon etter terapisvikt er økt resistens mot apoptose [13], [14], hovedsakelig på grunn av oppregulering av antiapoptotic gener, inkludert Bcl-2, Bcl-X
L, Mcl-1 [15], og survivin [16]. Survivin, en inhibitor-of-apoptose (IAP) protein familiemedlem, er assosiert med PCa utvikling, progresjon, og stoffet motstand [17] – [20]. Nyere bevis indikerer at overekspresjon av Survivin i PCA tumorer er assosiert med dårlig prognose og økt tumorresidiv [21]. I kontrast, har det også vist seg at knockdown av survivin uttrykk ved siRNAs forbedrer kjemosensitivitet av prostata kreft celler, redusere tumorigenitet [22].
Tradisjonelt Survivin har blitt sett på som en cytoplasma eller kjernefysisk protein. Nylig Survivin har også vist seg å eksistere ekstracellulært, som inneholdes i små membranbundne vesikler er kjent som exosomes [23], [24]. Exosomes er tilstede i serum og urin, og inneholder et bredt spekter av proteiner og RNA og representerer deres vev opprinnelses gjør dem en mulig kilde eller basseng av nye PCA biomarkører [25]. I samsvar med survivin tilknytning ugunstige clinicopathological parametre, kan ekstracellulære smugling av Survivin hele svulsten mikromiljøet være ansvarlig for å forsterke den aggressive status av en svulst mens forby eller begrense terapeutiske resultater. Vi har nylig vist at exosome bundet Survivin protein kan bli utskilt av kreftceller og tas opp av omkringliggende celler, produsere et felt effekt som overfører en generell stress-overlevelse fenotype.
Vår studien var designet for å undersøke eksistensen av exosomal survivin i plasma av PCA pasienter med en rekke PCA presentasjoner og sammenligne sine exosomal uttrykk nivåer til de som finnes i kontroll frivillige uten diagnose av kreft og til pasienter med diagnosen benign prostatahyperplasi eller BPH. For de siste 25 årene Gleason gradering systemet har blitt brukt til å vurdere prognosen for menn med prostatakreft. Sammen med andre parametere, og prostatakreft blitt satt opp som et middel for å forutsi prognose og lede terapi [26]. Ekstracellulære Survivin ble funnet sterkt uttrykt i plasma exosomes av PCA pasienter som viser Gleason score på 6 (lav) og 9 (høy), og hos pasienter som hadde tilbakefall på kjemoterapi. Men det var ingen signifikante forskjeller i Survivin nivåer mellom personer med lav eller høy Gleason score. I tillegg, skjønt exosomes innehold Survivin ble funnet i serum fra pasienter med en diagnose av BPH, det totale nivå signifikant lavere enn det som finnes i plasma fra pasienter PCA. Vi tror at i tillegg til diagnostiske markører, prognostiske, prediktive og terapeutiske markører for å fungere som surrogat endepunkter i prognoser sykdommens alvorlighetsgrad, velge behandlinger og overvåking svar til behandling [27] – [30]. Vår demonstrasjon av exosomal Survivin i plasma hos pasienter med nylig diagnostisert lavgradig PCa gir en begrunnelse for studier for å undersøke nytten av exosomal Survivin som en tidlig, lett måles biomarkør for PCa diagnose. Exosomal Survivin kan også tas som en biomarkør for å overvåke behandling av pasienter med avansert PCa.
Resultater
Plasmanivåer av Survivin hos friske kontroller og PCA pasienter
Survivin var påvisbare i plasma fra alle friske kontrollpersoner og PCA pasienter. Måleresultatene fra plasma Survivin i normale friske kontroller og PCA-pasienter er vist i figur 1A. Gjennomsnittlig plasma Survivin nivåene var signifikant forskjellig mellom de friske kontrollpersoner (61,5 pg /ml i kontroller [n = 10]) og forskjellige kreftpasientgrupper (Gleason 6 = 401,7 pg /ml [n = 10], Gleason 9 = 375,2 pg /ml [n = 10], og utsetter resistente til kjemoterapi agenten Taxotere = 410 pg /ml [n = 8]; P 0,05 for hver sammenligning vs. kontroll). Når Survivin nivåene ble sammenlignet mellom de tre gruppene av PCA pasienter i toveis sammenligninger, ingen var signifikant forskjellig fra de andre.
A. Survivin nivåene ble målt i plasma avledet fra Gleason 6 (n = 10), Gleason 9 (n = 10), og Taxotere-resistente individer (n = 8). B. Survivin nivåene ble målt i serum avledet fra BPH (n = 20), og PCa (n = 19). Sammenligninger ble utført under anvendelse av Manova med normale, friske kontroller (henholdsvis n = 10 og 6). (**, P 0,05, ***, p 0,001; statistisk signifikant).
Survivin kan hentes fra serum tatt fra friske kontroller, BPH og PCA Pasienter
som det har blitt målt ovenfor i plasma, survivin var også påvisbar i serum fra pasienter som ikke har noen tidligere diagnose av kreft, så vel som i pasienter med diagnosen av benign prostatahyperplasi (BPH) og de som er diagnostisert med prostatacancer (PCA) (figur 1B). De gjennomsnittlige serum Survivin nivåene var signifikant (P 0,001) høyere i PCA-fagene (150 pg /ml [n = 19]) enn i serum behandlet fra normale kontroller (59,7 pg /ml [n = 6]) og fra BPH pasienter (55 pg /ml [n = 21]).
Plasma og serum survivin i PCA pasienter eksisterer i et exosomal basseng
Vi har tidligere vist at dyrkede PCA celler slipper survivin i det ekstracellulære miljø innen exosomes [23]. Disse små, membran-vesiklene er også kjent å forekomme i plasma, så vel som serum fra cancerpasienter [31], [32]. Exosomes ble derfor oppsamlet ved differensial sentrifugering, og kvantifisert ved hjelp av acetylkolinesterase-enzymatiske analyser som vi og andre har tidligere beskrevet [24], [33]. Gjennomsnittlig plasma exosome nivåene var signifikant forskjellig mellom de friske kontrollpersoner og ulike kreftpasientgrupper (P 0,001), mens signifikante forskjeller i exosome kvantitet ble ikke funnet blant PCA pasient utvalgsgrupper (figur 2A). Dette var også tilfelle når man sammenligner de exosome mengdene som finnes i BPH og PCA prøver som for de friske kontrollpersoner (figur 2B). Interessant er det synes å være en målbar forskjell i Survivin og i exosomes avhengig av kilden som både Survivin og exosome mengdene var høyere når renset fra plasma deretter når renset fra serum.
A. Exosome nivåene ble målt i plasma avledet fra Gleason 6 (n = 10), Gleason 9 (n = 10), og Taxotere-resistente individer (n = 8). B. Exosome nivåene ble målt i serum avledet fra BPH (n = 20), og PCa (n = 19). Sammenligninger ble utført under anvendelse av Manova med normale, friske kontroller (henholdsvis n = 10 og 6). (**, P 0,05, ***, p 0,001; statistisk signifikant).
Plasma-avledet exosomes inneholde Survivin
Exosomes ble preget av immunoblotting for mengden survivin protein og lysosomal-tilknyttede membranprotein 1 (LAMP1). LAMP1 er en kjent exosome protein som vanligvis brukes for å sikre riktig Western blot lasting [24], [34], [35]. Exosomes isolert fra PCa pasient plasma utstilt forbedret Survivin belastninger i forhold til exosomes isolert fra kontroller (figur 3). Western blot analyse viste at lite exosomal Survivin var detekterbar i plasmaprøver samlet fra seks kontroller som ikke har noen tidligere diagnose av kreft i forhold til exosome-spesifikt protein Lamp1 (figur 3A). I kontrast, exosomes isolert fra alle tjue før behandling PCA fagene inneholdt store mengder Survivin protein sammenlignet med LAMP1 protein nivåer (Figur 3B). Interessant nok var det ingen signifikant forskjell i exosomal Survivin innhold mellom pasienter med Gleason 6 PCa og de med Gleason 9 PCa (figur 3C) når normalisert mot Lamp1 (p 0,05).
A. Antistoffer for Survivin og Lamp1 ble anvendt for Western blotting av kontroll pasient-rensede exosomal protein. B. Både Survivin og Lamp1 antistoffer ble detektert i Western blotting av exosomes-avledet fra Gleason 6 og Gleason 9. C. Andel analyse av Survivin tetthet til Lamp1 tetthet ble vist i både Gleason 6, og Gleason 9 med normale friske kontroller (* *, p 0,05, statistisk signifikant) uten betydning registrert mellom Gleason 6 og Gleason 9 plasma-avledet exosomes
Differensial uttrykk for survivin eksisterer i BPH og PCA- avledet exosomes
Som ovenfor, exosomes samlet inn fra BPH og PCA pasient serumer ble preget av immunoblotting for survivin og LAMP1 protein (Figur 4A). Exosomes isolert fra PCA og BPH pasient serumer utstilt forbedret Survivin belastninger i forhold til exosomes isolert fra kontroller (Figur 4A, 4B og Figur S1). Interessant nok, skjønt Survivin ble påvist i de fleste og forhøyet hos visse pasienter med BPH, dens samlede nivået var betydelig mindre enn det som finnes i PCa, og det var ingen signifikant forskjell mellom målte BPH og kontrollere pasientens serum (figur 4B).
EN. Antistoffer for Survivin og Lamp1 ble brukt til Western blotting av pasient-renset exosomal protein. B. Andel analyse av Survivin tetthet til Lamp1 tetthet ble vist i både BPH og PCa med friske kontroller (**, p 0,05, ***, p 0,001; statistisk signifikant) uten betydning registrert mellom normale kontroller og BPH.
PCA pasienter med sykdomsprogresjon uttrykke høye nivåer av exosomal survivin
til slutt, evaluert vi exosomes samlet inn fra PCA pasienter som opplevde sykdomsprogresjon under behandling med kjemoterapi. Som i våre Gleason pasient exosomes, Western blotting viste Survivin proteinnivå (figur 5A) var markert høyere i forhold til kreftfrie kontrollpersoner, som ble bekreftet å være signifikant etter densitometrisk analyse (figur 5B).
En . Survivin og Lamp1 antistoffer ble vist positive. B. Densitometrisk analyse av Survivin /Lamp1 uttrykk i en sunn kontroll (normal) og chemoresistance (CR) tilfeller (**, p 0,05, statistisk signifikant)
Kliniske og patologisk egenskaper
.
Forbehandling data om innledende plasma survivin og PSA nivåer og Gleason score ble kjøpt for pasientene i studien. Disse patologiske egenskaper er beskrevet i tabell 1, 2, 3, 4. I alle, åtte tilfeller av prostatakreft tilbakefall etter konvensjonell behandling, ti tilfeller av Gleason seks, ti tilfeller av Gleason 9, (tabell 1); og ti kontroll tilfeller (tabell 2) ble samlet inn med plasmaer analysert. PSA fra plasma (klinisk rapport) og fra de ultrasentrifuge-renset exosomes viste at selv om proteinkonsentrasjonen ikke var identiske, var likheten i utviklingen av plasma til plasmafremstilte exosome PSA-verdier. Viktigere, Survivin utgjør om betydelig mindre i exosomes var mer konsekvent på tvers av pasientene evaluert, og gitt følsomheten av ELISA, pikogram for Survivin forhold til nanogram for Ptil, er mer nøyaktig.
videre studier ved hjelp av sera i stedet for plasma ble utført på seks kontroller, tjue BPH tilfeller (Tabell 3) og 19 flere PCA tilfeller (tabell 4). Som før, ELISA resultater fra Survivin gitt en mer følsom og stabil kvantifisering enn gjorde ELISA for Ptil. Kvantitering fra sera av BPH pasientene viste et gjennomsnitt på 52,9 pg /ml Survivin og 1,3 ng /ml PSA. Til sammenligning, når de evalueres fra PCA pasienter, Survivin gjennomsnitt 149 pg /ml og PSA i gjennomsnitt 0,3 ng /ml (tabell 3 og 4). BPH tall for både Survivin og PSA er nesten tre ganger lavere enn i PCA pasientsera. Dessverre, kjøpte BPH prøvene kom ikke med de kliniske PSA ELISA mengder som vi har fra PCA tilfeller (Tabell 3).
Korrelasjoner av Survivin med PSA
Av pasientens plasma /serumprøver evaluert for survivin, alle prøver (Gleason 6, Gleason 9, tilbakefall, eller PCA prøver) viste større enn 100 pg /mL survivin (tabell 5). I motsetning til bare 60% av Gleason 6, 80% av Gleason 9 plasmaer og 84% av PCa sera hadde en PSA på mer enn 4 ng /ml. Tilbakevendende pasientens plasma hadde større enn 4 ng /ml. I kontroll plasmaer og BPH sera, ingen prøve hadde en Survivin konsentrasjon som er større enn 100 pg /ml og ingen PSA konsentrasjon er større enn 4 ng /mL (tabell 5).
diskusjon
prostata kreft motstår apoptose med endret uttrykk for både pro- og antiapoptotic proteiner, og dermed omgå interne overvåkingssjekkpunkter, trives i ugunstige microenvironments, og anskaffe en invasiv fenotype [20]. Nylige studier tyder på at inhibering av apoptose, i stedet for forbedret cellulær proliferasjon, er en kritisk egenskap som bidrar til prostata kreftutvikling. Blant de regulatorer av PCa apoptose, interesse nylig har fokusert på Survivin, et multifunksjonelt medlem av inhibitor av apoptose (IAP) genet familie som motvirker celledød og kontrollerer mitotisk progresjon. Selektiv overekspresjon av Survivin har vært assosiert med høyere svulst klasse, avansert sykdom stadium, rask tumorprogresjon, kort pasient overlevelse, og motstand mot behandling hos pasienter med forskjellige maligniteter [17] -. [19]
Survivin eksisterer i et antall subcellulære steder som mitokondriene, cytoplasma og cellekjernen. Nylig har det også blitt funnet i det ekstracellulære rom [23], [24]. Vi har vist at ekstracellulær Survivin eksisterer i multimolecular komplekser som omfatter varmesjokkproteiner [24]. Videre har vi også vist at disse kompleksene ligge i eller på exosomes, og som kreft behandling kan forbedre frigivelse av slike exosomes fra kreftceller [24]. Ekstracellulære Survivin er i stand til å formidle et pro-overlevelse felt effekt gjennom sin utskillelse av kreftceller og opptak av omkringliggende normale og transformerte celler [23]. Kobling ekstracellulære Survivin evne til å forbedre mobilnettet spredning, overlevelse og tumorcelle invasjon med en membran-beskyttende trafficking modalitet gir ekstra støtte for hypotesen om at Survivin spiller en sentral rolle i patobiologi av kreft celle vekst og beskyttelse mot terapeutiske intervensjoner.
Flere tidligere studier har undersøkt plasmanivået av survivin hos kreftpasienter [36], [37]. I voksen T-celle leukemi og supernatantene fra in vitro kulturer av fast-tumorceller, er nivået av Survivin protein var lav i forhold til den cellulære Survivin protein og mRNA-nivåer [37]. Dette funnet førte til den konklusjon at Survivin proteinnivåer i plasma ikke reflekterer cellulære Survivin nivåer. Videre ble Survivin plasmanivået vurderes i forhold til alfa fetoprotein (AFP) hos pasienter med kronisk hepatitt C virusinfeksjon (HCV) med og uten hepatocellulært karsinom (HCC) [36]. Selv om ikke konkludert å være like pålitelig i disse studiene som AFP, ble Survivin nivåer fast bestemt på å være målbare og betydelig hos pasienter med HCV og målbar, men ikke signifikant i de med HCC. Selv om det ikke er helt klart, kan disse resultatene kan forklares ved det funn at HCV-infiserte HCC celler ble mer motstandsdyktig mot celledød og således Survivin slipp sammenlignet med kontroll eller HCV-infiserte celler alene [36].
prostata spesifikt antigen (PSA) analyse er kontroversielt brukt i prostatakreft screening selv om utgangspunktet var det tenkt som et verktøy for å vurdere behandlingsrespons [38]. Dets anvendelse som et screening-verktøy ble drevet av både USA prostatakreft byrde og et behov for å detektere dens tilstedeværelse i en tid som ville tillate for kurativ behandling for å begynne. Dessverre er bruken antas å ha ført til både over diagnose og overbehandling og dermed det presserende behovet for nye biomarkører for å bli funnet å supplere PSA for forvaltning og behandling [39]. Exosomal Survivin målinger kan gi en annen plasma-baserte analysen for tilstedeværelse av PCa. I denne studien har vi identifisert for første gang at exosomes inneholder Survivin kan bli renset fra plasma samlet inn fra pasienter med diagnosen PCa. Selv om det var liten forskjell i exosome mengde, exosomal Survivin nivåene var høyere i exosomes renset fra PCA-pasienter enn fra sera av normale kontroller. I tillegg, i denne studien, og som utføres av andre [36], [37], plasma-kvantifisert Survivin i prøver tatt fra pasienter med ikke bekreftet kreftdiagnose, hadde også nedsatt Survivin nivåer i forhold til PCa pasientsera. Kilden til denne exosomal Survivin basseng, men uklart, kan stamme i immunceller [40] slik som lymfocytter [41], monocytter [42] og dendrittiske celler [34], alle Survivin inneholder celler [43] som har vist seg å løslate exosomes. Survivin uttrykket er assosiert med etablerte funksjoner i biologisk aggressiv prostata kreft, for eksempel høyere endelig Gleason score og metastaser til regionale lymfeknuter [20]. I vår studie fant vi at pasienter som hadde sviktet med Taxotere hadde forhøyede nivåer av exosomal Survivin. I tillegg, og av spesiell interesse, fant vi at pasienter med enten mid (Gleason 6) eller høye (Gleason 9) Gleason score utstilt høyere exosomal Survivin nivåer med ingen signifikant forskjell i Survivin innhold mellom dem. Våre funn, men mer robuste i plasma vi studerte vises i overensstemmelse med hva som har blitt funnet med urin, tumor exosomes og PSA [31]. I disse studiene er urin exosome PSA beskrevet som er til stede i 20 av 24 PCA eksemplarer mens i våre hender, er svulsten exosome Survivin funnet i 47 av 47 prøver. Hvorvidt kreftbehandling vil påvirke svulst exosome Survivin nivåer har ennå ikke vurdert.
I denne studien, gir vi overbevisende bevis for at sirkulerende Survivin kan være et nyttig diagnostisk og prognostisk markør for menneskelig PCa. Våre resultater tyder på at Survivin, analysert direkte fra serum /plasma eller fra serum /plasma-avledet exosomes, var lavere hos pasienter med BPH og friske kontroller enn hos menn med PCa. Survivin tyder ikke endres, er gjennomgående høy, med hensyn til Gleason score og pasienter med tilbakefall, noe som tyder på at Survivin nivåer kan brukes for tidlig oppdagelse og kunne kanskje en dag mer presist skille BPH fra PCa. Sammenligning av pasienter med og uten svulster, men begge har høy PSA-verdier vil også være et viktig neste steg, som i våre hender alle BPH prøvene vi har kjøpt har relativt ikke-kreft PSA-verdier [44].
rollen exosomal survivin er fortsatt ukjent. Det er mulig at en terapi-stresset, cellular utgivelsen av exosomes inneholder Survivin og andre antiapoptotic proteiner, RNA eller mirnas utføres som et siste forsøk på å beskytte seg mot stress som eksisterer innenfor svulsten mikromiljøet. Større studier med flere arrangementer og lengre oppfølging vil være nødvendig for å utvikle en mer definitiv erklæring om sammenslutning av Survivin uttrykk i exosomes eller i svulsten mikromiljøet med prostata kreft progresjon og så viktig, metastaser og overlevelse. Disse funnene vil gi en begrunnelse for videre evaluering av exosomal Survivin og dens rolle i motstanden mot androgen-basert terapi i prostata kreft og øke muligheten for målrettet kombinasjonsbehandling for avansert prostatakreft.
Vårt funn at Survivin, en unikt menneske hemmer av apoptose (IAP), har inter transport og signal evner er betydelig. I samsvar med survivin tilknytning ugunstige clinicopathological parametere, kan menneskehandel Survivin hele svulsten mikromiljøet drive aggressiv status av svulsten, som forbyr eller minimere terapeutiske resultater. I vårt nåværende arbeid viser vi at selv om det totale antallet exosomes er utgytt i pasientens plasma ikke endres betydelig ved utvikling av kreft, nivået av Survivin i de exosomes øker betydelig. Viktigere, har progresjon fra midten til slutten av scenen ikke kjøre en merkbar Survivin økning indikerer at Survivin kan vise seg nyttig som en biomarkør for tidligere påvisning av prostatakreft. Faktisk Survivin basert testing, utført på kreft-exosomes, vil tillate molekylær-basert diagnose som i tid kan også hjelpe i terapi beslutninger og sykdom respons overvåkning fører til bedre styring av prostatakreft.
Materialer og metoder
pasient~~POS=TRUNC Plasma og serum
Plasmaprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble samlet inn fra ti friske frivillige menn og tjueåtte PCA pasienter. Plasma fra tyve PCA fagene ble hentet fra prøve bredden av SPECS konsortium som er en observasjons klinisk studie som utnytter prostata vev og kliniske verdier oppnådd ved informert samtykke til å utlede gen signaturer forutsigbare for utfallet ved diagnosetidspunktet. SPECS er regissert av Dr. Dan Mercola fra University of California, Irvine. Prøvene ble pre-prostatektomi plasma tilfeldig valgt fra ti lavgradige PCA tilfeller (Gleason 6) og ti høyverdig PCA tilfeller (Gleason 9). I tillegg plasma fra åtte avansert sykdom PCA pasienter som deltar i en andrelinje kjemoterapi studie ble også samlet inn. Disse pasientene hadde mislyktes kjemoterapi med Taxotere. Nitten serumprøver ble samlet inn fra PCA pasienter og seks kontroller gjennom San Manuel Band of Mission indianere Biospecimen Laboratory ved Loma Linda universiteter Cancer Center. Tjue BPH prøver ble kjøpt fra Bioserve Bioteknologi, Beltsville, MD. Bioserve Bioteknologi som leverandør av disse prøvene er dekket som definert i hippa loven av 1996 som er å gi dem til oss med et begrenset datasett av beskyttede helseinformasjon.
Blod ble samlet inn i vakuum-rør som inneholder natrium heparin. Rørene ble sentrifugert ved 2000 g x 7 minutter, og plasmaet ble deretter fjernet og aliquotert for lagring ved -80 ° C. Alle prøver ble oppnådd i løpet av IRB-godkjente studier, etter dokumentasjon om informert samtykke i samsvar med universitetspolitikk både Loma Linda University og University of California i Irvine.
Menneske Survivin Immunoassay
Hele plasmaprøver ble utsatt for et kommersielt tilgjengelig menneskelig survivin Immunoassay (R & D Systems, Minneapolis, MN). hjelp produsentens instruksjoner for å kvantifisere survivin konsentrasjoner
Exosome Isolation
Plasma mikrovesikler ble isolert som tidligere beskrevet, med mindre modifikasjoner [45]. Tint, ble kryokonservert plasma (2 ml) ble sentrifugert i 30 minutter ved 500 x g, 45 min ved 12 000 x g og 18 h ved 110 000 x g. Pellets ble resuspendert i et stort volum av PBS, filtrert gjennom et 0,22 um filter (Millipore, Billerica, Massachusetts) og sentrifugert ved 110 000 x g i 1 time. Mikrovesikkelen Pelletene ble vasket en gang i et stort volum av PBS, sentrifugert ved 110.000 x g i 1 time og re-suspendert i 50-200 ml PBS. Mengden av 110000 x g pellet proteiner utvinnes ble målt ved anvendelse av BCA-proteinanalysesettet (Pierce, Rockford, IL). Exosomes ble anvendt som friskt preparater for immunblotting eller ble konservert ved -80 ° C for senere bruk. For serumprøver ble kommersielt tilgjengelig ExoQuick (SBI, Mountain View, California) ansatt som beskrevet av leverandøren. I korte trekk ble 100 ul av serum inkubert med 100 ul av ExoQuick oppløsning etterfulgt av en 2 timers inkubering ved 4 ° C etterfulgt av sentrifugering ved 1500 x g i 30 minutter. Etter sentrifugering av exosomes vises som et beige eller hvit pellet på bunnen av beholderen som deretter rekonstituert med 500 pl av dH
2O.
Exosome kvantifisering
For å kvantifisere mengden av exosomes utgitt, vurderte vi aktiviteten av acetylkolinesterase, et enzym som er forbundet med disse vesikler. Acetylcholinesterase-aktivitet ble bestemt som beskrevet av Savina et al. [46]. I korthet, ble 40 ul av exosome fraksjon suspendert i 110 ul PBS. 37,5 ml av denne fortynnede PBS-exosome fraksjon ble deretter tilsatt til individuelle brønner på en 96-brønns flatbunnet mikroplate. 1,25 mM acetylthiocholine og 0,1 mM 5,50-ditiobis (2-nitrobenzosyre) ble deretter tilsatt til exosome fraksjoner i et sluttvolum på 300 ul, og forandringen i absorbans ved 412 nm ble målt hvert 5 minutt i 30 minutter.
menneske~~POS=TRUNC PSA Immunoassay
Isolerte exosomes fra pasientens plasma ble utsatt for menneskelige prostata spesifikt antigen (PSA) med en PSA Immunoassy (amerikansk forskning Products, Inc., Waltham, MA, USA) kit etter produsentens instruksjoner for å kvantifisere PSA-konsentrasjonen i exosomes.
Western blot analyse
for Western blot analyse, celler eller exosomal forberedelser ble lysert ved hjelp av lysebuffer (50 mM Tris (pH 7,5), 1 % NP40, 0,25% DOC, 150 mM NaCl
2, 1 mM PMSF, 10 ug /ml aprotinin /leupeptin /pepstatin, 20 mM NaF, 0,2 mM EGTA, 1 mM EDTA (pH 8,0), H2O). For proteinkonsentrasjoner BCA-analyse (Pierce, Rockford, IL) ble anvendt. Proteiner fra exosomes (20-40 pg) ble separert ved anvendelse av 12% Bis-Tris polyakrylamidgeler, overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Billerica, Massachusetts) og probet ved anvendelse av følgende antistoffer: mus monoklonalt anti-LAMP1 (Abcam, Cambridge, MA ), og kanin polyklonale anti-survivin (Novus, Littleton, CO). Sekundære antistoffer (IR-Dye konjugert) ble geite-anti-kanin og geit-anti-mus-immunoglobulin (licor, Lincoln, Nebraska).
