Abstract
kreftvaksiner er utformet for å ekspandere tumor antigen-spesifikke T-celler med effektor-funksjon. Men de kan også utilsiktet utvide regulatoriske T-celler (Treg), som kan alvorlig hemme klinisk effekt. For å løse denne mulighet, har vi utviklet en ny analyse for å påvise antigen-spesifikke Treg basert på nedregulering av overflaten CD3 følgende TCR inngrep, og som brukes denne tilnærmingen for å screene for treg spesifikk for NY-ESO-1 tumor antigen i melanomapasienter behandlede med /ISCOMATRIX
TM kreftvaksine NY-ESO-1. Alle pasientene som ble testet hadde treg (CD25
lyse foxp3
+ CD127
neg) spesifikk for minst ett NY-ESO-en epitop i blodet. Påfallende, sammenlignet med før behandling prøvene viste at mange av disse svarene ble indusert eller styrket av vaksinasjon. Den hyppigst påvist reaksjon var mot HLA-DP4 begrenset NY-ESO-1
157-170 epitop, som også er anerkjent av effektor T-celler. Spesielt, funksjonell Treg spesifikt for et HLA-DR-restricted epitop i NY-ESO-1
115-132 peptid ble også identifisert ved høy frekvens i svulstvev, noe som tyder på at NY-ESO-1-spesifikk Treg kan undertrykke lokal anti-tumor immunresponser. Sammen våre data gir overbevisende bevis for evnen av en kreftvaksine for å utvide tumor antigen-spesifikke treg i innstillingen av avansert kreft, et funn som skal gis alvorlig faktor ved utformingen av fremtidige vaksine kreft kliniske forsøk.
Citation: Ebert LM, MacRaild SE, Zanker D, Davis ID, Cebon J, Chen W (2012) A Cancer vaksinen induserer Utvidelse av NY-ESO-1-Specific Regulatoriske T-celler hos pasienter med avansert melanom. PLoS ONE 7 (10): e48424. doi: 10,1371 /journal.pone.0048424
Redaktør: Derya Unutmaz, New York University, USA
mottatt: 25 juni 2012; Godkjent: 25 september 2012; Publisert: 26 oktober 2012
Copyright: © 2012 Ebert et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Cancer Council Victoria tilskudd til LE (603103, 433626), en National Health and Medical Research Council (NHMRC) prosjektstøtte til WC (433 608) og operasjonell infrastruktur støtte av viktoriansk delstatsmyndighetene. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft vaksiner holde store løftet i behandling av solide tumorer som melanom, og har vært fokus for omfattende preklinisk og klinisk testing i de siste årene. På grunn av dens eksepsjonelle immunogenitet, har NY-ESO-1 dukket opp som en av de mest lovende mål i slike fremgangsmåter [1]. I løpet av de siste årene, har vi gjennomført en rekke kliniske studier i melanom pasienter som bruker en kreftvaksine som består av full-lengde rekombinant NY-ESO-1 protein formulert med ISCOMATRIX
TM adjuvans (CSL Limited, Australia). Selv om denne vaksinen hadde potente anti-tumor effekter i prekliniske dyrestudier [2] og viste lovende resultater i innledende fase I studier [3], det klarte ikke å forbedre klinisk utfall i melanom pasienter i senere studier [4] og manuskript under forberedelse). Videre, mens pasienter med fullt resekterte (tidlig-stadium) sykdommen utviklet sterke effektor-T-celle (Teff) responser til NY-ESO-1 etter vaksinasjon [3], [5], pasienter med avansert melanom hadde mye mindre kraftige reaksjoner [4] .
i likhet med vår erfaring med NY-ESO-1 /ISCOMATRIX
TM vaksine, har mange andre kreftvaksiner også unnlatt å indusere betydelig klinisk nytte, ofte til tross for induksjon av tilsynelatende potent tumor antigen-spesifikke Teff svar [6], [7]. Det er mange mulige forklaringer på dette, men en som har fått spesiell oppmerksomhet de siste årene sentre rundt rollen CD4
+ CD25
+ foxp3
+ regulatoriske T-celler (Treg). Treg er avgjørende for å hindre autoimmunitet [8]. Men en økende mengde bevis støtter konseptet som Treg kan også blokkere generasjon av effektiv immunitet anti-tumor [9]. Det er derfor viktig at vaksine kreft tilnærminger unngå å utvide disse cellene.
Inntil nylig bevis for godkjenning av tumorantigener ved Treg hadde vært mangelvare, og det var uklart hvorvidt Treg ville bli aktivert og utvide svar vaksinasjon mot tumorantigener. I de senere år har imidlertid en rekke rapporter har identifisert Treg spesifikk for en rekke tumorantigener i human kreft, inkludert NY-ESO-1, Survivin, TRP-1, gp100, MAGE-A3, Melan-A, karsinoembryonisk Ag ( CEA), telomerase, HER2 /neu, WT-1, MUC-1 antigener og papillomavirus E6 og E7 [10] – [16]. Tilstedeværelsen av disse cellene hos kreftpasienter reiser alvorlige bekymringer om potensialet for kreftvaksiner å utvide ikke bare Teff men også treg. I hvilken grad dette faktisk skjer, men er dårlig forstått.
I denne studien har vi evaluert effekten av vaksinering med NY-ESO-1 /ISCOMATRIX
TM på frekvensen av NY- ESO-1-spesifikk treg hos pasienter med sent stadium melanom. Som de fleste Treg ikke produserer cytokiner ved aktivering [17] – [19], er det foreløpig ingen egnet analyse tilgjengelig for skjermen for antigen-spesifikke treg. Vi har derfor utviklet en ny, systematisk tilnærming der antigen-spesifikke Treg blir oppdaget av nedregulering av overflaten T-celle reseptor (TCR) /CD3 komplekser følgende
in vitro
stimulering med et bibliotek av korte antigene peptider. Optimalisering av denne metode er nylig blitt beskrevet [20]. Her har vi brukt denne tilnærmingen til skjermen for NY-ESO-1-spesifikk treg i melanom pasienter, før og etter vaksinering med NY-ESO-1 /ISCOMATRIX
TM vaksine. Denne studien har gjort oss i stand til å få en enestående forståelse av tumor antigen-spesifikke treg i innstillingen av avansert kreft, inkludert deres funksjon, plassering, utvalget av epitoper gjenkjent og hvordan deres frekvens påvirkes av vaksinasjon.
Resultater
en ny tilnærming basert på nedregulering av overflaten CD3 oppdager Teff og treg spesifikk for NY-ESO-1 peptider
for å screene for NY-ESO-1-spesifikk treg i en objektiv måte, har vi utviklet en analyse basert på prinsippet om at T-celler ned-modulering av antallet av CD3 /TCR-komplekser på celleoverflaten som følge av bindingen av beslektet antigen [21], [22]. Dette kan påvises som et redusert nivå av celleoverflate-CD3 farging ved strømningscytometri. På grunn av sin knapphet, NY-ESO-1-spesifikk Teff kan nesten aldri bli oppdaget direkte
ex vivo
i blodprøver ved bruk av standard metodikk (IFN-γ intracellulære cytokin flekker), men i stedet krever forutgående utvidelse
i vitro
. Foreløpige undersøkelser viste at dette var også tilfelle for NY-ESO-1-spesifikk Treg oppdaget ved hjelp av CD3 nedregulering metode (upubliserte observasjoner). Følgelig pasientens PBMC ble dyrket med et panel av 28 delvis overlappende 18 aminosyrer peptider som sammen dekker hele sekvensen av NY-ESO-1 [23], for å tillate utvidelse av NY-ESO-1-spesifikke Teff og treg til detekterbare frekvenser . Forhold, herunder kultur tid, IL-2-konsentrasjon og kilde av serum, var optimalisert for treg utvidelse [20]. Etter 21d utvidelse, kulturene ble re-stimulert med individuelle 18mer peptider og graden av overflate CD3 bestemt ved strømningscytometri, i forbindelse med farging for treg markører.
Et eksempel på de resultater som ble oppnådd er vist i figur 1. disse data viser at en klar populasjon av antatt treg kunne påvises innenfor CD4
+ -T-cellepopulasjonen ved ko-farging for CD25 og foxp3 (figur 1A, venstre). Innenfor denne Treg undergruppe, en tydelig sub-populasjon av CD3-low (antigen-spesifikke) celler var tydelig etter re-stimulering med peptid NY-ESO-1
157-174 men ikke NY-ESO-1
127 -144 eller i fravær av re-stimulering (figur 1A, øvre panel). Motsatt kan en CD3-lav sub-populasjon oppdages innenfor Teff undergruppe følgende re-stimulering med peptid NY-ESO-1
127-144 men ikke NY-ESO-1
157-174 (fig 1A, nedre paneler). En oversikt over resultatene for pasienten å bruke alle 28 peptider viser to forskjellige treg respons, innenfor regioner NY-ESO-1
37-60 og NY-ESO-1
157-180 (Fig 1B), og en stor Teff respons, innenfor regionen NY-ESO-1
127-144 (fig 1 C).
CD3
. PBMC fra Pasient 113 ble dyrket med sammenslåtte NY-ESO-1 18mer peptider som beskrevet i
Metoder
, etterfulgt av re-stimulering med de indikerte enkelte peptidene under natten kultur for å tillate CD3 nedregulering. Celler ble farget med antistoffer mot CD4, CD25, CD3 og foxp3 og analysert ved strømningscytometri. (
A
): et eksempel på fargemønstre observert, noe som illustrerer gating av treg og Teff (gated på levedyktige CD4
+ T-celler) og nedregulering av CD3 innenfor hver populasjon. (
B Anmeldelser –
C
): En oppsummering av svarene som oppdages innenfor treg (B) og Teff (C) populasjoner. Stiplede linjer indikerer baseline nivå av CD3-lav celler (null peptid tilstand).
Vi har også søkt å analysere cytokin produksjon profilen til NY-ESO-1-spesifikk treg i fire pasienter som har treg ned -regulated CD3 i respons til NY-ESO-1-peptider, ved hjelp av intracellulær cytokin farging. CD3-lav Treg produsert lav til ikke-detekterbare nivåer av IL-4, IL-10 og IL-17 i alle pasienter. Imidlertid produksjon av IFN-γ og TNF-α var variabel, med to pasienter viser neglisjerbar produksjon av CD3-lav treg, og to pasienter som viser høye nivåer av produksjon (figur S1). Sekresjon av pro-inflammatoriske cytokiner så som IFN-γ av treg er blitt beskrevet tidligere [16], [24] – [26], og synes å være et unikt trekk ved Treg identifisert i kreftpasienter. Men våre resultater viser at denne egenskapen er sporadisk, og kan ikke være lettelse opp på for treg identifikasjon.
Cells identifisert av CD25
+ foxp3
+ fenotype har fenotypiske og funksjonelle egenskaper treg
Både CD25 og foxp3 er kjent for å være forbigående indusert på Teff etter aktivering, noe som betyr at aktivert Teff kan potensielt forveksles med treg [27] – [30]. Gitt den utvidede kultur perioden som brukes (21d), er det usannsynlig at cellene identifisert som CD4
+ CD25
+ foxp3
+ i vår kultur system representerer aktivert Teff, siden uttrykk for foxp3, og i mindre utstrekning CD25, tilbake til utgangsverdien etter ~ 10 dager, [12], [27], [28], [30]. Imidlertid for ytterligere å demonstrere at disse celler er faktisk treg, kulturene ble co-farget med et antistoff til CD127, som uttrykkes ved sterkt reduserte nivåer på treg i forhold til Teff [31], [32]. Figur 2A viser at celler identifisert som treg (CD4
+ CD25
+ foxp3
+) uttrykte knapt påvisbare nivåer av CD127, mens celler identifisert som Teff (CD4
+ foxp3
-) uttrykte jevnt høye nivåer. Videre, når bulk Treg var FACS-sortert fra 21d kulturer (i henhold til en CD4
+ CD25
+ CD127
– /lav fenotype), disse cellene induserte en nedgang doseavhengig i spredning av CD8
+ T-celler (figur 2B)
Pasient PBMC ble dyrket for 21d med NY-ESO-1 18mer peptid (er) kjent fra forstudier til å indusere en treg respons og deretter:. (
A
) analysert for CD127 uttrykk ved flowcytometri, gating på treg (CD4
+ CD25
+ foxp3
+) eller Teff (CD4
+ foxp3
-) som angitt. Resultatene som vises er representative for tre forsøk med samme resultat; eller (
B
): Treg ble renset ved å sortere CD4
+ CD25
+ CD127
lave celler og testet for deres evne til å undertrykke proliferasjonen av CFSE-merket CD8
+ T-celler pre-stimulert i 16 timer med plate-bundet anti-CD3. Grafen viser% undertrykkelse i forhold til kulturer gjennomført i fravær av tregs, mens flowcytometri histogram nedenfor illustrerer CFSE profiler innhentet for responder T-celler alene (venstre) eller på 1:02 ratio med treg (til høyre). Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter ved bruk av prøver fra tre forskjellige personer. I (C), kultivert PBMC ble re-stimulert med det relevante peptidet og ekspresjon av LAP på overflaten av Tregs eller Teffs ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri innenfor den CD3-lav (peptid-responsive) populasjonen for tre pasienter.
til slutt, søkte vi å bestemme hvorvidt antigenspesifikk aktivering av treg førte til indusert ekspresjon av TGF-β latens-assosiert peptid (LAP) på celleoverflaten. Induksjon av LAP uttrykk etter aktivering er et karakteristisk unik for treg, og dette molekylet uttrykkes ikke på teff-celler, selv etter aktivering [18], [33]. For å direkte sammenligne aktiverings-indusert ekspresjon på LAP Treg og Teff, identifiserte vi tre pasienter hvor treg og teff populasjoner både nedregulert CD3 som reaksjon på det samme peptid. PBMC fra disse pasientene ble dyrket for 21d med peptid, re-stimulert over natten og vurderes for CD3 nedregulering og overflate LAP uttrykk. Som vist i figur 2C, ble LAP tydelig fremkalt på en sub-populasjon av treg å svare på NY-ESO-1 peptid, som er identifisert av CD3-lav fenotype. I kontrast, CD3-lav Teff å svare på det samme peptid klarte å opp-regulere LAP.
Sammen uttrykk for en CD4
+ CD25
+ foxp3
+ CD127
-. fenotype kombinert med
in vitro
undertrykkende kapasitet og evnen til å indusere LAP uttrykk sterkt at cellene analysert her er funksjonelle treg fremfor aktivert Teff som har midlertidig oppregulert foxp3 uttrykk
nedregulering av CD3 av treg er avhengig av peptidkonsentrasjonen
i denne studien blir nedregulering av overflaten CD3 anvendt som en markør for antigen-spesifikk aktivering av Tregs via TCR. Således vil graden av CD3 ned-regulering kan forventes å være strengt avhengig av peptidkonsentrasjonen. For å bekrefte dette, ble peptid-titrering studier utført ved anvendelse av PBMC fra 4 forskjellige pasienter. For hver pasient ble to peptider testet, som ble valgt på basis av preliminære screeningseksperimenter som å være i stand til å indusere en CD3 ned-regulering respons ved 1 x 10
-4m. Som vist i figur 3, var det en klar doseavhengig forhold mellom andelen av CD3-lav Treg og konsentrasjonen av peptidet som brukes for re-stimulering. En rekke av disse reaksjonene kan bli titrert ned til 1 x 10
7M peptid, som kan sammenlignes med flere tidligere beskrevet CD4
+ teff responser på NY-ESO-1-peptider [5], [34]. Det er også viktig å merke seg at 18mer-peptider som brukes her sannsynligvis ikke utgjør den optimale epitop for T-celle-gjenkjennelse, i hvilket tilfelle responsen registreres når peptidkonsentrasjonen blir begrensende, kan være en betydelig undervurdering.
PBMC fra fire pasienter ble dyrket i 21d med NY-ESO-1 18mer-peptider og deretter re-stimulert over natten med de enkelte peptider ved de angitte konsentrasjoner. Andelen av treg å nedregulere CD3 som respons på peptidet ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri.
NY-ESO-1-spesifikke Treg blir ofte påvist i blodet hos sene stadier av melanompasienter og kan bli ekspandert ved NY-ESO-1 /ISCOMATRIX
TM vaksine
A kohort av ni pasienter med avansert melanom ble screenet for NY-ESO-1-spesifikke treg, både før og 42 dager etter vaksinering med NY -ESO-1 /ISCOMATRIX
TM. Resultatene er oppsummert i figur 4A. Etter vaksinasjon hadde alle pasientene treg respons som er spesifikke for minst ett område av det NY-ESO-1-proteinet; flere hadde svar på to eller tre forskjellige regioner. Påfallende, en sammenligning med pre-vaksinasjon prøvene viste at mange av disse svarene ble indusert av vaksinen, som de var umulig å oppdage før vaksinasjon. Et eksempel på en slik reaksjon er vist i figur 4B. I tillegg er noen respons som var detekterbare før vaksinasjon, syntes å være forsterket av vaksinen (definert som a 2-ganger økning i responsive celler etter vaksineringen, da de to prøvene ble sammenlignet i parallell under identiske betingelser). For eksempel, i Pasient 120, hyppigheten av treg spesifikke peptid NY-ESO-1
37-54 var 4,4% før vaksinering, men 18,3% etter vaksinasjon, og hyppigheten av treg spesifikke peptid NY-ESO-1
79-96 var 3,3% før vaksinasjon og 16,3% etter vaksinering
(
A
). for hver pasient innen kohorten, hver validert treg respons oppsummeres med en boks. Svar betraktes validert hvis de ble observert i minst to uavhengige kulturer, ved bruk av to uavhengig syntetisert satser av peptid. Plasseringen av boksen viser hvor i NY-ESO-1 peptidsekvens responsen var lokalisert. I det tilfelle at responser ble detektert til to tilstøtende peptider i sekvens, er dette vist som en enkelt reaksjon som strekker seg over de to peptider. Skraverte bokser indikerer at størrelsen av responsen ble øket i det minste to ganger i post-vaksinasjon prøvene sammenlignet med pre-vaksinasjonsprøvene når begge prøver ble testet i parallell under identiske betingelser. Fylte bokser indikerer at responsen var bare påvises i prøver samlet etter vaksinasjon. Åpne bokser indikerer at størrelsen av responsen var lik pre- og post-vaksinasjon. (
B
): Et eksempel på en reaksjon som ble indusert ved vaksinering (pasient 124) er vist. Treg ble separert på grunnlag av CD25 og foxp3 uttrykk, og CD3 ned-regulering ble vurdert ved re-stimulering med enten kontroll peptidet eller det samme peptid som brukes for utvidelse (NY-ESO-1
85-102).
treg og Teff svare på en identisk epitop i regionen NY-ESO-1
157-170
Figur 4A viser at treg respons ble mest sett mot peptid NY- ESO-1
157-174, med Tregs spesifikke for dette 18mer peptid påvises i 5/9 pasienter testet. Denne region inneholder en epitop (NY-ESO-1
157-170) som tidligere har blitt karakterisert for Teff [35], øke muligheten for at treg kunne svare til den samme epitopen. For å løse denne muligheten, to pasienter (102 og 103) ble identifisert som hadde respons på NY-ESO-1
157-174 peptid i både treg og teff undergrupper, og evnen til disse cellene for å svare på den publiserte epitop (NY-ESO-1
157-170) eller forskjellige trunkeringstegn eller skjøte varianter, ble vurdert. Som vist i figur 5, både treg (venstre panel) og Teff (høyre panel) reagert på NY-ESO-1
157-170 peptid. Trunkering av enten en eller to aa fra N-terminalen, eller en aa fra C-terminalen, hadde liten effekt på disse svarene. Men begge populasjonene viste sterkt redusert respons etter avkutting av to aa fra C-terminalen (peptid NY-ESO-1
157-168). Tilsvarende utvidelse av kjernen sekvens av en aa på enten C eller N-terminus også redusert respons innen begge populasjonene.
Pasient PBMC ble dyrket for 21d med 18mer peptid NY-ESO-1
157- 174 og deretter re-stimulert med de angitte korte HPLC-rensede peptider ved enten å tilsette direkte til kulturen på vanlig måte (
A-D
), eller ved å pulse på BCL, etterfulgt av vasking (
E-F
). Etter natten inkubasjon ble cellene farget og analysert ved flowcytometri, gating på treg (CD4
+ CD25
+ foxp3
+;
A, C og E
) eller Teff (CD4
+ foxp3
-;
B, D og F
). Peptider som brukes for re-stimulering var basert på den publiserte epitop NY-ESO-1
157-170, med enten trunkering (
A-B
) eller forlengelse (
C-D
) ved hver endestasjonen. Grafer i
A-D
viser resultater oppnådd for Patient 102; lignende resultater ble også oppnådd for Pasient 103. Grafer i
E-F
showet bety + SEM fra Pasienter 102 og 113; en stjerne indikerer ap verdi. 0,05 (t-test)
Den tidligere beskrevet NY-ESO-1 har vist
157-170 epitop å være begrenset av HLA-DP4 klasse II allel [35], og molekylær skrive avslørte at pasientene som ble testet i figur 5 uttrykte HLA-DPB1 * 0401-molekyl. For å bekrefte at Tregs også har denne epitopen når det ble presentert på HLA-DP4, et panel av EBV-transformerte B-cellelinjer (BCL) ble pulsert med den NY-ESO-1
157-170 peptid, ble vasket og testet for evnen til å indusere CD3 ned-regulering i treg og teff-celler (figur 5E-F). En BCL mangler DP4 uttrykk (9902) ikke klarte å overtale CD3 nedregulering i enten befolkningen, mens en BCL uttrykker HLA-DPB1 * 0401 (linje 9004) induserte en signifikant respons i begge populasjoner. Dermed blir NY-ESO-1
157-170 peptidet blir presentert for både Treg og Teff på HLA-DP4.
Til sammen tyder disse resultater på at den minimale sekvens av den tidligere beskrevne NY-ESO- 1
157-170 epitop [35] vil måtte endres til NY-ESO-1
159-170, eller kanskje til og med til NY-ESO-1
159-169, selv om denne eksakte peptid ikke ble testet i våre analyser. Enda viktigere er imidlertid dataene viser at treg og Teff svare på nøyaktig den samme epitop, og i begge tilfeller, er denne reaksjon begrenset av HLA-DP4.
NY-ESO-1-spesifikke Treg er utbredt innenfor svulstvev
for å finne ut om NY-ESO-1-spesifikk treg kan oppdages innen svulsten samt blodet, ble frisk svulstvev hentet fra pasient 126 etter tre runder med vaksinasjon med NY-ESO-1 /ISCOMATRIX
TM og en enkelt cellesuspensjon generert. Den resulterende blanding av tumorceller og stromale celler, innbefattende TIL, ble dyrket i nærvær av høydose IL-2, men uten tilsetning av noe eksogent peptid, antigen eller mitogen. Utvidet TIL ble stimulert over natten med peptider NY-ESO-1
85-102 og NY-ESO-1
115-132 (begge induserte responser i perifert blod Treg fra denne pasienten) og vurderes for CD3 ned- regulering. I tillegg ble en prøve av tumor spaltningen analysert ved strømningscytometri før kulturen, noe som viste at 41,1% av CD4
+ T-celler i tumoren hadde en treg fenotype, noe som representerer en tilnærmet 10 gangers anrikning i løpet av frekvenser i blod (ikke vist).
Peptide NY-ESO-1
85-102 unnlatt å stimulere noen reproduserbare svar av enten treg eller Teff i tIL. På den annen side, peptid NY-ESO-1
115-132 induserte en lett detekterbar respons ved teff celler i den ekspanderte TIL (figur 6A). Påfallende, størrelsen av responsen til det samme peptidet var ~4 ganger høyere i Treg populasjonen, med 40% av treg å nedregulere CD3 i respons til dette peptid. For å vise reproduserbarheten av denne forskjell, ble tre uavhengige TIL linjer generert fra frosne porsjoner av de samme tumor prøven, og hver linje testet 1-3 ganger. I hver analyse, andelen av celler reagerer på den NY-ESO-1
115-132 peptid var alltid høyere i Treg befolkningen enn Teff befolkningen, med en gjennomsnittlig fold forskjell på 3,1 (figur 6B). Pre-inkubasjon med en blokkerende antistoff mot HLA-DR nesten fullstendig hemmet både treg og teff svar på dette peptid, mens blokkerende antistoffer til HLA-DP og HLA-DQ ikke hadde noen effekt, noe som indikerer at responsen innenfor begge populasjoner ble begrenset av HLA dr (fig 6C).
Tumor vev ble hentet fra pasient 126 og TIL linjer generert som beskrevet i
Metoder
. (
A-B
): Cellene ble behandlet over natten med peptid NY-ESO-1
115-132 eller kontroll peptid, og deretter farget og analysert ved flowcytometri, gating på treg (CD4
+ CD25
+ foxp3
+) eller Teff (CD4
+ foxp3
-) som angitt. Representant flowcytometri dot plots (A) viser gating av treg og Teff, og CD3 nedregule respons observert i hver populasjon etter re-stimulering, mens (B) viser en oppsummering av oppnådde resultater i fem forsøk, hver bruker en av de tre forskjellige tIL linjer generert. (
C
): Effekten av å blokkere antistoffer mot HLA-DR, HLA-DP eller HLA-DQ på responsen til peptid NY-ESO-1
115-132 innen treg (til venstre) og Teff (høyre) populasjoner. Lignende resultater ble oppnådd i et andre forsøk. (
C
): TIL ble stimulert over natten med NY-ESO-1
115-132 peptid og peptid spesifikke (CD3
lo) og ikke-spesifikke (CD3
hi) treg (CD4
+ CD127
lo CD25
hi) ble renset ved cellesortering og testet for deres evne til å undertrykke proliferasjonen av CFSE-merket CD8
+ T-celler pre-stimulerte til 4 timer med anti- CD3 på angitt treg: responder forholdstall. Som en sammenligning ble det også Treg sortert fra tidligere fryst PBMC erholdt fra en frisk donor. Lignende resultater ble observert i et andre eksperiment, selv om høyere treg:. Responder-forhold var nødvendig for å se undertrykkelse
I figur 2 viste vi at bulk Treg isolert fra 21-dagers kulturer trykkes spredning av CD8
+ T-celler. Men det var også av interesse å bekrefte at NY-ESO-1-spesifikk Treg hadde en lignende aktivitet. Ekspandert TIL fra pasient 126 ble stimulert med NY-ESO-1
115-132 peptid over natten for å indusere CD3 ned-regulering og peptid-spesifikke Treg ble deretter sortert på grunnlag av et CD4
+ CD25
+ CD127
– CD3
lav fenotype og testet i en undertrykkelse analysen. Disse cellene undertrykt proliferasjon av anti-CD3-stimulerte CD8
+ T-celler fra en frisk donor i en lignende grad som bulk Treg isolert fra en frisk donor (figur 6D). Interessant, CD3
hi Tregs sortert fra TIL linjen (dvs. treg som hadde unnlatt å svare på peptid stimulering) også undertrykt CD8
+ T-celledeling, noe som tyder på at nyere antigen stimulering var ikke avgjørende for kjøpet av suppressor funksjonen av disse cellene. Muligens, ble tilstedeværelsen av tumorceller i løpet av opprettelsen av TIL linje aktivert Tregs spesifikke for et bredt spekter av tumorantigene epitoper, og denne aktiverte tilstand opprettholdes under ekspansjon, og dermed muliggjør Treg med en rekke antigenspesifisiteter for å utøve undertrykkende aktivitet.
til sammen utgjør disse resultater viser at tumorvevet fra pasient 126 inneholder en fremtredende populasjon av treg spesifikt for et HLA-DR-begrenset epitop innenfor NY-ESO-1
115-132 peptid. Videre kan Treg spesifikt for denne epitop undertrykke CD8
+ T-celledeling og er derfor fullt funksjonell. Immunhistokjemisk farging av tumorvevet viste at svulstcellene fremdeles uttrykte høye nivåer av NY-ESO-1 på dette tidspunkt (data ikke vist), noe som tyder på at vev-resident NY-ESO-1-spesifikke treg, kan bli aktivert lokalt.
Diskusjoner
i denne studien har vi benyttet en ny tilnærming som gjør at objektiv identifisering av treg spesifikke for noen epitop innenfor en gitt svulst antigen. Vi viser at NY-ESO-1-spesifikke Treg er svært vanlig i blodet hos pasienter med sent stadium melanom, som de var detekterbare i 9/9 pasienter som ble testet. Videre, i seks av disse ni pasientene, NY-ESO-1 /ISCOMATRIX
TM vaksine enten indusert minst ett nytt svar som ikke kunne påvises før vaksinasjon eller styrket de eksisterende tiltak.
på grunn av knapphet på tumor antigen-spesifikke T-celler (inkludert treg) i blodet, var det nødvendig å utvide disse cellene in vitro med antigenet. Denne kulturen trinnet kan ha forårsaket en midlertidig oppregulering av foxp3 og CD25 på teff celler, som har blitt rapportert tidligere [27] – [30], og disse cellene kan teoretisk ha blitt forvekslet treg. Men flere bevislinjer tyder sterkt på at dette ikke er tilfelle. Først disse cellene trykkes spredning av CD8
+ T-celler, når det bedømmes til enten et hovedpopulasjon (figur 2) eller isoleres i henhold til NY-ESO-1-spesifisitet (fig 6). For det andre, uttrykte de lav til ikke målbare nivåer av CD127 uttrykk. Tredje, de up-regulert LAP ved aktivering med beslektet peptid. Til slutt, treg og Teff bestander i enkelte pasient noen ganger anerkjent forskjellige epitoper (som i eksempelet vist i figur 1), som gir bevis for at disse er diskrete populasjoner, og treg var ikke bare generert av konvertering fra Teff gjenkjenne den samme epitop. Vår konklusjon at CD4
+ CD25
+ foxp3
+ celler i 21-dagers kulturer er treg og ikke aktivert Teff er i overensstemmelse med tidligere studier som viser at oppkjøpet av disse markørene ved Teff er midlertidig, og uttrykket er i stor grad tapt ved dag 10 fra kulturen [12], [27], [28], [30]. Av notatet, har to tidligere studier også identifisert NY-ESO-1-spesifikk treg i blodet av melanom pasienter som bruker alternative tilnærminger, ytterligere støtte våre funn [12], [24].
Treg respons påvist i vår studie strekke seg over en stor del av NY-ESO-1-proteinet. Selv detaljert karakterisering av hver av disse epitoper er utenfor rammen av denne studien, kan vi bekrefte at det ofte oppdages treg respons til 18mer peptid NY-ESO-1
157-174 skyldtes anerkjennelse av tidligere beskrevet DP4- begrenset immunodominant NY-ESO-1
157-170 epitop. Dermed har vi bevist at Treg og Teff kan gjenkjenne nøyaktig samme minimum epitop presenteres på samme HLA allel. Dette igjen tyder på at human Treg og Teff dele i det minste delvis overlappende TCR-repertoar, som er i overensstemmelse med tidligere studier på mennesker [36] og [37] mus. På den annen side, en av de treg respons detekterte her (i regionen NY-ESO-1
49-72) ikke inneholder noen tidligere beskrevet teff epitoper (se https://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase) og dette svaret ble ikke påvist i Teff befolkningen i denne pasient (data ikke vist). Dermed kan dette spesifisitet være unikt for treg befolkningen.
Det er fortsatt et spørsmål om debatten om treg formidle sine undertrykkende effekt først og fremst i de sekundære lymfoide organer, på lokale steder i periferien (som svulstvev) eller, mer sannsynlig, en kombinasjon av begge. Av praktiske grunner har vi vurdert NY-ESO-1-spesifikke treg respons hovedsakelig i blodet, noe som bør gjenspeiler celler som sirkulerer gjennom sekundære lymfoide organer. Men for pasient 126, kunne vi i tillegg få frisk svulstvev og vise at Treg spesifikt for et HLA-DR-restricted epitop i peptid NY-ESO-1
115-132 var ikke bare til stede i blodet, men var også til stede ved høy frekvens i tumoren. Disse NY-ESO-1
115-132 spesifikke Treg var fullt funksjonell, som de undertrykte CD8
+ T-celledeling.
