Abstract
glioblastom (GBM) kan inneholde en variabel andel aktive kreftstamceller (cscs) i stand til selvfornyelse, for å samle inn CD133
+ neurosfærer, og å utvikle intrakraniale svulster som phenocopy den opprinnelige seg. Vi antok at nucleostemin kan bidra til kreft stamcellebiologi som disse cellene dele egenskaper med normale stamceller. Her rapporterer vi at nucleostemin er uttrykt i GBM-cscs isolert fra pasientprøver, og at dens uttrykk omvendt til hva det har blitt beskrevet for vanlige stamceller, forsvinner ikke når cellene differensiert. Betydningen av nucleostemin uttrykk i cscs ble adressert ved å målrette de tilsvarende mRNA ved hjelp lentivirally omformet kort hårnål RNA (shRNA). Ved å gjøre det, fant vi en off-target nucleostemin RNAi (shRNA22) som opphever spredning og induserer apoptose i GBM-cscs. Videre i nærvær av shRNA22, GBM-cscs ikke klarte å danne neurosfærer
in vitro
eller vokse på soft agar. Når disse cellene er xenotransplanted inn i hjernen til nakenrotter, er tumorutvikling betydelig forsinket. Forsøk ble gjort for å identifisere hovedmålet /s fra shRNA22, noe som tyder på en transkripsjonsfaktor som er involvert i ett av MAP-kinaser signal-trasé eller flere mål. Bruken av denne shRNA kan bidra til å utvikle nye terapeutiske tilnærminger for uhelbredelig type hjernesvulst
Citation. Gil-Ranedo J, Mendiburu-Eliçabe M, García-Villanueva M, Medina D, del Alamo M, Izquierdo M (2011) en off-target Nucleostemin RNAi hemmer vekst i human Glioblastoma-Avledet kreftstamceller. PLoS ONE 6 (12): e28753. doi: 10,1371 /journal.pone.0028753
Redaktør: Keith L. Svart, Cedars-Sinai Medical Center, USA
mottatt: 28 juni 2011; Godkjent: 14 november 2011; Publisert: 12.12.2011
Copyright: © 2011 Gil-Ranedo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra: Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF 2009-07259) Spania, og Fundación Eugenio Rodriguez Pascual (Madrid). Centro de biologia Molecular S.O. er også mottaker av en institusjonell stipend fra Ramón Areces Foundation. JG-R var mottakeren av en predoctoral fellesskap fra Gobierno Vasco, Spania. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
glioblastoma multiforme er en av de mest ondartede og vanligste av alle astrocytic svulster [1]. Veksten mønster av GBM er svært infiltrerende, gjengi et kirurgisk kur svært vanskelig og resulterer i svært dårlige overlevelses utfall som har forbedret bare marginalt de siste tiårene [2]. Kreften stamcelle hypotese antyder at svulster er organisert i et hierarki med en undergruppe cscs ansvarlig for tumorprogresjon, vedlikehold og tilbakefall [3]. Celler med stilk-lignende egenskaper ble først identifisert i akutt myelogen leukemi [4], og i dag sin eksistens har blitt bekreftet i brystkreft [5], medulloblastoma og glioblastom [6], prostatakreft [7], melanom [8], eggstokkkreft [9], hode og nakke plateepitel karsinom [10], tykktarmskreft [11], bukspyttkjertelkreft [12] og lungekreft [13], blant andre. I glioblastom, tilbakefall normalt følge behandlingen, sannsynligvis fordi cscs er svært infiltrerende, selektivt motstandsdyktig mot radiotherapies, chemotherapies [14], [15], [16], immunterapi [17], og fremme angiogen aktivitet. Videre kan lekkasje fra kjemiske og radioterapi prime hjernesvulst cscs å forbedre sine stamcellelignende egenskaper [18]. Denne populasjonen av cscs er svært tumorigent og phenocopy den opprinnelige svulsten i gnager xenograft modeller [19], [20]. Tilnærminger for å tvinge cscs å differensiere til celler med begrenset eller ingen celledeling attributter, ved å utsette dem for benmorfogene proteiner for eksempel, ble brukt til å gjøre dem mer sårbare for konvensjonell terapi, og viste betydelig effekt i musemodeller [21]. Forstå grunnleggende biologi av kreft stamceller er en viktig funksjon før du flytter inn mulige behandlinger for å fjerne dem.
Nucleostemin er en GTP-bindende protein, såkalte grunn av sin nukleolært lokalisering og bedre uttrykk i stamceller [22 ]. Selv om proteinet er til stede hovedsakelig i embryonale og voksne stamceller, er det også uttrykt i flere transformerte cellelinjer og svulster [23], [24]. Nucleostemin, på den annen side, er brått nedregulert i løpet av differensiering før terminal celledeling. Dette proteinet ble først identifisert i voksen rotte nevrale stamceller, og har vært implisert i cellesyklusprogresjon [22]. Flere nucleostemin bindende proteiner har blitt identifisert, inkludert p53, MDM2 og telomeric gjenta bindende faktor 1 (TRF1) [22], [25], [26]. Endringer i nucleostemin ekspresjonsnivåer forårsake en reduksjon i formeringshastigheten av celler, i begge p53-avhengige og uavhengige oppførsel, [22], [26] – [28]. Proteinet er uunnværlig for tidlig embryogenese [29], men er også viktig i voksen neuralstamceller [30]. Noen studier har vist at uttømming av nucleostemin er forbundet med en begrenset tumorigen kapasitet både HeLa og PC-3-celler [31], [24]. Foruten dens implikasjon i reguleringen av celleproliferasjon, har flere andre roller er tilordnet nucleostemin eksempel telomerlengde regulering ved å fremme nedbrytningen av TRF1 [25], prosessering av pre-rRNAs [32] og vedlikehold av nukleolært arkitektur [33].
Vår hensikt var å undersøke hvilken rolle nucleostemin i menneskelig GBM-cscs hjelp lentivirally omsatte korte hårnål RNA (shRNAs) til alvorlig redusere sin tilstedeværelse i cellene. De cscs utarmet av nucleostemin uttrykk (shRNA18) resulterte ikke i den dype reduksjon av celleproliferasjon og økt apoptose som vi hadde forventet. I stedet, en off-target lentivirus (shRNA22) avskaffet spredning, selvfornyelse og overlevelse av cscs. Også tilstedeværelsen av denne shRNA betydelig forsinket cscs tumorigent kapasitet når xenopodet i nakenrottehjerner.
Resultater
Uttrykk av nucleostemin i to menneske-glioblastom-avledet kreft stamcellelinjer
To kulturer beriket for kreft stamceller ble avledet fra menneskelige hjerne vevsprøver (prøver cscs-5 og cscs-7). Begge cellelinjer ble eksponentielt og dannet neurosfærer selv når sådd ut ved lav tetthet, noe som indikerer en sterk selvfornyelse kapasitet. Neurosfærene var positive til CD133 (figur 1A;. Grønt), nestin (fig 1A, red.), Sox2 (fig 1B;. Grønn) vimentin (Fig. 1B, rød), og nucleostemin (figur 1B;. Rosa) nevrale stamcellemarkører. Nucleostemin var til stede i kjernen av 88% av cscs-5 og cscs-7-celler, som bestemt ved immunofluorescens-analyser (fig. 1C). En stor andel av cellene (76%) var også positiv for CD133, og til og med høyere prosentandeler ble oppnådd for nestin, vimentin og Sox2 (over 95%), den sistnevnte er involvert i selvfornyelse og proliferasjon av stamceller. CD15 var en markør for 54% av cscs-5 og 69% for cscs-7. Den multipotency av disse to kulturene ble demonstrert som neurosfærene dyrket i differensieringsinduserende medium som vises typiske morfologiske differensiering mot alle tre neurale linjene – astrocytic, neuronal og oligodendrocytic, som bedømt ved positivitet for β-III-tubulin [34] og MAP2 ( neuronal) (fig. 1D rød, og S1 rød), GFAP (astrocytic) (fig. 1D grønn), og NG2 (oligodendrocytic forløper) (fig. S1 grønn) antigener hhv. Likevel er de differensierte cellene ikke løst ekspresjon av nucleostemin (fig. 1E), til tross for ikke uttrykker noen av de andre stemness beslektede gener (data ikke vist). Den karyotypic analyser viste flere endringer som gjenspeiler trans aktivitet, og clonogenicity analysene i myk agar indikert utvikling av mange kolonier.
A. Cscs-5 og cscs-7 Neurosfærene uttrykker CD133 (grønn) og nestin (rød). Scalebar: 50 pm. B. cscs-5 og cscs-7 celler som viser uttrykket og cellulær lokalisering av Sox2 (grønn), vimentin (rød) og nucleostemin (lilla). Scalebar: 10 mikrometer, og kvantitativ plot (C) av stamcellemarkører CD133, nestin, vimentin, Sox2, nucleostemin og CD15 i cscs-5 (grå) og cscs-7 (grønn). D. Neuron (β-III-tubulin, rosa-rød) og astrocytic (GFAP, grønn) differensiering kapasiteten cscs-5 og cscs-7. Scalebar: 50 pm. E. nukleolære nucleostemin uttrykk i stammen eller differentiatiated cscs-5 (grå) og cscs-7 (grønne) celler. F. Magnetisk resonans billeddannelse av
in vivo
tumorer utviklet fra cscs-5 og cscs-7 (gule pilspisser peker til tumoren), og Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse (G) av immunodeficent rotter, etter cscs-5 (rød) eller CSC-7 (grønn) ortotopiske xenografter.
Vi utforsket potensialet i både cscs-5 og cscs-7 for å danne svulster etter orthotopic xenogratf i immunodeficent rottehjerner. Etter å injisere 5 × 10
5 celler intrakranialt, begge cellelinjer dannet store svulster i 100% av tilfellene (n = 12 for cscs-5 og 11 for cscs-7), etterfulgt av magnetisk resonans imaging (MRI) (fig. 1F). Svulstene var svært infiltrerende (fig. S2). Explants fra disse hjernesvulst ble serielt transplantert inn i hjernen til andre nakne rotter og generert dødelige svulster som var like beriket i cscs, viser en høy evne til selvfornyelse. De gjennomsnittlige overlevelsestider vertene var 60 ± 4 dager med cscs-5 og 81 ± 11 dager for cscs-7 celler (Fig. 1 g). Histopatologiske analyser av xenotransplantater viste de generelle karakteristiske trekk ved GBM, som pseudopalisade og fokal nekrose, høyt celletall, høy ekspresjon av EGFR og høy proliferative indeks (MIB-1). Pasienter og xenoimplantater eksempler viser lignende ekspresjonsnivåer for alle markører, inkludert medium (pasient /xenograft 5) og lav (pasient /xenograft 7) uttrykk for p53, og meget lav, om noen, for p16 (fig. S3). Resultatene viser at de transplanterte tumorer i rottene var phenocopies av de opprinnelige pasientens tumor.
Karakterisering av de shRNAs utformet for å målrette humane nucleostemin
nucleostemin-genet har 15 eksoner, og som det gjennomgår alternativ spleising produserer tre forskjellige mRNA transkripter. Med unntak av ekson 1, disse variantene har lignende sekvenser. Derfor, for å utforme spesifikke primere for å banke ned alle tre varianter, har vi valgt primere i felles områder av eksoner 4, 10, 13 og 15 (fig. 2A). Vi målrettet nucleostemin av infeksjon med lentivirus uttrykke en shRNA mot nukleolært protein. Fem forskjellige shRNAs med perfekt komplementære sekvenser i den menneskelige nucleostemin mRNA ble introdusert til cscs-5 og cscs-7 celler. Tre av de fem shRNAs ble valgt for ytterligere karakterisering: shRNA18, shRNA20 og shRNA22. RT-PCR og western blot analyse viste at mens shRNA18 forårsaket en signifikant reduksjon i nucleostemin mRNA (78%) og proteinnivåer (51%), har både shRNA20 og shRNA22 ikke synes å påvirke nivåene av mRNA og protein, når normalisert til den tilsvarende respektive GAPDH (mRNA) og aktin (protein) kontroller (fig. 2B). Resultatene tyder på off-target binding av både shRNA20 og shRNA22. Alternativt kan relativt små reduksjoner av nucleostemin messenger nivåer via target effekt har dominerende effekter på en analyse om produksjonen er svært dose-sensitive til nivåer av dette bestemt protein. Vi har utviklet en analyse, basert på kolonidannelse i myk agar, for å skille mellom de to muligheter. Ekspresjonen av shRNA18 i cscs-5 eller cscs-7 hemmer ikke kolonidannelse i myk agar, mens ekspresjon av shRNA22, og i mindre grad shRNA20, drastisk redusert antall kolonier dyrket i denne type medium (Fig. 2C og 2D). Hvis shRNA22 var årsaken en mindre reduksjon i nucleostemin meldingen, og dette utløste en større hemming av vekst, fordi veien er involvert var svært følsomme for små nivå reduksjoner av messenger eller protein, bør vi forvente en lignende effekt når cellene enten infisert med shRNA18 alene, eller når cellene er infisert samtidig med både shRNA18 og shRNA22. Det vil si at et stort antall av kolonier som vokser. Derimot, hvis en sann off-target-effekten ble opererer her, vil resultatet av denne kombinasjonen være motsatt, som det virkelige målet vil være forskjellig fra nucleostemin, og vi vil observere så få kolonier som vokser i soft agar som de som observeres når shRNA22 ble anvendt alene. Infeksjon av celler med en lentivirus ikke bærer en shRNA ble anvendt som en kontroll. Målingen av antallet cscs-5 kolonier dannet i myk agar etter forskjellige kombinerte behandlinger ga de følgende resultater (figur 2E.): Et høyt antall kolonier for kontroll shRNA (shRNACo) og for kombinasjonen shRNACo + shRNA18, som forventet , og et lavt antall kolonier for både shRNACo + shRNA22, og shRNA18 + shRNA22. Utføre dette eksperimentet, var vi i stand til å skille mellom mulighetene for alle shRNAs rettet mot nucleostemin til forskjellige grader eller, den shRNA22 å ha et annet mål. Hvis effekten var på grunn av det lave nivået av inhibering, bør den ko-ekspresjon av shRNA18 og shRNA22 maskere virkningen av sistnevnte, ettersom shRNA18 ville hemme sterkere ekspresjon av nucleostemin genet. På den annen side, hvis effekten var off-target, setter vi pris konsekvensene av shRNA22 uavhengig av ekspresjonen av shRNA18. Resultatene viser klart at shRNA22 induserer sin virkning uavhengig av ekspresjonen av shRNA18, noe som indikerer at det på grunn av en off-target effekt. Vi har derfor utelukkes hypotesen om en svært liten reduksjon av nucleostemin av shRNA22 å ha en dominant negativ effekt på cellevekst. Vi tror at veksthemming effekten av shRNA22 i myk agar skyldes en
bona fide
utenfor mål effekt.
A. Skjematisk fremstilling av de 3 nucleostemin transkripsjons varianter og eksoner. Pilspisser peker til hver designet shRNA. B. Nucleostemin mRNA (rød) og protein (blå) kvantifisering i cscs-fem behandles med shRNACo, shRNA18, shRNA20 og shRNA22. C. shRNAs virkning på cscs-5 og cscs-7 soft agar-kolonidannende evne, og dens kvantitativ analyse (D). E. Brus agar kimtall i dobbel-infeksjoner å bestemme nucleostemin-spesifisitet shRNA22. ** P≤0.05; *** P≤0.001.
Nedbryting av nucleostemin ved shRNA18, reduserte ikke signifikant S-fasen cellepopulasjonen som indikert ved graden av BrdU-opptak etter en 15 minutter-puls (fig. 3A) eller den totale populasjon av celler sykling fanget av en 20 timer BrdU behandling (fig. 3B). De to andre shRNAs: shRNA20 og shRNA22, som har en meget lav, om noen, hemming av ekspresjon, viste en konsekvent lavere prosentandel av S-fasen og sykkel celler. Som demonstrert ved vekstkurve analyser, det totale antall celler infisert med kontroll lentivirus mangler shRNA-uttrykkende innsats (shRNACo) økt flere ganger i løpet av seks dager. De shRNA20 eller shRNA22 infiserte celler økte ikke i antall, eller til og med avta betydelig (fig. 3C og 3D), mens cscs infisert med shRNA18 oppførte seg mye nærmere å kontrollere celler enn til shRNA20 og shRNA22. Resultatene antyder en implikasjon av det primære målet for shRNA22, og i noe mindre grad til shRNA20 rammet, i å opprettholde vekst og overlevelse av menneskelig GBM-cscs. Vi er ikke sikker på om shRNA20 og shRNA22 dele et primært mål, til tross for fysisk nærhet av den opprinnelige shRNA20 og shRNA22 sekvenser i nucleostemin genet. Selv om bare 66 nukleotider skille disse to sekvenser, en menneskelig sekvens innretting søk tar hensyn til 66 nukleotider mellom dem viste ingen kamp foruten nucleostemin.
A. Antall fase-S eller total-sykling (B) cscs-5 (grå) og cscs-7 (grønne) celler behandlet med de ulike shRNAs. C. Antall levedyktige celler på DIV 0, 3 og 6 i cscs-5 og cscs-7 (D) som ble behandlet med de forskjellige shRNAs. ** P≤0.05; *** P≤0.001.
Den off-target shRNA20 og shRNA22, indusere apoptose gjenom CD133 + cscs og svekker neurosfære formasjon
Tilstedeværelsen av disse shRNAs påvirke ikke bare celleproliferasjon men også cellular overlevelse. Vi kvantifisert prosentandelen av apoptotiske celler i begge cscs-5 og 7 populasjoner følgende shRNACo, shRNA18, shRNA20 og shRNA22 lentiviral infeksjon. 7-AAD /annexin V-farging viste en preferensiell apoptose i CD133
+ celler i begge CSC-5 og 7 populasjoner (fig 4A og 4B.); de relative verdier i forhold til kontrollene for cscs-5 og cscs-7 er vist i tabell 1. Også den prosentandel av CD133
+ celler er redusert i både cscs-5 og cscs-7-populasjoner følgende shRNA20 og shRNA22 lentiviral infeksjon (fig. S4). Disse resultatene tyder på at det primære målet for shRNA22 og shRNA20 er en overlevelsesfaktor for GBM-cscs fortrinnsvis uttrykt i CD133
+ celler.
A. Apoptose indusert av shRNAs i cscs-5 og cscs-7 (B) CD133
+ (rød) eller CD133
– (blå) populasjoner. C. neurosfære forming-evne av cscs-5 og cscs-7 (D) celler, behandlet med de forskjellige shRNAs. ** P≤0.05; *** P≤0.001.
Å dele visse viktige kjennetegn ved normale stamceller, cscs er i stand til selvfornyelse, noe som gir vedvarende vedlikehold av denne undergruppe og utvidelse av den tilsvarende svulst. Neurosfære formasjon kapasitet etter behandling med de forskjellige shRNAs ble målt (fig. 4C og 4D). Praktisk talt ingen sfærer ble dannet av celler behandlet med shRNA22 og svært få av ShRNA20 behandlede celler i både cscs-5 og 7 populasjoner. Neurosfærer utviklet i 100% av kontrollgruppene. Disse resultatene, sammen med våre observasjoner som cscs mislyktes i å spre seg og gjennomgikk apoptose, tyder på at det primære målet for shRNA22 og shRNA20 er nødvendig for selvfornyelse av glioblastom kreftstamceller.
Den off-target shRNA22 reduserer den tumorigent potensialet i cscs-5
Vi har undersøkt effekten av å infisere cscs-5 celler med kontroll lentiviruses eller lentiviruses uttrykker shRNA22. Etter puromycin utvalg, ble 5 × 10
5 celler injisert inn i hjernen til nakenrotter. Alle dyr som bærer kontrollceller, dvs. celler infisert med tom lentivirus, (n = 3) utviklet store tumorer, etterfulgt av magnetisk resonans, og døde i 63 ± 1 dager, ikke svært forskjellig fra uinfiserte cscs-5 (61 ± 4 dager, n = 12). I motsetning til de dyrene injisert med celler som uttrykker shRNA22 (n = 6), utviklet betydelig mindre svulster, som er den midlere volum på 148 mm
3, mens middelverdien av tumorer som uttrykker shRNACo var 358 mm
3 (figur . 5A og 5B). Kaplan-Meier overlevelses plottet viser en signifikant forskjell mellom shRNACo og shRNA22 behandlet tumorceller, med en gjennomsnittlig overlevelse av sistnevnte på 71 ± 2 dager (Fig. 5C). Tilstedeværelsen og ekspresjon av shRNA22 i cscs ser ut til å være viktig for dempning av tumorprogresjon.
A. Kvantifisering av volumene av tumorer indusert med cscs-5 celler behandlet med shRNACo (svart) og shRNA22 (rød). B. Magnetisk resonanstomografi av representative eksempler på svulster etter ortotopiske xenotransplantater i nakne rotte-hjernen til cscs-5-celler bærer shRNACo eller shRNA22, og Kaplan-Meier overlevelse plott (C) av immunodeficent rotter inokulert med cscs-5 (mock, grå ), celler som bærer shRNACo (svart) og shRNA22 (rød). *** P≤0.001.
Effekten av shRNA22 synes ikke å være eksklusiv for cscs
Vi har forsøkt å bestemme effekten av shRNA22 i glioma celler uten CD133
+ stilk egenskaper som U87MG og U373MG humane glioma cellelinjer. Vi vurderte sin klonogene potensial ved myk agar assay følgende shRNACo og shRNA22 lentiviral infeksjon. Det ble observert en signifikant reduksjon i gjennomsnittlig antall kolonier når shRNA22 ble uttrykt i U373MG (ned til 1%), og til en mindre grad når den er i den U87MG gliomer cellelinje (ned til 41%) (fig. 6A). Vi målte også cellular overlevelse ved beregning av prosenten av apoptotiske celler i både U373MG og U87MG cellelinjer følgende shRNACo, og shRNA22 lentiviral infeksjon. 7-AAD /annexin V-farging avslørt fortrinnsrett apoptose i U373 celler i en lignende atferd til cscs. På den annen side, U87MG-celler viste seg ganske motstandsdyktig overfor apoptose (Fig. 6B). Resultatene tyder på at selv om shRNA22 kan dempe tumorvekst in glioma-celler i sin alminnelighet, kan dens innvirkning avhenger av celletype. Oppdagelsen av at shRNA22 effekten ikke er begrenset til cscs er viktig når du utformer strategier for å eliminere alle kreftcelletyper som bygger opp en svært heterogen tumor som glioblastom.
A. shRNAs effekt på U373MG (svart) og U87MG (grå) soft agar-kolonidannende evne. B. shRNAs-indusert apoptose i U373MG (svart) og U87MG (grå). ** P≤0.05; *** P≤0.001.
Forsøk på å identifisere den primære målet for shRNA22
Vi har gjennomført en genomisk søk etter sekvenser, annet enn nucleostemin, med forskjellig grad av homologi med shRNA22 nukleotider. For dette har vi brukt den grunnleggende lokale justeringssøkeverktøy (BLAST) og vi velger fire kandidater: PCLO, involvert i neurotransmisor utgivelse; HSPA13, medlem av chaperon familien HSP70; SEC22C, involvert i vesikulært trafikk; og CNOT1 relatert til transkripsjon og mRNA degradering. Av de 21 nukleotider, 14 var en perfekt match i alle tilfeller unntatt CNOT, med en 13 nukleotider kamp. Men ikke en av de fire kandidatene var det primære målet for shRNA22 målt ved QRT-PCR (data ikke vist) som ingen forskjeller ble observert i konsentrasjonen av sine mRNA menn i nærvær eller fravær av shRNA22 relatert til shRNACo.
for å finne ut genom-wide differensielt uttrykte gener i cscs-5 etter shRNA22 infeksjon, brukte vi Affymetrix Genechip Gene 1,0 ST Array System inneholder ca 28,869 menneskelige gener, deriblant tre utranslaterte område (UTR) av mRNA som kan være en målrette for binding i en mikro (mi) RNA-aktig måte. Som et resultat vi identifisert 182 genene nedregulert i cscs-5 som ble behandlet med shRNA22 i forhold til shRNACo (tabell S1). Som forventet, nucleostemin var ikke blant de nedregulert gener. Forsøk på å gruppere gener med shRNA22 hardt etter funksjon (basert på Gene Ontologi og signalveien data) avdekket nærværet av 26 gener involvert i regulering av transkripsjon av de dempede gener, og 56 DNA-bindende proteiner (Fig. 7A). Den signaltransduksjonsbane med flere gener nedregulert var den MAPK-reaksjonsveien kinaser (fig. 7B). Selv om resultatene så langt er ikke avgjørende, kan en indikasjon på at shRNA22 kan være involvert i å kneble en transkripsjonsfaktor innblandet i en av MAP-kinaser signal-trasé bli foreslått. Alternativt kan flere mål-effekter er også en sterk mulighet for shRNA22, på en lignende måte til mikro RNA.
A. Significative ned- (grønn), opp- (rød) og alle regulerte (blå) gener gruppert etter funksjon av biologiske prosesser, eller ved å tilhøre signalveier (B) indusert av shRNA22 i cscs-5 celler.
diskusjon
de likheter og forskjeller mellom SC’er og cscs har vært kilde til mye strid [35], [36], [37]. Hjerne cscs ligner nevrale SC’er i form av fenotype, alarm og oppførsel in vitro [38], men det er foreløpig uklart om cscs er, faktisk,
bona fide
stamceller. Eksperimentelle karakterisering av kreft stamcellepopulasjoner kan hjelpe i slike saker. I rotter, er nucleostemin høyt uttrykt i nucleoli av sentralnervesystemet SC’er, men ikke i sin differensiert avkom, som genet ser ut til å bli brått slås av under differensiering før terminale stadiene [22]. Våre observasjoner av nucleostemin blir uttrykt selv etter cscs ble tvunget til å differensiere i kultur, innebærer en ny signatur for cscs og en betydelig forskjell med SC’er, ikke tidligere rapportert.
Vi brukte en RNAi tilnærming til spesifikt fremme nedbrytning av nucleostemin mRNA. Forrige data har vist at å banke ned nucleostemin uttrykk forårsaket en alvorlig nedgang i celleproliferasjon i blæren kreftceller [39] og redusert sfæren dannende evne i menneskelige brystkreft stamceller [40]. En betydelig reduksjon i cellesyklusprogresjon i forskjellige typer av humane hjernesvulster og i humane glioblastom avledet cellelinjer ble også rapportert [41]. Imidlertid har vi funnet at den eneste shRNAi som effektivt reduserer protein, undertrykker ikke cellesyklusprogresjon, ikke avtar veksten av cscs kulturer, og reduserer ikke antall kolonier dannet i myk agar, sammenlignet med kontroller infisert med en tom lentivirus. Avvikene kan skyldes forskjeller i banket ned nivåer av nucleostemin oppnådd i tidligere rapporter (høyere enn 75%, og noen ganger mer enn 90%) og oss (51%).
RNAi teknologien har blitt mye brukt i pattedyrceller for å undertrykke ekspresjonen nivået av enkeltgener, og dermed hjelpe til å definere de funksjonelle roller gener, særlig ved sykdommer. Mye arbeid har sentrert rundt shRNA utforming algoritmer, med fokus på gen-target spesifisitet og effektivitet [42], [43]. Likevel off-target-effekter er utbredt, og de enkelte shRNAs har vist seg å ned-regulere en eller flere andre «uønskede» gener [44], [45], noen ganger ved å binde i en mikro (mi) RNA-lignende måte til tre «UTR av mRNA [46]. Vi fant enn shRNA22 er bindende for andre /s enn det tiltenkte målet genet. Off-target effekter rapportert i tidligere RNAi studier ble formidlet ved delvis komplementaritet mellom shRNAs og 3 «UTR av off-målgener, som involverer en heptamer eller heksamer «grunnlaget» kamp av shRNA strand ved 5» enden i posisjonene 2 til 8 eller 2 til 7, henholdsvis [46], [47]. Mekanismen er lik som miRNAs. Selv om BLAST-biblioteket som brukes inkluderte 3’UTRs av sendebudene ble en 7-nukleotid kamp parameter ikke inkludert i siktanalyse, som det ville representere en alvorlig avslapping av forholdene og en stor økning i mulige kamper. En vanlig primære målet for shRNA20 og shRNA22 antas, som sekvensene er bare 66 nukleotider fra hverandre i nucleostemin exon 10. Det er mulig at en nucleostemin sekvens inkludert shRNA22, regionen mellom de to shRNAs og shRNA20 (kanskje delvis), ville også være til stede i en genomisk region som koder for et annet protein som mRNA-sekundærstruktur vil være mer tilgjengelig for shRNA22 og shRNA20 enn en på nucleostemin mRNA. Likevel ble det ingen nye kamper ved siden nucleostemin funnet i en human genome-wide søk etter komplementære områder til de to-shRNA sekvenser og nukleotider mellom dem, utført ved hjelp av grunnleggende lokale justeringssøkeverktøy (BLAST).
genekspresjon profilering av cscs-5 i nærvær eller fravær av shRNA22 ikke utvetydig indikerer sitt primære mål. Snarere flere mål effekter er en rimelig mulighet for dette shRNA. Det største antall gener forstummet var knyttet til regulering av transkripsjon ved treff ble gruppert etter funksjon, og overrepresentasjon av gener involvert i MAPK signalveien ble nedregulert av shRNA22 uttrykk. Over-ekspresjon av ett eller flere gener av MAPK-signalveien er vanlig i glioblastomer, og flere små molekyler som hemmer PI3 kinase-Akt signalveien er i klinisk utvikling. Selv om mange av disse molekyler har vært effektiv i prekliniske modeller, er det fortsatt uklart hvorvidt denne strategien alene vil være tilstrekkelig til å avbryte de molekylære hendelser som initieres og opprettholdes ved å signalere langs trasé på grunn av aktiveringen av andre baner som kompenserer for inhibering av den måls kinase. Forsøk er nylig blitt gjort for å identifisere gener eller trasé som inaktivering, i kombinasjon med PI3K-inhibitorer PX-866 og NVPBEZ-235, kan resultere i en dødelig fenotype i glioblastoma multiforme-celler [48]. Det identifiserte shRNA22, når det uttrykkes i cscs fra pasienter med glioblastom, hemmer celledeling og selvfornyelse, induserer apoptose og reduserer deres karsinogent potensial betydelig når xenotransplanted inn i hjernen til nakenrotter. Det faktum at det primære målet for shRNA22 ikke er begrenset til cscs er viktig, fordi når forsøker å fjerne en svulst, må man også målrette tumor stromaceller og mikroglia fordi disse cellene bidra til tumor vedlikehold og progresjon. Bruken av denne shRNA alene eller i kombinasjon med andre rusmidler kan representere en potensiell klinisk terapeutisk strategi.
Materialer og metoder
erklæringen for dyr omsorg
Denne studien ble utført i henhold til de lover og retningslinjer for dyr omsorg og behandling i Spania (spansk kongelig resolusjon 1201/2005 BOE publisert 21 oktober 2005), og de fra EU (2003/65 /CE fra Europaparlamentet og Rådet juli 2003) . Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av den autonome universitetet i Madrid (tillatelse knyttet til prosjektet SAF 2009-07259 utstedt i Madrid 11
th mars 2009) og ved CBMSO institusjonelle biosikkerhet Committee. Alle operasjoner ble utført under isofluorane gassanestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
erklæringen for pasienten Samtykke
Vi har fått to nye kreftstamceller linjer (cscs-5 og cscs-7 ) fra primær glioblastom kirurgiske prøver fra pasienter som gjennomgår reseksjon for nydiagnostiserte gliom i samsvar med protokoller godkjent av Institutional Ethic komiteen i Ramón y Cajal Hospital. Skriftlig informert samtykke til å bruke overflødig vev for forskning ble innhentet fra hver pasient, og avidentifisert vev, for å beskytte anonymiteten, ble brukt (tillatelse knyttet til prosjektet SAF 2009-07259, utgitt i Madrid den 26
th februar 2009 Spania .)
erklæringen for microarray data
Alle data som presenteres her er MIAME kompatibel og rådata er blitt deponert i kompatibel database GEO (tilgangs~~POS=TRUNC nummer~~POS=HEADCOMP: GSE30448)
. Cell isolasjon og kultur
de nye kulturer, cscs-5 og cscs-7, ble etablert fra ferske kirurgiske prøver innsamlet direkte fra operasjonssalen i PBS pluss 0,6% glukose og umiddelbart fraktet på is til cellen kultur rom og behandlet som følger: tumor~~POS=TRUNC stykkene~~POS=HEADCOMP ble vasket og hakket fint med liten saks, de ble så inkubert i 0,1% trypsin og 0,04% DNase (type II, Sigma) i PBS i 1 time ved 37 ° C . Fordøyd vev ble vasket to ganger og mekanisk dissosiert ved å passere gjennom brann polert Pasteur pippetes.
