Abstract
Kjemoterapi motstand er den viktigste årsaken til svikt i eggstokkreft behandling. Én mekanisme bak chemo-motstand involverer oppregulering av multimedikamentresistens (MDR) gener (ABC-transportører) som effektivt transporterer (efflux) medikamenter ut av tumorcellene. Som et vanlig symptom i stadium III /IV eggstokkreft kreftpasienter, er ascites assosiert med kreft progresjon. Men om ascites stasjoner multiresistens i eggstokkreft celler venter oppklaring. Her viser vi at når dyrket med ascites avledet fra eggstokk-kreft-bærende mus, ble en muse-ovarie cancer cellelinje mindre følsom overfor paclitaxel, en første linje kjemoterapeutisk middel for ovarian kreftpasienter. Videre inkubasjon av murine eggstokkreft celler
in vitro
med ascites driver utstrømming funksjon i disse cellene. Funksjonelle studier viser ascites-drevet utstrømming er suppressible av spesifikke hemmere av ett av to ABC transportører [multidrug Relaterte Protein (MRP1); Breast Cancer Relaterte Protein (BCRP)]. For å demonstrere relevansen av våre funn til ovarian kreftpasienter, studerte vi relativ utstrømning i menneskelig eggstokkreft celler hentet fra enten pasient ascites eller fra primærtumor. Udødeliggjorte cellelinjer utviklet fra menneskelige ascites viser økt mottakelighet for utstrømming hemmere (MRP1, BCRP) sammenlignet med en cellelinje avledet fra en primær kreft i eggstokkene, noe som tyder på en sammenheng mellom ascites og utstrømming funksjon i menneskelig eggstokkreft. Effluks i ascites-avledet human ovarian cancer-celler er assosiert med økt ekspresjon av ABC-transportører, sammenlignet med den i primære tumor-avledede humane eggstokkreft celler. Samlet våre funn identifisere en ny aktivitet for ascites fremme eggstokkreft multiresistens
Citation. Mo L, Pospichalova V, Huang Z, Murphy SK, Payne S, Wang F, et al. (2015) Ascites Øker Expression /funksjon av multiresistens Proteiner i eggstokkreft celler. PLoS ONE 10 (7): e0131579. doi: 10,1371 /journal.pone.0131579
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA
mottatt: 5 desember 2014; Godkjent: 03.06.2015; Publisert: 06.07.2015
Copyright: © 2015 Mo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Alle data er som finnes i papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av CZ.1.07 /2.3.00 /30,0009, European Social Fund (VP) (https://ec.europa.eu/esf/home.jsp ), W81XWH-11-1-0469, Department of Defense Ovarian Cancer Research Program Award (SKM) (https://cdmrp.army.mil/ocrp/), Gail Parkins Ovarian Cancer Research Fund (SKM) (http: //www.ovarianawareness.org), Internal Reserve Fund ved Institutt for patologi, Duke University Medical Center (SVP). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Operativ svulst debulking utføres hovedsakelig på scenen i /II eggstokkreft pasienter. Denne kirurgiske prosedyren for avansert stadium sykdom (III til IV) er ikke alltid mulig, spesielt hos kvinner som har sykdommen er utstrakt [1]. Derfor er kjemoterapi det viktigste verktøyet for å blokkere spredning av kreftceller når klinikere behandle pasienter med avansert kreft stadier. Sammenlignet med normale celler, aktivt prolifererende kreftcellene er mer utsatt for en rekke cytostatika rettet mot ulike cellulære prosesser, inkludert DNA alkyleringsmidler, antimetabolitter, innføyings agenter og mitotiske hemmere [2].
Den første-linje kjemoterapi for eggstokkreft har vært uendret de siste ti årene, med den terapeutiske ryggraden består av et platina (vanligvis karboplatin) og et taxan (vanligvis paclitaxel) [3]. Andre linjer chemotherapies anses når pasienter responderer ikke på første linje narkotika. Et antall antineoplastiske midler har vist tilstrekkelig biologisk aktivitet for å bli betraktet rasjonelle andre linjer valg, for eksempel doksorubicin, etoposid, gemcitabin, ifosfamid, eller cyklofosfamid [4].
Chemo-motstand, karakterisert ved en redusert evne kjemoterapi for å hemme tumorvekst over tid, er den vanligste årsaken til avvikling cellegiftbehandling. Eggstokkreft tilbakefall er et direkte resultat av cellegift-motstand, forekommer hos mer enn 80% av høyverdig serøs eggstokkreft pasienter [3, 5]. Mekanismene bak chemo-motstand inkluderer: 1) oppregulering av multiresistens (MDR) gener som effektivt transporterer stoffer ut av cellen; 2) endring av medikament-metaboliserende enzymer, slik som de i glutation-s-transferase familien (GST); 3) unnslippe fra apoptose og økt DNA-reparasjon som følge av muterte tumorsuppressorgener [p53, brystkreft 1/2 (BRCA1 /2), og ataksi telangiectasia mutated (ATM) gener] [2]; og 4) nedskrivning av mitotisk spindel sjekkpunkt fører til motstand mot mikrotubulidynamikk hemmere [6].
En stor familie av 50 ulike ATP-bindende kassett (ABC) proteiner (ABC transportører) er dokumentert å utstrømming cytotoksiske molekyler, å redusere den intracellulære medikamentkonsentrasjonen [7, 8]. Blant ABC transportører assosiert med cellegift-motstand av eggstokkreft,
MDR1
genet, som koder for P-glykoprotein (P-gp, MDR1, ABCB1), er det mest studerte mekanismen. Andre vanlige ABC-transportører omfatter: MDR-assosiert protein 1 (MRP1, ABCC1) og brystkreft motstand protein (BCRP, ABCG2) [2]. Kortsiktig inkubasjon av eggstokkreft celler med kjemoterapikurer (f.eks doxorubicin, cisplatin og paclitaxel) på sine kliniske konsentrasjoner [9] øker MDR1 uttrykk nivåer. Spesielt demonstrere tilbakevendende eggstokkreft betydelig økt MDR1 forhold til primær eggstokkreft, med tilbakevendende pasienter som får platinum-taxaner som en standard for omsorg etter diagnostisering av deres primære kreft [10]. I likhet med MDR1 er MRP1 oppdaget hos ubehandlede primære ovarietumorer med varierende grad [11] og funnet oppregulert etter en trinnvis induksjon av cisplatin motstand i eggstokkreft cellelinjer
in vitro product: [12]. BCRP er induserbar i eggstokkreft cellelinjer ved langvarig inkubasjon med topotekan og gir resistens mot topotekan og mitoxanthrone [13, 14].
Ascites er et vanlig symptom i stadium III /IV eggstokkreft kreftpasienter og korrelerer med en dårlig prognose [15]. Ondartet ascites er kjent for å beskytte human ovarian cancer celler fra TRAIL-fremkalt apoptose som fører til en kortere sykdomsfri overlevelse av pasienter [16, 17]. Men lite er kjent om forholdet mellom tilstedeværelsen av ascites og cellegift-motstand i eggstokkreft. I denne studien undersøker vi hvordan ascites påvirker eggstokkreft celler i sine svar til paclitaxel og docetaxel, ledende taxan narkotika ansatt av klinikere i eggstokkreft behandling [3].
Materialer og metoder
Cell linjen og reagenser
ID8, en mus ovarialcancer cellelinje [18], var en slags gave fra Dr. Kathy Roby ved Kansas University Medical Center. Mycoplasma forurensning screening ved hjelp av Gen-Probe nukleinsyre hybridisering ble utført ved Duke Cancer Institute Cell Culture Facility i april 2010. ID8 celler ble opprettholdt i DMEM (høy glukose, Gibco-Life Technologies [Gibco]; Carlsbad, CA) som inneholder 4% føtalt bovint serum, penicillin (100 enheter /mL) + streptomycin (100 ug /ml) (Invitrogen Life Technologies-[Invitrogen], Carlsbad, CA). HA1 og HA2 ble utviklet av SV40 T antigen-immortalization av menneskelige eggstokkreft celler hentet fra ascites [HA1 linje avledet fra ascites (6116) fra primærkirurgi serøs karsinom, dårlig differensiert; HA2 linje avledet fra ascites (OV 186) fra primærkirurgi serøs papillær cystadenocarinoma]. TD celler ble utviklet av SV40 immortalization av menneskelige eggstokkreft celler fra primærkirurgi høy klasse serøs adenokarsinom vev (primær peritoneal carcinoma) (6114)]. Disse cellelinjene ble holdt i DMEM (høy glukose, Gibco) inneholdende 10% føtalt bovint serum og 1 x penicillin streptomycin. De identifiserte kreft og ascites prøver brukes til å lage udødeliggjort cellelinjer ble samlet etter donor levering av skriftlig informert samtykke, av hertugen gynekologisk onkologi Tumor Bank (Pro00013710) og brukt i denne studien i henhold Duke IRB-protokollen Pro00027325. Paclitaxel (T7191) og docetaxel (01885) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Menneske eggstokkreft cellelinjer ble opprettholdt for maksimalt to passeringer før analysen.
Murine ascites forberedelse
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for Pleie og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care Bruk Utvalget ved Duke University (protokollnummer: A295-12-11). Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse. Kvinne 6-8 uker gamle C57BL /6 mus (Charles River, Raleigh, NC) ble brukt. ID8 celler (1-10×10
6) ble injisert i mus peritoneum. Etter ascites akkumulering, ble musene avlivet. Peritoneal væske ble oppsamlet og sentrifugert to ganger ved 500 x g i 5 minutter for å separere de cellulære og acellulære fraksjoner. Acellulære fraksjoner fra flere mus ble slått sammen og filtrert gjennom 0,22 um sterilfilter. De 50% ascites behandlingsforhold ble normalisert til normale kultur forhold med hensyn til FBS, glukose og antibiotikakonsentrasjoner.
flowcytometrisk analyse med Grønn utstrømning ID Dye
Funksjonene for multiresistens proteiner MDR1 , MRP og BCRP ble analysert ved eFluxx-ID Grønn multiresistens Assay Kit (ENZ-51029-K100, Enzo Lifesciences, Farmingdale, New York) i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk ble enkeltcellesuspensjoner høstet ved trypsin telles, et likt antall celler (500000 /tilstand) ble resuspendert i fullstendig medium inneholdende specificinhibitors eller deres kombinasjoner (eller DMSO som fortynningsmiddel kontroll) andincubated i 10 minutter ved 37 ° C. Kilder /sluttkonsentrasjoner på inhibitorer er som følger: Verapamil (MDR1 inhibitor; Sigma V4629; 40 uM); MK-571 (MRP1 inhibitor, Sigma M7571; 100 mm); Novobiocin (BCRP inhibitor, Sigma N1628, 200 nm). Grønt fargestoff ble deretter tilsatt og inkubert ved 37 ° C i 40 min. Celler ble vasket en gang i PBS før FACS datainnsamling ved hjelp av et Guava Easycyte Plus-instrument (Millipore, Billerica, MA), ble 7-AAD benyttes for å ekskludere døde celler fra analysen. Data ble analysert ved hjelp FlowJo_V10 programvare (Ashland, Oregon)
Beregning av multiresistens aktivitet faktor
Den multiresistens aktivitet faktor (MAF) for hver transportør, ble beregnet ved hjelp av følgende formler:. Hvor F er det geometriske gjennomsnittet av fluorescens intensitet (GMFI), F
0 – uten inhibitor, F
MDR1 – med MDR1-hemmer, F
MRP – med MRP-hemmer, F
BCRP – med BCRP inhibitor
Rhodamine 123 retention analysen
Drug efflux funksjon ble bestemt i ubehandlede og ascites behandlet ID8 celler ved rhodamine 123 oppbevaring analyser [18]. ID8 celler oppnådd fra normal kultur, fra 7-dagers forbehandling ascites kultur eller fra ascites
in vivo
ble sådd på 40.000 celler pr brønn i 6-brønners plater og tillatt å feste over natten. Disse cellene ble deretter inkubert med rhodamin 123 i 30 min. Celler fra hver betingelse ble deretter vasket med PBS og inkubert med vanlig medium i 2,5 timer. Fluorescent bildene ble tatt på en eksitasjon λ = 485 nm og emisjon λ = 530 nm ved hjelp av BioTek Cytation3 Imager (Winooski, VT) ved 0 min (etter fargestoff fjerning og PBS vask) og på 2,5 timer timer etter Rhodamine 123 fjerning. Forsøkene ble uavhengig gjentatt tre ganger
Real-Time kvantitativ RT-PCR
Total RNA fra celler ble hentet ved hjelp av Qiagen RNeasy Micro kit i henhold til produsentens protokoll. (Qiagen, Valencia, CA) og behandlet med RNase-fri DNase for å fjerne eventuelle rester av genomisk DNA. Enkelt-trådet cDNA ble syntetisert ved inkubering av total RNA (1 pg) med RNase H-revers transkriptase (500 U), oligo- (dT) 12-18 primer (100 nM), dNTPs (1 mM), og RNase-inhibitor ( 40 U) ved 42 ° C i 1 time i et endelig volum på 20 ul. Avskrift First Strand cDNA Synthesis Kit ble kjøpt fra Roche Applied Science (Indianapolis, IN). Q-PCR primere for mus
Abcc1
,
Abcb1a
,
Abcb1b Hotell og
beta-Actin
ble kjøpt fra Origene (Rockville, MD). Kvantitativ real-time PCR ble utført for å sammenligne uttrykk nivåer av totalt RNA hver prøve. Sanntids-PCR på Mx3005P QPCR System (Stratagene, La Jolla, CA) ble utført i nærvær av 12,5 ul VeriQuest Fast SYBR grønn qPCR Master mix (2x) (USB, Cleveland, OH) og 2 pl cDNA, og H
2o ble lagt til et sluttvolum på 25 ul. Sanntids-PCR ble utført med en innledende denatureringstrinn av 5 min ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser på 3 sek ved 95 ° C, 30 s ved en glødetemperatur på 60 ° C. PCR-produktene ble overvåket i sann tid ved å måle økningen i fluorescens forårsaket av binding av SYBR grønn I Dye. Betydning ble analysert ved hjelp av programvarepakken MxPro QPCR programvare (Stratagene, La Jolla, CA).
Western blot
Celler ble høstet ved hjelp av trypsin-EDTA og vasket med PBS. Høstede cellene ble inkubert i totalt lyseringsbuffer (50 mM Tris pH 7,5, 1% SDS) pluss protease og fosfatase-inhibitor cocktail (Halt, Thermo Scientific). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved BCA-analyse. Ekvivalente mengder av protein, ble underkastet SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) og immunoblottet. Blottene ble inkubert med følgende primære antistoffer, etterfulgt av de aktuelle artene IRDye-konjugert sekundært antistoff (Life Technologies, Carlsbad, California): MDR1 (BIOSs; Cat # 1468R); MRP1 (Biorbyt Cat # ORB76148); BCRP (Biorbyt Cat # ORB10178); beta aktin (Sigma Cat # SAB5500001). MDR1, MRP1, BCRP proteiner ble oppdaget ved hjelp av Odyssey infrarød bildesystem (LI-COR, Lincoln, NE). Proteinbånd ble kvantifisert ved hjelp av Image J programvare (NIH, Bethesda, MD), og det relative forholdet mellom protein av interesse til beta-aktin lasting kontroll ble beregnet.
proliferasjonsanalyser
Celler ble sådd ved 2.5×10
3-celler per brønn i 96-brønners plater og tillatt å vokse over natten. Cellene ble vasket en gang med serumfritt DMEM. Cellene ble deretter inkubert med forskjellige konsentrasjoner av paclitaxel eller docetaxel fortynnet i 200 ul DMEM i 24 timer. De ascites behandlet ID8 celler eller ID8 celler høstet fra ascites fikk behandlinger fortynnet i 200 mL 50% ascites supernatant. Ved 18 timer, 0,5 uCi [
3H] -tymidin (Perkin-Elmer, Waltham, MA) ble tilsatt til hver brønn. Etter 8 timer ble mediet fjernet og cellene ble dissosiert i 10X trypsin-EDTA og høstet ved anvendelse av en 12-kanals microharvester (Skatron Instruments, Norge). Prøvene ble tellet i en væske-scintillasjons-spektrofotometer. Alle betingelser var i fire eksemplarer, og hvert eksperiment ble gjentatt minst to ganger.
7-AAD-farging
ID8 celler fra forskjellige forbehandlinger ble sådd ut ved 4×10
4 celler per brønn og tillatt å vokse over natten i 6-brønns plater. De ble vasket en gang med serumfritt DMEM. Cellene ble deretter inkubert med forskjellige konsentrasjoner av paclitaxel eller docetaxel fortynnet i 2 ml DMEM i 4 dager. Ascites behandlet ID8 celler eller ID8 celler høstet fra ascites fikk behandlinger fortynnet i 2 ml 50% ascites supernatant. Ved slutten av behandlingene ble celler høstet ved trypsinering og farget med 7-AAD (BD Biosciences) i henhold til produsentens protokoll, etterfulgt av analyse på en Guava Easycyte Plus-instrument (Millipore) og analysert ved FlowJo_V10 programvare.
statistisk analyse
Graf visualisering, datatransformasjon og statistisk analyse (tosidige uparet t-test eller Toveis – ANOVA) ble utført ved hjelp av Prism (versjon 5.0, GraphPad programvare) og Microsoft Office Excel (versjon 2010, Microsoft ).
Resultater
ascites øker ID8 celle kjemoterapi motstand
Vi testet effekten av ascites på eggstokkreft celle motstand mot paclitaxel, en første linje kjemoterapeutisk middel. Sammenligning ble utført mellom 1) ID8 celler dyrket i normalt dyrkningsmedium, 2) ID8 celler ferskt isolert fra ascites fluid i en syngen modell, og 3) ID8-celler ble behandlet i 7 dager
in vitro
med ascites supernatant avledet fra ID8 bærende mus. Kjemoterapi doseringen ble optimalisert for et utvalg for å oppnå 0 til 95% hemming av cellevekst, som målt ved [
3H] -tymidin-inkorporering. Både ID8 celler behandlet i 7 dager med ascites supernatant og celler ID8 ferskt isolert fra ascitesvæske var mer resistente overfor paclitaxel enn ID8 celler dyrket i normalt medium, som målt ved [
3H] -tymidin-inkorporering analyse (figur 1A). For å validere hypotesen om at ascites stasjoner eggstokkreft celle chemo-motstand, vi neste studert responsen av eggstokkreft celler (+/- ascites behandling) til en annen kjemoterapeutisk reagens i taxan familien (docetaxel). Spesielt, ID8-celler ble behandlet i 7 dager med ascites supernatant, samt ID8 celler ferskt isolert fra ascitesvæske var signifikant mer motstandsdyktig mot docetaxel enn ID8 celler fra normal kultur (figur 1B).
Murine eggstokkreft celler ( ID8) fra tre forskjellige kilder, ble undersøkt: 1) ID8 celler fra normal kulturmedium (medium), 2) ID8 celler ferskt isolert fra ascites fluid i en syngen modell (
in vivo
celler), og 3) ID8 cellene ble behandlet i 7 dager
in vitro
med ascites supernatanten (ascites ble behandlet 7 dager). Hver av disse cellepopulasjoner ble utsatt for paclitaxel (A) eller docetaxel (B) ved den angitte konsentrasjon i 24 timer og [
3H] -tymidin-inkorporering ble bestemt. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og et representativt resultat er vist. Feil stolpe representerer SD av quadruplicates i hver tilstand. * Indikerer p 0,05, *** p 0,001, Toveis ANOVA. A. ID8-celler forbehandlet med acellulære ascites i 7 dager (Ascites ble behandlet 7 dager) eller isolert fra ascites (
in vivo
celler) har øket resistens overfor paclitaxel sammenlignet med ID8 celler fra normal medium. B. ID8-celler forbehandlet med acellulære ascites i 7 dager (Ascites ble behandlet 7 dager) har øket resistens overfor docetaxel ved 2 og 4 nM sammenlignet med ID8 celler fra normal kultur. ID8 celler isolert fra ascites (
in vivo
celler) har økt motstand mot docetaxel sammenlignet med ID8 celler fra normal medium (Medium). C-D. 7-AAD-opptaket ble målt ved flowcytometrisk analyse. De prosentvise 7-AAD-positive celler fra tre uavhengige eksperimenter er vist for paclitaxel (C) og docetaxel (D)-behandlede celler. Feilfelt representerer SD. * Indikerer p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, Toveis ANOVA. ID8 celler forbehandlet med acellulære ascites i 7 dager (Ascites behandlet 7 dager) er mer motstandsdyktig mot kjemoterapi-indusert celledød (
i
.
e
., Utstillings færre 7-AAD + celler ) enn ID8 celler fra normal kultur.
De ovenfor angitte data indikerer at ascites øker eggstokkreft celle chemo-motstand, som vurdert ved hjelp av en [
3H] -tymidin-inkorporering assay, som er et mål av celleproliferasjon. Vi neste søkt å bestemme hvorvidt ascites beskytter eggstokkreft celler fra kjemoterapi-indusert celledød ved å utføre 7-AAD farging. Som vist i figur 1C og 1D, ID8-celler ble behandlet i 7 dager med cellefrie ascites ble beskyttet mot både paclitaxel- og docetaxel- indusert celledød, noe som gir ytterligere bevis på at ascites supernatanten fremmer ovariecancer chemo-resistens.
Ascites driver utstrømming i ID8 celler
Vi neste undersøkt utstrømming funksjon i ascites behandlet eggstokkreft celler ved hjelp av to narkotika efflux analyser (utstrømming ID grønt fargestoff og rhodamin 123) [18]. Utstrømningen ID grønne analyse tiltak fluorescens intensitet etter inkubasjon celler med fluorescerende fargestoff. 2A viser redusert fluorescens intensitet både ascites pre-behandlede ID8 celler og ID8 celler isolert fra ascites (syngene mus modell) sammenlignet med fluorescens intensitet i ubehandlede celler. Disse resultatene tyder på at ascites fremmer utstrømning funksjon i eggstokkreft celler. Vi målte neste retensjon av rodamin 123 fargestoff i ID8 celler (+/- ascites behandling). Som vist i figur 2B og 2C, 2,5 timer etter fjerning rhodamin, hadde ubehandlede ID8 cellene beholdt fargestoff. I motsetning til dette, ble signifikant redusert nivå av fargestoffet påvises i ascites-celler preinkubert ID8, støtter den konklusjon at ascites-behandlede tumorceller som oppviser øket effluks. Sammen disse resultatene tyder på at ascites driver eggstokkreft efflux mekanismer.
(A). Efflux funksjon ble målt ved utstrømning ID grønne fargestoff assay. ID8 celler isolert fra normal kultur, erholdt etter 7 dagers behandling ascites, eller isolert fra ascites (
in vivo
-celler) ble inkubert med dyseutstrømningen ID grønne fargestoff i 40 minutter, slik at cellene til opptak og efflux dette fargestoff. ID8-celler forbehandlet med ascites beholdt mindre fargestoff i forhold til ID8 celler fra normal kultur, noe som indikerer en økt utstrømning funksjon. (B). Efflux funksjon ble målt ved hjelp av rhodamin 123-analysen. ID8 celler oppnådd fra normal kultur, fra 7-dagers forbehandling ascites kultur eller fra ascites
in vivo
ble inkubert med rhodamin 123 i 30 minutter. Deretter celler fra hver betingelse ble vasket med PBS og inkubert med vanlig medium i 2,5 timer. Fluorescent bildene ble tatt på 0 min (etter fargestoff fjerning og PBS vask) og på 2,5 timer timer etter Rhodamine 123 fjerning. Kvantifisering av fluorescens-intensitet (minus bakgrunn) i hver gruppe er vist i (C). Tre uavhengige eksperimenter ble utført og et representativt resultat er vist. Feil stolpe representerer SD fluorescerende intensitet måle hver celle i hvert bilde. * Indikerer p. 0,05, t-test
Ascites behandling øker uttrykk for multiresistens relaterte transportører
Vi studerte uttrykket av tre ABC transporter gener (MDR1, MRP1 og BCRP) som vanligvis er involvert i kreft-kjemoterapi-motstand. Vi utførte kvantitativ real-time PCR (q-PCR) på RNA høstet fra celler og ID8 ID8 celler forhåndsbehandlet med ascites. Ubehandlede ID8 cellene uttrykte både MRP1 og BCRP mRNA (fig 3A). Etter behandling med ascites
in vitro
i 7 dager, ID8 celler oppviste betydelig økt ekspresjon av MDR1a (118- ganger), MDR1b (75-ganger), og BCRP (17-ganger) (figur 3A og 3B) .
Total RNA ble høstet fra ID8 celler i normal kultur samt fra ID8 celler forbehandlet med ascites i 7 dager. Ekspresjonsnivåene av de angitte genene (i forhold til beta-aktin) ble bestemt ved sanntids-PCR (A). Fold økning av genekspresjon (ascites behandlede ID8 celler enn normale celler ID8) er vist i B. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og feilfelt representerer SD. * Indikerer p 0,05 og *** p. 0,001, t-test
hemmere av multiresistent relaterte transportører redusere utstrømming effektivitet i ascites-forbundet eggstokkreft kreftceller
etter demonstrere oppregulert MDR-relaterte ABC transportører i ascites behandlet eggstokkreft celler, ved siden søkte vi å finne ut av hvilke hemmere av disse transport hindre utstrømming i disse cellene. Vi studerte tre MDR transporter hemmere: verapamil (MDR1 hemmer), MK-571 (MRP1 /2-hemmer), og novobiocin (BCRP inhibitor). Først inhibitor virkninger på utstrømning funksjon i ID8 celler dyrket i normalt medium ble bedømt. Inhibitorene ble tilsatt til cellene i 10 minutter før tilsetningen av dyseutstrømningen ID grønt fargestoff. Som vist på fig 4A og 4B, hemmer bare den MRP1 øket fluorescens intensitet av effluks ID drivhus merket ID8 celler. Disse resultatene indikerer at ubehandlede ID8 eggstokkkreftceller støtter MRP1-avhengig utstrømning, men ikke MDR1 eller BCRP-avhengig utstrømning. Neste vi studert effekten av disse hemmere på utstrømming funksjon i begge ascites behandlet ID8 celler og i ID8 celler isolert direkte fra ascites (
in vivo
celler). MDR1 hemmer ikke øke fluorescens i ID8 cellene pre-inkubert med ascites i 7 dager
in vitro
. Men MDR1 inhibitor gjorde øke fluorescens i ID8 celler isolert fra ascites
in vivo plakater (fig 4A og 4B). Tilsetting av enten MRP1 hemmer eller BCRP inhibitor betydelig økt fluorescens (MAF) i begge ascites-behandlede ID8 celler og i ascitesceller (
in vivo
) (figur 4B). Vi viste også at kombinasjoner av disse inhibitorene ikke økte fluorescensintensiteten av efflux ID grønn-merkede ID8 celler eller ascites-behandlede celler enn fluorescensintensiteten oppnås med enkle inhibitorer, noe som tyder på at aktiviteten av de individuelle transportører er ikke kompensert for av andre transportører ( data ikke vist). Sammen er disse data tyder på at ascites fremmer MRP1 og BCRP-avhengig utstrømning i ID8 eggstokkreft celler.
(A). ID8 celler fra normal kultur, ascites forbehandling kultur, eller ascites (
in vivo
celler) ble behandlet med eller uten inhibitorer er målrettet mot MDR1, MRP1 eller BCRP i 10 minutter og deretter inkubert med dyseutstrømningen ID grønne fargestoff for 30 min. fluorescensintensitet av hver tilstand ble målt ved flow-cytometri. Multiresistens aktivitetsfaktor (MAF) ble beregnet for hver prøve, og bety MAF (+/- SD fra triplikate prøver) er vist for hver tilstand i B. MAF-verdier som faller under bakgrunn er angitt med grå kant. Statistisk signifikant økning i MAF mellom ascites-behandlede og
in vivo
ascitesceller (sammenlignet med ubehandlede celler) er angitt. Feilfelt representerer SDS fra tre uavhengige forsøk. * Indikerer p. 0,05, t-test
Menneskelige eggstokkreft celler hentet fra ascites, men ikke tumor-avledet eggstokkreft celler, utstillings utstrømming funksjon
Neste, vi søkte å utvide våre funn til menneske eggstokkreft celler. Vi studerte udødeliggjort menneskelige eggstokkreft celler avledet fra pasient ascites (HA1, HA2 celler) eller fra den primære svulsten nettstedet (TD celler). Bruke utstrømming ID grønn analysen, viste vi at HA1 og HA2 celler viste høyere utstrømming enn TD celler (figur 5A og 5B), utlån støtte til våre opplever at ascites stasjoner utstrømningen funksjon av eggstokkreft celler. Western blotting ble utført for å undersøke utstrømning protein ekspresjon i disse tumor-avledede og ascites-avledet human ovarian cancer-celler. Som vist i figur 5C, ekspresjon av MDR1, MRP1 og BCRP var signifikant høyere i ascites-avledet tumorcellelinjer (HA1, HA2) enn i en primær tumor-avledet cellelinje (TD). For å finne ut hvilke efflux proteiner var funksjonell i disse cellene, vi neste undersøkt effekten av MDR-hemmere på utstrømming i tumor-avledet og ascites-avledet humane eggstokkreft celler. MRP1 og BCRP inhibitorer, men ikke en MDR1 inhibitor, undertrykkes fargestoff-utstrømning i HA1 og HA2-celler signifikant. I kontrast, gjorde hemmere av MDR1, MRP1 og BCRP ikke påvirke fargestoff oppbevaring i TD celler (figur 5D og 5E). Vi viste at kombinasjoner av disse inhibitorene ikke økte fluorescensintensiteten av TD-celler (data ikke vist), noe som tyder på at aktiviteten av enkelte transportører er ikke kompensert for av andre transportører. Disse funnene indikerer ascites-avledet humane eggstokkreft celler, men ikke primære tumor-avledede celler, støtter ABC transporter-avhengig utstrømning.
A og B. Udødelig menneskelige eggstokkreft celler avledet fra pasient ascites (HA1 og HA2 celler ) eller primær tumorstedet (TD-celler) ble inkubert med dyseutstrømningen ID grønt fargestoff i 40 min. Fluorescensintensitet for hver tilstand ble målt ved flow-cytometri. Histogram for hver kreftcellelinje avledet fra pasientens ascites (HA1 eller HA2, blå) er belagt med histogram av den primære tumor-avledede linje (TD; rød)). B. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) ble beregnet for hver linje fra tre uavhengige eksperimenter. Fold reduksjon i geometrisk midlere fluorescensintensitet (GMFI) (i forhold til tumor-avledet linje) ble beregnet for hver cellelinje i tre uavhengige forsøk. Resultatene er rapportert som gjennomsnittet gangers nedgang fra tre uavhengige forsøk som ble behandlet (+/- SD). C. Total cellulære ekstrakter ble oppnådd fra en primær tumor-avledet human ovarian cancer cellelinje (TD) og fra hver av to ascites-avledet human ovarian cancer-cellelinjer (HA1, HA2). Ekvivalente mengder av ekstraherte proteiner ble underkastet SDS-PAGE og immunblotted med antistoffer som er spesifikke for MDR1, MRP1, BCRP, eller beta-aktin, etterfulgt av de aktuelle arter IRdye-konjugert sekundært antistoff. Proteinbånd ble påvist ved Odyssey infrarød avbildning. Proteinbåndene ble kvantifisert ved hjelp av Image J programvare (NIH). Prosenter av det angitte protein til beta aktin vises. D og E. ascites-avledet og tumor-avledede humane cellelinjer ble inkubert med eller uten inhibitorer er målrettet mot MDR1, MRP eller BCRP i 10 minutter og deretter inkubert med dyseutstrømningen ID grønne fargestoff i 30 minutter. Prøvene ble analysert ved strømningscytometri. Histogrammer (+ inhibitor vs – inhibitor) ble overlagt for hver linje (D). E. multiresistens aktivitetsfaktor (MAF) ble beregnet for hver prøve, og bety MAF (+/- SD) fra tre uavhengige eksperimenter er vist for hver tilstand i E. MAF-verdier som faller under bakgrunn er angitt i grått. Statistisk signifikant økning i MAF mellom ascites-behandlede og
in vivo
ascitesceller (sammenlignet med ubehandlede celler) er angitt. * Indikerer p 0,05. ** Indikerer p. 0,01, t-test
Diskusjoner
eggstokkreft celler utvikler resistens mot cellegift etter kortsiktig [7] eller langsiktig [12, 14] behandling med cellegifter. Begge ondartede ascites [15] og kjemo-motstand [19] er forbundet med redusert overlevelse av ovarian kreftpasienter. I denne studien, viser vi at murine eggstokkreft celler (ID8) viser økt taxan cellegift-motstand når de utsettes for ascites
in vitro
eller
in vivo product: (i forhold til ID8 celler dyrket i normalt medium ). Så vidt vi vet, er vårt arbeid den første til å direkte demonstrere induserbar cellegift-motstand ved ascites supernatant.
Til dags dato, ingen studier har undersøkt en sammenheng mellom tilstedeværelsen av ascites [15] og MDR transport [20-22 ], selv om hver er en uavhengig risikofaktor for å forutsi dårlig prognose for ovarian kreftpasienter. Studier har preget uttrykket nivået av MDR transporter på primære eller tilbakevendende eggstokkreft vev [10] eller MDR1 polymorfisme og kreft progresjon eggstokkene eller overlevelse [23]. Vår studie er romanen i å antyde at ascites er i stand til å drive uttrykk og funksjon av MDR transportører.
