Abstract
mirnas spiller viktige roller i tumorigenesis. Denne studien fokuserer på å utforske effekter og Reguleringen av miRNA-137 på de biologiske atferd av magekreft. Total RNA ble ekstrahert fra vev av 100 pasienter med magekreft og fra fire mage cancer-cellelinjer. Uttrykk av MIR-137 ble oppdaget av real-time PCR fra 100 pasienter. Virkningene av MIR-137 overekspresjon på magekreft cellenes proliferasjon, apoptose, migrering og invasjon evne ble undersøkt in vitro og in vivo. Målet genet av MIR-137 ble spådd av Targetscan on line programvare, skjermet av dual luciferasereportergenet analysen og demonstrert av western blot. Som et resultat av ekspresjonen av MIR-137 ble signifikant redusert i magekreft cellelinje HGC-27, HGC-803, SGC-7901 og MKN-45, så vel som i magekreft vev sammenlignet med GES-1 celle eller matchet tilstøtende ikke- -neoplastic vev (
p
0,001). Den gjeninnføring av MIR-137 inn i magekreftceller var i stand til å inhibere celleformering, migrering og invasjon. In vivo eksperimenter viste at MIR-137 overekspresjon kan redusere magekreft celleproliferasjon og metastasering. Bioinformatiske og western blot analyse indikerte at MIR-137 fungerte som tumor suppressor roller på magekreftceller gjennom målretting akt2 og videre påvirker Bad og GSK-3β. I konklusjonen, Mir-137 som er ofte nedregulert i magekreft er potensielt involvert i magekreft tumorigenesis og metastase ved å regulere akt2 relatert signalveier
Citation. Wu L, Chen J, Ding C, Wei S, Zhu Y, Yang W, et al. (2015) mikroRNA-137 Bidrar til Dempet tumorigenesis i Human Gastric Cancer av målretting akt2. PLoS ONE 10 (6): e0130124. doi: 10,1371 /journal.pone.0130124
Academic Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA
mottatt: 15 august 2014; Godkjent: 18 mai 2015; Publisert: 23 juni 2015
Copyright: © 2015 Wu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. Dette arbeidet ble støttet av medisinsk vitenskap og teknologi forskningsprosjekter i Henan-provinsen, Kina (2011030004)
Konkurrerende interesser: forfatterne har erklærte at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den nest hyppigste årsaken til død av kreft i verden [1]. Så langt er mekanismen av magekreftutvikling i stor grad ukjent. Forskerne har forsøkt å studere GC fra visningen av biokjemi og molekylær biologi at noen tumorsuppressorgener og kreftrelaterte gener har blitt rapportert i GC. MicroRNAs (mirnas) er endogent små ikke-kodende RNA av 18 ~ 22 nukleotider som har blitt identifisert som posttranskripsjonelt regulatorer av genuttrykk [2, 3]. Mirnas spiller avgjørende roller i mange biologiske prosesser som proliferasjon, utvikling, differensiering og apoptose. I mellomtiden mirnas har blitt validert for å fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener under tumorigenesis. For eksempel ble MIR-31 er identifisert som en onkogen i esophageal plateepitelkarsinom [4] og MIR-451 fungerer som en tumor suppressor i menneskets ikke-småcellet lungekreft [5]. Det er også mange microRNAs ble identifisert i forbindelse med magekreft skjer og utvikling [6-13]. Det har også blitt rapportert at over-uttrykk for MIR-1, MIR-20a, MIR-27a, MIR-34a og MIR-423-5p kan brukes som diagnostiske kriteriene for magekreft [14] .Derfor, miRNAs er potensial kandidater av nye diagnostiske biomarkører eller terapeutiske mål av magekreft.
mikroRNA-137 (MIR-137) har blitt rapportert å være nedregulert og spille roller som en tumor suppressor i tykktarmskreft og kreft i munnhulen [15, 16]. Men funksjonen av MIR-137 og dens mekanisme underliggende magekreftutvikling er fortsatt ikke helt klart. Chen et al viste at MIR-137 kan spilles som en tumor suppressor ved å målrette CDC42 å regulere cellesyklus i magekreft [17]. Likevel er det klart for oss at mikroRNA regulerer biologiske oppførsel av flere sti måte at det ikke kan være mer Reguleringen av MIR-137 mot GC tumorigenesis. I denne studien målte vi uttrykk for MIR-137 i 100 pasienter med magekreft og undersøkt rollene til Mir-137 i mage kreftceller. Vi fant noen andre funksjoner av MIR-137 i GC samt annen sti måte som MIR-137 spilte en rolle tumor suppressor i GC tumorigenesis.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle menneskelige studier har blitt godkjent av relevante etiske komité og har derfor blitt utført i samsvar med de etiske standarder. Alle personer ga sitt samtykke før inklusjon i studien.
Pasienter og prøver
Menneskelige magekreft prøver ble samlet inn fra kirurgiske prøver fra 100 pasienter (mannlig 56, kvinne 44) med GC ved Cancer Institute og Hospital, First Affiliated Hospital Henan University, Second Hospital av Folkets frigjøringshær i Kina; Hebei Cancer Hospital. Ikke-tumorprøver fra makroskopisk tumor margen ble isolert på samme tid og anvendes som de tilpassede tilstøtende ikke-neoplastiske vev. Alle prøver ble delt i to deler. Vevsprøver ble oppsamlet umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen, og lagret ved -80 ° C til RNA-ekstraksjon. Bruken av vevsprøver for alle forsøkene ble godkjent av den etiske styret ved Institutt for medisinske basalfag, Chinese Academy of Medical Sciences. Alle deltakerne gitt sine verbale informert samtykke til å delta i denne studien, og deres verbale informert samtykke ble skrevet ned. Denne onsent prosessen ble også godkjent av Etisk Råd. Fire gastrisk cancer-cellelinjer (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 og MKN-45) ble alle konservert i vårt laboratorium og opprettholdt i DMEM eller 1640 med 10% FBS.
RNA-ekstraksjon, cDNA-syntese og real-time PCR-analyser
Total RNA fra vev og celler ble hentet av Trizol metode (Ambion, USA) helt å følge instruksjonene. Enkeltkjede-cDNA ble syntetisert ved hjelp av M-MLV (Ambion, USA) ved anvendelse av 2 ug av total-RNA som templat. Oligo (dT) 18 ble anvendt for mRNA revers transkripsjon mens stammesløyfe som brukes for miRNA. Real time-PCR (RT-PCR) ble utført av Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA) med SYBR mix (Tiangen, Kina). PCR tilstand var: 95 ° C x 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser med 95 ° C x 5 s, 60 ° C x 34s. For mRNA, ble GAPDH brukt som normalisert kontroll. For mirnas, ble U6 snRNA brukt til miRNA kontroll. Den relative uttrykk for MIR-137 ble beregnet ved 2-ΔΔCT metoden. Primer sekvenser er vist i tabell 1.
Plasmid bygging
Den MIR-137 forløper sekvens generert ved gløding og MIR-137-forløper-F og MIR-137-forløper-R forlengelsen ble i mellomtiden spaltet med BamHI og Bglll, produktene som var settes inn i BamHI-Bglll fragment av pcDNA-GW /EmGFP-MIR vektor (GenePharma, Kina). I mellomtiden ble negativ kontroll også bygget.
Cell kultur og miRNA transfeksjon
Cellelinjene HGC-27, SGC-7901 MKN-45 og GES-1 ble kjøpt fra Celle Resource center of institutt for medisinske basalfag, Chinese Academy of Medical Sciences og Peking Union Medical College (Beijing, Kina). De humane gastriske cellelinjer HGC-27, SGC-7901 og MKN-45 ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) medier supplert med 10% føtalt bovint serum og human gastrisk epitelium cellelinje GES-1 ble opprettholdt i DMEM ( Gibco, BRL, UK) media. MIR-137 etterligne og krafse ligne som er ikke-homolog til det humane genomet ble syntetisert ved GenePharma (Shanghai, Kina) og transfektert inn i cellene til en sluttkonsentrasjon på oligonukleotid 10nmol /l. Alle celle transfections ble introdusert av DharmaFECT1 Reagens (Dharmacon, TX, USA) i henhold til produsentens brukt instruksjoner. For hver celle transfeksjon to eller tre replikering eksperimenter ble utført.
celleproliferasjon og apoptose analysen
Celleproliferering analysen ble utført ved CCK8 metode (DOJINDO, Japan). I korthet, den omtrent 5000 MIR-137 etterligner transfekterte celler og krypterings celler ble henholdsvis sådd ut i 96-brønners plater og dyrket. Sprednings priser ble bestemt på 0, 12, 24, 48, 72, 96 timer etter transfeksjon ved å legge til 10 ul CCK8 regent og testet i henhold til manuskriptene. Apoptose analyser ble testet i HGC-27 og SGC-7901 cellelinjer med eller uten Mir-137 overekspresjon av apoptose Detection kit jeg (BD Biosciences, USA) og C6 Flowcytometer (USA).
Cell migrasjon og invasjon analyser
Vi utførte sårhelende analyse for å teste celle migrasjon evne med eller uten Mir-137 transfeksjon. Den kunstige sår ble produsert på konfluent cellemonolayer med FBS gratis, ved hjelp av en 200 mL pipette tips i 24 timer etter MIR-137 transfeksjon. Bildene ble henholdsvis tatt på 0, 12, 24 og 36 timer etter såret skapelsen.
Vi deretter utført Transwell-analyser for å evaluere cellenes invasjonsevne. 5 x 10
4 celler suspendert i 200 ul medium uten FBS ble plassert på det øvre kammer av hvert innsats med 430μl av 1 mg /ml matrigel (Millipore, USA). 600μl medium med 10% FBS som næringslokke ble satt i det nedre kammer. Etter 24 timer er cellene festet til den nedre overflate av kammeret var fastsettes 20 min med 20% metanol og farget i 10 minutter med 10% maygruwald-Giemsa (MGG). Invasjonen Membranene ble deretter kuttet ned og embedded under dekke slips. Vi telte celler i 3 forskjellige syn felter i stand med 20 × Magni fi kasjon som ble deretter brukt som gjennomsnittlig antall celler. Alle analyser ble utført i tre uavhengige eksperimenter.
Animal eksperiment
Forsøkene med dyr ble utført i henhold til Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og de institusjonelle etiske retningslinjer for dyreforsøk. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk i CAMS (Chinese Academy of Medical Sciences) (Permit Number: C72-14-0664). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Scramble-transfektert og MIR-137 overekspresjon HGC-27 celler (5 × 10
6 celler) ble inokulert s.c. inn i rygg flankene av BALB /c naken mus (kvinne, Nu /Nu, 6 uker gammel), som alle ble kjøpt fra Animal Centre of Henan University og oppvokst i patogenfrie forhold. Volumet av tumor ble målt i 5 uker. Alle musene ble drept og subkutant tumorer ble resekterte og vekten av tumorer ble testet. For in vivo-metastase eksperimenter ble HGC-27-celler samlet 24 timer etter transfeksjon. Den cellelevedyktighet Analysen ble utført ved anvendelse av en XTT-assay kit24 timer etter transfeksjon i henhold til produsentens instruksjoner (Roche, Tokyo, Japan). Da musene (kvinne, Nu /Nu, 6 uker gammel) ble injisert med HGC-27 celler med eller uten Mir-137 overekspresjon gjennom halevenen med 2 × 10
5 celler i PBS. De HGC-27 celler ble endret som kan stabilt uttrykke luciferase (bygget av GENECHEM, Shanghai, Kina). Cellene ble sjekket av mikroskop for å sørge for at cellene var i god stand. Etter seks uker ble Bioluminesens bildebehandling utført ved hjelp av en IVIS Spectrum og bilde utstråling verdier ble normalisert ved hjelp av levende bilde (Sylinder Life Science, USA).
Immunohistochemistry
Vev ble innebygd i parafinsnitt og behandlet 2 timer ved 65 ° C og deretter deparaffinised. Før du påfører de primære antistoffer ved 4 ° C over natten, gjennomførte vi antigen henting trinn. Etter dette ble glir inkubert med sekundært antistoff ca. 2 timer ved 25 ° C konjugert til HRP (1: 100; Zhongshanjinqiao, Kina). Liquid DAB + substrat (zsgb-bio, Kina) ble benyttet for påvisning av HRP aktivitet.
Luciferase miRNA mål reporter analysen
Den fulle lengden på 3’UTRs menneske akt2 mRNA var hver PCR forsterket og klonet inn i pMIR-REPORTTM luciferaserapportørplasmid Vector (Ambion, USA) for å generere journalister. Mutasjoner av den anslåtte frø regionene i mRNA-sekvenser ble opprettet ved hjelp av primere inkludert de muterte nettsteder. HEK-293T celle ble sådd ut på 24-brønners plater (1 x 10
5 celler per brønn) dagen før transfeksjoner ble utført. Celler (~70% konfluente) ble transfektert med PRL-TK luciferasepreparater journalister (50 ng /brønn), PGL-3firefly luciferase (10 ng /brønn), og etterligner-137 (50 nmol /L, GenePharma, Shanghai, Kina) eller krafse (50 nmol /l) under anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Luciferase aktiviteter ble målt ved anvendelse av den doble luciferase reporter Assay (Promega, USA).
Western blotting
Proteinene ble separert på 10% SDS-PAGE og deretter overført til 0,45 um PVDF-membraner (Amersham, UK). Membranene ble inkubert med 5% ikke-fett tørrmelk over natten ved 4 ° C og med anti-akt2 monoklonalt antistoff (Proteintech, USA) ved 1: 1000 fortynning; anti-Bad monoklonalt antistoff (BioWorld, USA) ved 1: 500 fortynning; anti-GSK-3B polyklonalt antistoff (BioWorld, USA) ved 1: 1000 fortynning; anti-GAPDH antistoff (Proteintech, Chicago, USA) ved 1: 30.000 fortynning. Etter vasking to ganger med TBST, ble membranene inkubert med geite-anti-kanin-antistoff (zsgb-bio, Kina) 1: 5000 og 1:. 50.000 fortynninger i 2 timer
statistikker og
Hver forsøket ble gjentatt minst tre ganger. Students t-test (to-halet) og x
2-testen ble utført, og statistisk signifikant nivå ble satt til α = 0,05 to-side). Mean ± SD vises i tallene.
Resultater
MiR-137 er nedregulert i mage kreftceller og kliniske prøver
Vi først undersøkt uttrykk for modne MIR -137 i 4 menneskelige mage kreft cellelinjer (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 og MKN-45) og mage epiteliale celle (GES-1). Disse GC cellelinjene oppviste usedvanlig lav ekspresjon av MIR-137 sammenlignet med den GES-1-cellelinje (figur 1A). For ytterligere å studere forholdet mellom MIR-137 med GC forekomst, vi har oppdaget at ekspresjonen av MIR-137 i 100 kliniske pasienter (menn 56, kvinnelig 44, gjennomsnittsalder 53 år) av Taqman probe-drived real-time PCR som beskrevet ovenfor. Ut av 100 GC prøvene, ble uttrykket av MIR-137 nedregulert i 77 tilfeller (77%) sammenlignet med tilstøtende vev når cut off ble satt opp som 1,5. I mellomtiden, MIR-137 ble oppregulert i 23 tilfeller (23%) (figur 1B og 1C). Generelt er ekspresjonen av MIR-137 i GC vev var lavere enn i tilstøtende vev i statistisk signifikante forskjeller (p = 0,00079, paret t-test, to-halet, figur 1C). Vi har også funnet en statistisk signifikant sammenheng mellom ekspresjonen av MIR-137 og magekreft klinisk stadium. De pasienter som har lavere nivåer av Mir-137 uttrykk var assosiert med svulster høyverdig og sene stadier (Fig 1D). Resultatene indikerte at endringer av MIR-137 kan være involvert i magekreft progresjon.
A. Mir 137 uttrykk ingastric cancercellelinjer (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 og MKN-45) og gastrisk epitelcelle (GES-1). B. Fire pasienter diagnostisert som magekreft ved H E flekker (original forstørrelse, x100). C /D. MiR-137 uttrykk i 100 kliniske pasienter. E. Expression levelsof MIR-137 i I-II etapper (n = 38) versusIII-IV etapper (n = 62) av magekreftpasienter.
MiR-137 hemmer celledeling in vitro og in vivo
Vi transfektert Mir-137 etterligne i GC cellelinjer HGC-27 og SGC-7901, som begge viste stor transfeksjon effektivitet (figur 2A). Resultatene av CCK8 vekstmålinger ved 0, 1, 2, 3 og 4 d etter MIR-137 og krafse transfeksjon er vist i figur 2B. Sammenlignet med krypterings transfeksjon, MIR-137 transfeksjon betydelig redusert proliferasjonen av begge cellelinjer (figur 2B). Deretter undersøkte vi effekten av MIR-137 på celle-apoptose. De tidlige apoptotiske celler i kappløpet gruppen var ca 10% i HGC-27 og 2,9% i SGC-7901, mens etter MIR-137 transfeksjon, ble andelen av tidlig apoptotiske celler økte til 17,5% i HGC-27 og 8,3% i SGC-7901, noe som viste signifikant forskjell (figur 2C). Fra disse resultatene kan det konkluderes med at MIR-137 kan undertrykke lungekreft celle overlevelse ved å indusere tidlig apoptose.
A. Real-time PCR ble utført for å påvise MIR-137 uttrykk i HGC-27 og SGC-7901 celler behandlet med Mir-137 etterligne eller rykke ligne. B. Vekst av HGC-27 og SGC-7901-celler ble vist etter transfeksjon med Mir-137 etterligne eller rykke ligne eller ingen transfeksjon. Vekstindeksen ble bestemt ved 0, 1, 2, 3 og 4 dager. Stolpene representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk (*** hjelp
P
0,001). C. HGC-27 Og SGC-7901 celler ble farget med PE Annexin V og 7-AAD 72 timer etter behandling med Mir-137mimics eller krafse. Tidlig apoptotiske celler er vist i den høyre kvadrant. D. representant figur av in vivo eksperimenter. Svulsten i MIR-137 overekspresjon gruppen er mye mindre enn den krafse. E. HE farging av mus tumor. F /G. Tumorvolum og vekt ble beregnet og alle data er vist som gjennomsnitt ± SD. Disse resultatene viste at både tumorvolumet og vekten ble signifikant redusert ved MIR-137 overekspresjon. Disse resultat bekreftet at Mir-137 overekspresjon kan undertrykke tumorvekst in vivo (*:
p
0,05; **:
p
0,01; ***:
p
. 0,001)
For ytterligere å bekrefte funnene ovenfor, ble en in vivo modell konstruert. Vi fant ut at tumorvekst var betydelig tregere i Mir-137 overekspresjon mus enn i kontrollene (figur 2D, 2E og 2G). I overensstemmelse med den tumorvekstkurven, vekten av svulstene indusert av eggecellene var betydelig høyere enn det ved den MIR-137 overekspresjon (figur 2F). Disse resultatene ytterligere bekreftet at MIR-137 overekspresjon kan begrense magekreft celleproliferasjon in vivo.
MiR-137 hemmer celle migrasjon og invasjon in vitro og in vivo
Vi videre vurderes virkningene av MIR-137 på celle migrasjon og invasjon, som var de viktigste faktorene for ondartet progresjon og metastasering. Virkningene av MIR-137 på cellemigrasjon ble demonstrert av et sår healing /ripetest hos HGC-27 og SGC-7901 celler. Begge av to cellelinjer behandlet med MIR-137 etterligne var tydelig mindre enn vandrings krafse eller kontroll ubehandlede celler ved 12, 24 og 36 timer etter å skrape (figur 3A). Videre gjennomførte vi celle invasjon analyse for å måle retnings invasjonen evner av celler etter MIR-137 overekspresjon. Som et resultat ble invasivitet av celler transfektert med MIR-137 etterligne dramatisk redusert sammenlignet med krypterings celler i HGC-27 og SGC-7901 (figur 3B). Deretter ble in vivo-forsøk som anvendes for å ytterligere verifisere dette resultat. Vi har for det første vist at celler transfektert med MIR-137 etterligne eller etterligner kontroll ikke viste en signifikant reduksjon i celleviabilitet i forhold til ubehandlede celler. Dessuten er det ingen forskjell i celleviabilitet mellom cellene transfektert med MIR-137 etterligne sammenlignet med negativ kontroll (S2 Fig). Som vist i figur 3C, bioluminescent avbildning av mus i MIR-137 overekspresjon gruppen viste en mye mindre bilde. Også antall lungemetastaser per mus i MIR-137 gruppen viste et betydelig lavere nivå enn rykke gruppen, som indikerte at MIR-137 kan undertrykke metastaser in vivo. Disse resultatene viste at MIR-137 spilt en viktig rolle i regulering av cellemigrering og invasivitet i magekreft og antydet at nedregulering av MIR-137 kan bidra til tumormetastase i magekreftutvikling.
A. SGC-7901 og HGC-27 celler ble ikke tilført eller transfektert med Mir-137 etterligner eller rykke ut i 24 timer, og sårene ble gjort. Det relative forhold av sårlukking i hvert felt er vist. Som et resultat av celler transfektert med MIR-137 viste en signifikant høyere migrerer hastighet sammenlignet med kontrollen. B. HGC-27 og SGC-7901 celler ble ikke tilført eller transfektert med Mir-137 etterligner eller rykke ut i 24 timer, og transwell invasjon analysen ble utført. Det relative forhold av invasive celler pr felt er vist. Forstørrelse for identifisering av migrasjon er × 400 og invasjon er × 40. Dette resultat viste at overføringen evnen til lungekreftceller kan bli inhibert av MIR-137 overekspresjon. C. Bioluminescentimaging (til venstre) og antall lungemetastaser per mus (i midten) viste at MIR-137 kan undertrykke metastaser in vivo. Den HE farging viste at metastase i mus lunge (til høyre).
MIR-137 retter seg mot akt2 i GC
mirnas utført biologiske funksjoner gjennom negativt regulere sine mål gener. Som spådd, var det komplementaritet mellom har-MIR-137 og akt2 3′-UTR (fig 4A).
A. Sekvensen til mir-137 bindingssteder innen den menneskelige akt2 3′-UTR og et skjematisk diagram av reporter konstruerer viser hele akt2 3′-UTR-sekvens (AKT2_WT) og den muterte akt2 3′-UTR-sekvens (M1, M2) . B. Luciferase-aktivitet av AKT2_WT reporter og reporter AKT2_MUT i nærvær av 10 nmol /L av MIR-137 etterligne eller krafse. C. Relativ uttrykk for akt2 i HGC-27 og SGC-7901 celler ikke transfektert eller transfektert med Mir-137 etterligner eller rykke 24 timer. D. Immunoblotting av akt2 i HGC-27 og SGC-7901 celler ikke transfektert eller transfektert med Mir-137 etterligne eller krafse. Alle data er vist som gjennomsnitt ± SD. E. Immunoblotting Bad, GSK-3β, p-Bad og p-GSK-β.fWestern blot analyse av akt2 protein nivå i 12 GC pasienter der MIR-137 var ned regulatedin sine GC vev.
for å teste hypotesen om at akt2 kan være et mål for MIR-137, en reporter plasmid villtype 3′-UTR regionen akt2 nedstrøms for lusiferasekodende regionen (figur 4A, AKT2_WT) ble konstruert. HEK-293T celler ble transfektert med reporter plasmid (AKT2_WT) og krafse. Som et resultat, MIR-137 transfekterte celler viste en markert reduksjon (≈58%) av luciferase-aktivitet (figur 4B). Deretter ble den samme analyse utført for en annen reporter plasmid inneholdende muterte akt2 3′-UTR i MIR-137 bindingssteder. Som forventet ble hemming av luciferase aktivitet ved MIR-137 delvis fjernes med bindingssetet en eller bindende sitere to mutant og nesten avskaffet i AKT2_MUT dobbel mutant, noe som tyder på at konservert område var fullt ut ansvarlig for MIR-137 funksjon (fig 4B) .
For ytterligere å undersøke samspillet mellom MIR-137 og akt2, HGC-27 og SGC-7901 celler ble transfektert med MIR-137. Akt2 mRNA ble bestemt ved real-time PCR. ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom MIR-137-behandlet og scramble-behandlet eller ubehandlet HGC-27 og SGC-7901 celler (fig 4C). Deretter ble western-blotting-analyse utført for å måle nivået av akt2 protein. Vi har funnet at ekspresjonen av akt2 protein ble nedregulert i MIR-137 behandlede HGC-27 og SGC-7901-celler, men ikke i krafse eller ubehandlede celler (figur 4D). Disse data tyder på at Mir-137 rett gjenkjenner 3′-UTR av akt2 mRNA og hemmer akt2 oversettelse. Dermed nedregulert MIR-137 i magekreft hemmer undertrykkelse av akt2, som i sin tur bremse tumorigenesis.
akt2 er medlem av AKT familien. Vi videre oppdaget nedstrøms effektorer Bad og GSK-B. Som et resultat av den p-Bad og p-GSK-B var åpenbart nedregulert i MIR-137 behandlede HGC-27 og SGC-7901-celler sammenlignet med krypterings-behandlede eller ubehandlede celler. Ingen signifikant endring ble funnet i ikke-fosforylert Bad eller GSK (Fig 4E). Disse funnene tyder på at den akselererte magekreft cellevekst var delvis på grunn av over-Actived Akt veier. Foruten å fremme cellevekst, kan Actived Akt også phosphorylate Bad på Ser112 og Ser136, blokkerer Bad-indusert celledød. I fravær av fosforylering på disse stedene, er dårlig tenkt å samhandle med BCL-XL å indusere celledød. I motsetning til dette, kan Akt-mediert hyperfosforylering av Bad fremme celleoverlevelse i kreftceller. Våre Western blotting resultatene bekreftet ovenfor spekulasjoner om at endringen av magekreft celleaktiviteter i tilstanden til MIR-137-transfekterte celler kan være et resultat av redusert fosforylering av Bad. Videre har vi analysert proteinnivåer akt2 i 12 GC patientsin hvem MIR-137 ble nedregulert. Blant disse prøvene, akt2 var oppregulert in9patientsin sine GC vev (Fig 4F).
Restaureringen av akt2 ledet til en aktivering av invasjon og undertrykkelse av apoptose
For ytterligere å demonstrere rollene til MIR-137 og akt2 spilt under tumorigenesis, vi undersøkte effekten av restaureringen av akt2 i MIR-137 transfekterte celler. Western blot viste at akt2 proteinnivå i akt2 overekspresjon prøven var tilsynelatende høyere enn for den negative kontrollen, selv under undertrykkelse av MIR-137. Restaureringen av akt2 ledet til en aktivering av invasjon og undertrykkelse av apoptose (figur 5).
A. Akt2 proteinnivå ble vurdert i GC celler behandlet med overekspresjon av MIR-137 og /eller akt2. B. akt2 restaurering fører til en hemming av apoptose i GC-celler mens MIR-137 fremmer apoptose. C. akt2 restaurering aktive apoptose og invasjonen av GC-celler mens MIR-137 viste motsatt effekt. Representative bilder vises. Den normaliserte forholdet av invaderende celler er vist i bunnfeltene. I figur 5, «MIR-137» representerer cellene transfektert med MIR-137 og pcDNA 3,1 tom vektor. «AKT2_oe» representerer cellene transfektert med akt2 overekspresjon vektor. «MIR-137 + AKT2_oe» representerer cellene kotransfektert av MIR-137 og akt2 overekspresjon vektor. «Scr» representerer cellene transfektert med ligne negativ kontroll og pcDNA 3,1 tom vektor.
Diskusjoner
mirnas er ofte angitt til å være ofte dysregulerte i ulike kreft hos mennesker og noen miRNAs har også blitt brukt som anvendes som terapeutiske mål for kreft. Undersøkelsene viser til forholdet mellom mirnas og kreft kan hjelpe oss med forståelsen av kreft.
Det er bare noen få forskere henviser rollen MIR-137 spilte i magekreft. Det har blitt rapportert at den mir-137 er en negativ regulator av Cdc42 og ved å målrette som indusering av apoptose og cellesyklusarrest i G1 magekreftceller [17]. Imidlertid er regulering av effekten mikroRNA i kreft er ganske komplisert. Det virker umulig at MIR-137 regulerer magekreft ved enkelt bane. I denne forskningen, funksjon og mekanisme som MIR-137 regulert magekreft ble videre undersøkt.
Det første vi oppdaget uttrykket av MIR-137 100 pasienter og fant at uttrykket av MIR-137 er betydelig ned -regulated i kreft prøven. Vi har også funnet en statistisk signifikant sammenheng mellom ekspresjonen av MIR-137 og magekreft klinisk stadium. Resultatene indikerte at endringer av MIR-137 kan være involvert i magekreft progresjon. Vi har forsøkt å finne sammenhengen mellom MIR-137 og pasientenes alder og kjønn, men ingen statistikk resultat ble funnet. Som denne studien viste at uttrykket av MIR-137 ble nedregulert i de fleste av GC vev sammenlignet med tilstøtende vev (77%), kan vi vurdere om diagnosen og prognostisk bruk av MIR-137. Ytterligere validering i prospektive studier er berettiget og mer tilgjengelige prøver kilder, for eksempel MIR-137-beriket tumor-avledet exosomes fra blod, bør undersøkes. I tillegg bør det bli lagt merke til at til en viss grad den avskårne verdi (kuttes = 1,5) valgte kan være fortsatt vilkårlig. Da det ble satt høyere, kan det være færre pasienter med MIR-137 nedregulert i kreftvevet. Men selv i denne tilstanden, det var omtrent 23% av kreftformer har høy MIR-137 uttrykk. Dette kan være på grunn av den individuelle forskjellen mellom pasienter at noen individer kan ha forskjellig genuttrykksmønstrene under tumorigenese eller progresjon av kreft.
I ekspresjonen av MIR-137 i GC vev var lavere enn i tilstøtende vev i statistisk signifikante forskjeller (p = 0,00079), kan vi spekulere at dette uttrykket karakteristisk ble assosiert med kreftutvikling. Denne spekulasjon ble bekreftet ved in vitro og in vivo studier som MIR-137 kan ha en negativ regulere celleproliferasjon, migrering og invasjon. Mir-137 uttrykk nivået kan holde på et høyt nivå i en lengre periode etter transfeksjon både i mage kreft cellelinjer, end-stage xenografttumorer og inmetastatic plassering i lungene (S1 A Fig-S1C fig). Imidlertid fører overekspresjon metode til svært høye ekspresjonsnivåer av MIR-137 (figur 2A). Dette høye nivået av MIR-137 kan gi tilleggseffekter. For eksempel er MIR-137 en negativ regulator av Cdc42 og ved målretting som indusere apoptose og cellesyklus G1 arrest i magekreftceller [17]. Som MIR-137 i vår studie ble oppregulert tusenvis av ganger, kan det føre til hemming av andre mål som Cdc42. Selvfølgelig, i denne studien kan vi ikke utelukke at tumorsupressorproteinene effektene av MIR-137 ble formidlet ved å undertrykke andre målgener.
Da fant vi ut at MIR-137 fungerer som en tumor suppressor gen gjennom targeting akt2 , som er et medlem av familien AKT. Gjenopprettelsen av akt2 fører til oppregulering av akt2 i MIR-137 transfekterte celler, som er mye høyere enn det som i krafse. Dette kan skyldes at akt2 overekspresjon snudd proteinnivået MIR-137 trykt. Enda viktigere, restaurering av akt2 regulerer apoptose og invasjon av magekreftceller, som fører til en aktivering av invasjon og en undertrykkelse av apoptose (figur 5). Denne rednings eksperiment gir ytterligere bevis på at Mir-137 aktive cellen apoptose og negativt regulerer celle invasjon ved å målrette akt2. In vivo eksperimenter har også vist at MIR-137 uttrykk er negativt i forhold til akt2 uttrykket (S1D figur og fig S1E). AKT er en avgjørende faktor for PI3K /AKT bane vei. Den nedregulering av akt2 påvirker ytterligere sin nedstrøms protein Bad og GSK-3B, som p-Bad og p-GSK-B ble åpenbart nedregulert. Bad kan spille sine roller ved fosforylering og videre regulert cellen skjebne [18]. GSK-3B, som også er kjent som GSK-3β vanligvis styrer cellen innvandring og invasjon. Avslutningsvis har vi identifisert en kobling mellom MIR-137 og akt2 som er en roman bestanddel av magekreft tumorigenesis. MIR-137 er vist å være relatert til regulering akt2 [19].
