Abstract
Bakgrunn
Denne studien var rettet mot å undersøke den funksjonelle betydningen av heparansulfat (glukosamin) 3
O
-sulfotransferase 2 (
HS3ST2
) hypermethylation i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC).
metodikk /hovedfunnene
HS3ST2
hypermethylation ble preget i seks lunge kreft cellelinjer, og dens klinisk betydning ble analysert ved hjelp av 298 formalinfiksert parafin-embedded vev og 26 friske frosset vev fra 324 NSCLC pasienter. MS-HRM (metylering spesifikke høy oppløsning smelting) og EpiTYPER
TM-analyser viste betydelig hypermethylation av CpG island på promoter-regionen i
HS3ST2
i seks lunge kreft cellelinjer. Den stilnet genet ble demetylert og re-uttrykkes ved behandling med 5-aza-2′-deoksycytidin (5-Aza-dC). En promoter-analysen viste også kjernen promoteraktivitet av HS3ST2 ble regulert ved metylering. Eksogene uttrykk for HS3ST2 i lungekreftceller H460 og H23 hemmet celle migrasjon, invasjon, celledeling og mens knockdown av HS3ST2 i NHBE celler indusert celle migrasjon, invasjon, og celleproliferasjon
i
vitro
. En negativ korrelasjon ble observert mellom mRNA og metylering nivåer av HS3ST2 i 26 friske frosne svulster vev (ρ = -0,51,
P
= 0,009; Spearman rang korrelasjon).
HS3ST2
hypermethylation ble funnet i 95 (32%) av 298 primær NSCLCs. Pasienter med
HS3ST2
hypermethylation i 193 node-negative stadium I-II NSCLCs med en median oppfølgingsperiode på 5,8 år hadde dårlig total overlevelse (hazard ratio = 2,12, 95% konfidensintervall = 1,25 til 3,58,
P
= 0,005) sammenlignet med de uten
HS3ST2
hypermethylation, etter justering for alder, kjønn, tumorstørrelse, adjuvant behandling, tilbakefall, og differensiering.
Konklusjon /Betydning
Denne studien tyder på at
HS3ST2
hypermethylation kan være en uavhengig prognostisk indikator for total overlevelse i node-negative stadium i-II NSCLC
Citation. Hwang JA, Kim Y Hong SH, Lee J, Cho YG, Han JY, et al. (2013) epigenetiske Inaktivering av heparansulfat (Glukosamin) 3
O
-Sulfotransferase 2 i lungekreft og dens rolle i tumorigenesis. PLoS ONE 8 (11): e79634. doi: 10,1371 /journal.pone.0079634
Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina
mottatt: May 22, 2013; Godkjent: 25 september 2013; Publisert: 12.11.2013
Copyright: © 2013 Hwang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Cancer Center (NCC 1110140-1 og 1110100-2), Korea Healthcare teknologi R D Project, departementet for helse, velferd familiedepartementet, republikken Korea. (A084947AA202308N100010A), og grunnlaget for Korea (NRF) finansiert av Korea regjeringen (MEST) (No. 2011-0029138), Republikken Korea National Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i verden. Til tross for betydelige fremskritt i tidlig oppdagelse og behandling de siste to tiårene, er fortsatt prognosen dårlig, med den samlede fem års overlevelse svever på mindre enn 15% [1]. Den dårlig prognose av lungekreftpasienter resulterer i hovedsak fra micrometastasis, noe som gjør kurere mindre sannsynlig, og delvis fra den høye frekvensen av tilbakefall etter kurativ reseksjon; pasienter med stadium I lungekreft har en fem-års overlevelse av 50% om kreften har spredd seg til nærliggende lymfeknuter eller andre områder. Mer enn 80% av tilbakefall skje i løpet av de første to årene; tilbakefall etter kurativ kirurgisk reseksjon med passende lymfeknute området fra 20% til 50%, avhengig av den patologiske trinnet [2]. Dermed er oppdagelsen av molekylære biomarkører for tidlig deteksjon og identifisering av pasienter med høy risiko for tilbakefall klart viktig.
Heparan sulfat (HS) er et lineært polysakkarid som er funnet i alle animalske vev, og det forekommer som et proteoglykan hvor to eller tre lineære heparansulfat glykosaminoglykan (GAG) kjedene er kovalent bundet til bestemte serinrester videre en kjerne protein gjennom et tetrasakkarid linker [3]. HS kjeder er montert på en kjerneprotein av enzymer i Golgi-apparatet og er sammensatt av repeterende disakkaridenheter av vekselstrøm glukuronsyre (GlcA) eller iduronsyre (IdoA) syre og
N
acetyl glukosamin (GlcNAc). Under montering, de gjennomgå en rekke sekvensielle endringer som begynner med
N
-deacetylation og
N
-sulfation av glukosamin rester. I tilknytning til denne første modifikasjon, er noen GlcA rester epimeriseres til iduronsyre ved en C5 epimerase og deretter ble 2-O-sulfateres, med ytterligere sulfatering ved 6-O og 3-O-posisjonene til glucosaminrester for å gi modne kjeder [4,5 ]. Modifikasjonene er viktige for den fine strukturen til heparinsulfat-proteoglykaner (HSPG) og i spesifisitet av heparansulfat-protein-interaksjon.
Heparan sulfat product: (
glukosamin
)
3-O-
sulfotransferaseaktivitet
to plakater (
HS3ST2
), et medlem av heparan sulfat biosyntetiske enzymet familie, besitter heparansulfat glukosaminylgruppe 3-
O
-sulfotransferase aktivitet som endrer GAG kjeder [6,7].
HS3ST2
hypermethylation har nylig blitt rapportert i en rekke kreftformer, som brystkreft [8,9], tykktarmskreft [8,10,11], magekreft [12], hematologisk neoplasma [13], lungecancer [8], kreft i bukspyttkjertelen [8], prostatakreft [14], og livmorhalskreft [15,16].
HS3ST2
hypermethylation ble funnet på en høy frekvens i ductal carcinoma in situ i bryst [9] og i cytologiske prøver av cervical intraepitelial neoplasi 3 (CIN3) [15], noe som tyder på
HS3ST2
hypermethylation sannsynligvis forekommer tidlig i løpet av malign transformasjon av brystkreft og livmorhalsen.
HS3ST2
viser også høy metylering i prostatakreft med tilbakefall [14]. I tillegg er frekvensen av
HS3ST2
hypermethylation er høy i høyverdig plateepitel intraepitelial lesjon (HSIL) av livmorhalsen i forhold til lavgradig plateepitel intraepitelial lesjon (LSIL) [16]. Men clinicopathological betydningen av
HS3ST2
hypermethylation forblir unnvikende i lungekreft. For å få bedre innsikt i rollen som
HS3ST2
hypermethylation i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), vi preget
HS3ST2
hypermethylation i seks lunge kreft cellelinjer og undersøkte effekten av hypermethylation av
HS3ST2
på fenotype og prognose for lungekreft i parafininnstøpte vev fra 298 primær ikke-småcellet lungekreft (NSCLCs).
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP og vevsprøver
Seks humane lungekreft-cellelinjer (H23, H226, H460, H520, H1650, og A549) og to humane bronkiale epitel-cellelinjer (HBEC og NHBE) ble oppnådd fra American Type Culture Collection ( Manassas, VA). Cellene ble dyrket i en egnet vekstmedium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT) og 1% antibiotisk-antimykotisk (Invitrogen, USA). Twenty-seks ferske frosne tumor og tilsvarende normalt vev, samt 298 parafininnstøpte tumorvev, ble innhentet fra totalt 324 NSCLC pasienter som gjennomgikk kurativ reseksjon ved Institutt for Thoracic og Cardiovascular Surgery, Samsung Medical Center, Seoul, Korea mellom august 1994 og november 2005. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board på Samsung Medical Center, og skriftlig informert samtykke til bruk av vev ble innhentet fra hver pasient før operasjonen. Postoperativ oppfølging for overlevelse eller tilbakefall ble utført som tidligere beskrevet [2]. Patologisk TNM stadium ble bestemt i henhold til retningslinjene fra det amerikanske Joint Committee on Cancer [17]
Genomisk DNA-ekstraksjon og natriumbisulfitt modifikasjon
H . E (Hematoxylin og eosin) farging av frisk -frozen og parafininnstøpte vev ble utført; tumor områdene inneholdt minst 75% neoplastisk vev. Genomisk DNA fra dyrkede celler og fra 26 friske frosne tumor og tilsvarende normale vev og 298 parafininnstøpte tumorvev ble utvunnet ved hjelp av MagAttract DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og DNeasy Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA), henholdsvis. Ett mikrogram av genomisk DNA ble modifisert ved natriumbisulfitt hjelp av EZ DNA Metylering-Gold Kit (ZYMO Research, Irvine, CA).
MS-HRM analysen, EpiTYPER
TM-analysen, og metylering-spesifikke PCR
For å finne høyt denaturert regioner i
HS3ST2
arrangøren, en 2 kb region som inneholder 1,5 kb
HS3ST2
promoter ble analysert med en metylering spesifikk høy oppløsning smelte (MS-HRM) assay på en LightCycler®480 real-time PCR instrument (Roche, Switerland). Den metylering status av en 1,5 kb region som ble funnet å være svært metylert ved MS-HRM analysen ble videre analysert kvantitativt ved hjelp av EpiTYPER
TM analysen (Sequenom, San Diego, CA) for å analysere metylering statusene individuelle CPGs. Analysert regioner er representert i figur 1A. Primere for hver analyse ble utformet ved hjelp SEQUENOM (San Diego, California) EpiDesigner programvare (tabell S1 og S2). Metyleringen status for
HS3ST2
i 298 formalinfikserte parafin-innleiret vev ble bestemt ved anvendelse av metylering-spesifikke PCR (MSP) med to sett av primere (tabell S3) som dekker den promoter-regionen, som tidligere beskrevet
2. Reaksjoner ble startet varm ved 94 ° C før tilsetning av 2,5 enheter Taq-polymerase. Amplifikasjon ble utført over 35 sykluser (30 s ved 94 ° C, 30 s ved glødetemperaturen, 30 s ved 72 ° C), etterfulgt av 4 minutter ved 72 ° C. Resultatene fra MSP analysen ble visuelt scoret av to forfattere (Y Kim og D-H Kim). Prøver med et sterkere bånd intensitet enn den negative kontrollen i metylering spesifikke PCR ble betegnet denaturert, og prøver med ingen synlig PCR-produktet ble betraktet som unmethylated.
(A) CpG island kartet
HS3ST2
promoter og regionene analysert ved hjelp av MS-HRM og EpiTYPER analysen. (B) Metylering status for
HS3ST2
ble først undersøkt i seks lungekreftcellelinjer og to bronkial epiteliale cellelinjer ved hjelp av MS-HRM. (C) Metylering status av individuelle CPGs på en 1,5 kb promoter region (HRM-04, 05, 06, 07, 08, og 09) ble analysert kvantitativt i cellelinjene ved hjelp av EpiTYPER
TM analysen. Metylering nivåer er avbildet som en fargeendring på en kontinuerlig skala fra rødt (0% denaturert) til hvit (100% denaturert). (D) transkripsjonsnivåer av
HS3ST2
ble sammenlignet mellom høyt metylert lungekreftcellelinjer og bronkial epiteliale cellelinjer ved QRT-PCR (svart strek). Gjenoppretting av
HS3ST2
transkripsjon ble vurdert etter behandling av seks lunge kreft cellelinjer med 5-Aza-DC i 72 timer (grå bar vs. hvit bar;
P
-verdier er basert på Wilcoxon signert-rank test). (E) Metylering status av CPGs rundt høyt metylert ATG området på
HS3ST2
-genet ble bestemt etter behandling med 5-Aza-dC i 72 timer. Heatmap viser typiske mønstre av demetylering i kreftceller i respons til 5-Aza-DC, og prosentene indikerer gjennomsnittlig metylering nivåer.
Analyse av HS3ST2 uttrykk
For å undersøke uttrykket av HS3ST2 på nivået av mRNA, ble cDNA syntetisert fra to ug av total-RNA ved hjelp av Superscript
TM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, CA). MRNA-ekspresjon av HS3ST2 ble analysert ved hjelp av RT-PCR og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR). Kvantitativ real-time PCR ble utført på en LightCycler
® 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science). GAPDH ble brukt som en referanse gen, og den relative ekspresjonsnivået ble beregnet ved anvendelse av A C
T-metoden (A C
T = C
T av GAPDH – C
T av HS3ST2). Eksperimentet ble utført in triplo, og de QRT-PCR-primerne som ble brukt var de samme som i RT-PCR. Primerne ble utformet for å inneholde exon-exon krysset (tabell S3).
5-Aza-dC behandling in vitro
Seks lungekreftcellelinjer ble inkubert med 10 mm 5-aza-2 «-deoxycytidine (5-Aza-dC; Sigma Aldrich, St. Louis, MO) i 72 timer. Etter inkubasjon ble mRNA uttrykk og metylering kvantifisert ved kvantitativ real-time PCR og EpiTYPER
TM analysen, henholdsvis.
Reporter assay
Serie sletting konstruksjoner av HS3ST2 promoter ble opprettet, og forskjellige lengder av promotorregionene (-984 ~ + 12, -742 ~ + 12, -495 ~ + 12, -245 ~ + 12) ble amplifisert ved hjelp av PCR-primerne (tabell S4) og klonet inn i pGL3-basisvektor. Arrangøren sekvensen var
in vitro
metylert av CpG-spesifikke
Sss
jeg metylase (New England Biolabs, Ipswich, MA). Promotor aktiviteter denaturert og unmethylated konstruksjoner ble sammenlignet med Dual Luciferase assay (Promega, Madison, WI).
Cell migrasjon, invasjon, og spredning analysen
For
in vitro
celle migrasjon, invasjon, og analyser spredning, en pAcGFP1-C1-
HS3ST2
cDNA-klon ble fremstilt ved bruk av primere som er oppført i tabell S3, og H460 og H23 celler ble transfektert med en mikrogram pAcGFP1-C1-
HS3ST2 Hotell og pAcGFP1-C1 (tom vektor) med Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, USA). Førti-åtte timer etter transfeksjon ble HS3ST2 uttrykk bekreftet av immunoblotting hjelp primære antistoffer rettet mot GFP (sc-9996, Santa Cruz Biotechnology, California) og α-tubulin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Cellemigrering ble analysert ved å la celler til å migrere nedover over natten ved 37 ° C gjennom en 8-m porer filterinnsats (BD, USA) og deretter ved farging med 1% krystallfiolett; de oppløste cellene ble målt ved 564 nm i en VERSA
max mikroplateleser (Molecular Devices, USA). Invasjonen Analysen ble utført ved å telle Diff-Quick
TM (Sysmex, Japan) fargede celler i en Matrigel-belagte innsatsen etter en 48 timers inkubering. For spredning analysen, ble brønner sådd med 1 × 10
3 celler per brønn og en MTT Analysen ble utført hver 24 timer; prolifererende celler ble målt ved absorbans ved 570 nm.
knockdown av HS3ST2
HS3ST2 spesifikke små interfererende RNA (siRNA målsekvens. 5′-CCCAGCTACTTTGTCACTCAA-3 «Cat No. SI00442015, Qiagen) eller negativ kontroll siRNA (Art.nr. 10272810, Qiagen) ble transfektert til NHBE celler. Etter 72 timer med transfeksjon ble stanse av HS3ST2 bekreftet av immonublotting hjelp primære antistoffer rettet mot HS3ST2 (kat. Nr PA5-26522, Thermo Scientific) og normalisert med β-aktin. Effekten av HS3ST2 knockdown på cellemigrering, celleinvasjon og celleproliferasjon ble analysert som beskrevet ovenfor.
Kvantitativ metylering-spesifikk PCR-
Metylering status av CpG øya på den promoter-regionen i
HS3ST2
i 26 friske frosne tumorvev ble analysert kvantitativt ved hjelp av fluorescens-basert kvantitativ real-time PCR-analyse, MethyLight, som beskrevet av Gonzalo et al [10]. Kort sagt ble de MethyLight reaksjonene utført i et sluttvolum på 12,5 ul inneholdende 1,0 mL bisulfitt-behandlede DNA, 900 nM hver primer og 250 nM TaqMan probe. Termocykling reaksjoner ble utført ved anvendelse av en 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), og
ALU-C4
-genet ble anvendt som en intern referanse for å normalisere mengden av inngangs DNA [18]. Primerne og fluorescens-merkede TaqMan prober anvendt i denne studien er presentert i tabell S5.
Immunhistokjemi av Ki-67
Immunhistokjemisk analyse av Ki-67 ble utført som beskrevet tidligere [19] . Fraksjonen av Ki-67-positive celler (Ki-67-merkeindeksen) ble definert som den prosentandel av kjerner farget positivt med antistoffet.
Statistisk analyse
Wilcoxon rank sum test ( eller
t
-test) og Fishers eksakte test (eller Chi-squared test) ble brukt for univariat analyse av kontinuerlige og kategoriske variabler, henholdsvis. HS3ST2 mRNA nivåer mellom tumorvev og matchet normalt vev ble sammenlignet med Wilcoxon signed-rank test. Spearmans rang korrelasjonskoeffisient ble beregnet for evaluering av sammenhengen mellom uttrykk og metylering av
HS3ST2
. Effekten av
HS3ST2
hypermethylation på overlevelse eller tilbakefall ble anslått av Kaplan-Meier overlevelseskurver, og betydningen av forskjeller i prognose mellom gruppene ble evaluert av log-rank test. Cox analyse ble utført for å estimere fare prosenter av
HS3ST2
hypermethylation for å overleve, etter kontroll for mulige konfunderende faktorer.
Resultater
Analyse av metylering rundt HS3ST2 promoter
metylering status for
HS3ST2
rundt
HS3ST2
arrangøren ble analysert ved hjelp av MS-HRM (figur 1B) og EpiTYPER
TM-analyser (figur 1C) i seks lungecancercellelinjer og to normale bronkiale epitel-cellelinjer. Metylering status for en 2.0 kb region som inneholder promotersekvensen av
HS3ST2
ble først vist av MS-HRM. Kjente smeltekurve dissosiasjon ble observert i seks fragmenter (HRM-04, 05, 06, 07, 08, og 09) mellom lungekreftcellelinjer og normale bronkial epiteliale cellelinjer (Figur 1b). Fordi metylert cytosin krever en høyere smeltetemperatur enn unmethylated cytosin, smelte kurver av metylerte fragmentene forskjøvet til høyre i forhold til normale cellelinjer. For å evaluere metylering statusene individuelle CPGs på 1,5 kb promoter-regionen, inkludert de seks fragmenter, vi analysert kvantitativt individuelle CPGs med EpiTYPER
TM-analysen (figur 1C). Normale cellelinjer ble hypomethylated i hele 1,5 kb-sekvenser, men lungecancer cellelinjer ble vanligvis hypermethylated rundt ATG-translasjons-startsetet. Selv om noen CPGs på ATG oversettelse start stedet for
HS3ST2
var delvis metylert i H226 og H1650 celler, de fleste CPGs var svært metylert i andre lungekreftcellelinjer.
5-Aza-dC indusert demetylering og re-uttrykk for forstummet HS3ST2
For å undersøke om nedregulering av
HS3ST2
er avhengig hypermethylation av genet, analyserte vi re ekspresjon (figur 1D) og demetylering (figur 1E) av taushet
HS3ST2
av QRT-PCR og EpiTYPER
TM analyse etter behandling av lungekreft celler med 10 mm 5-Aza-dC i 72 timer. HS3ST2 mRNA nivåene var betydelig lavere i seks lunge kreft cellelinjer enn i to bronkial epiteliale cellelinjer (svart strek, figur 1D). Silenced
HS3ST2
ble gjen uttrykt i alle lungekreftcellelinjer etter 5-Aza-dC behandling (hvit bar; figur 1D). Forandringen i nivået av metylering som respons på 5-Aza-dC ble videre analysert ved enkelte CPGs rundt den sterkt metylerte ATG området på
HS3ST2
-genet (figur 1E). Selv om graden av demetyleringen skilte seg imellom cellelinjer, ble demetylering finnes i alle cellelinjene følgende 5-Aza-dC behandling. Demetylering forekom betydelig i H460 eller H1650 celler, som var mindre tett denaturert, enn i tett denaturert H23 celler. Disse funnene tyder på at
HS3ST2
hypermethylation kan være forbundet med transkripsjonen nedregulering av genet.
HS3ST2
promoter aktivitet redusert med arrangøren metylering
Arrangøren aktivitet ble målt i H23-celler (figur 2A) og HEK-293T celler (figur 2B) med Dual Luciferase assay for å avgjøre om
HS3ST2
metylering påvirker gentranskripsjon. Fire konstruksjoner (-984 ~ + 12, -742 ~ + 12, -495 ~ + 12, -245 ~ + 12) for hver denaturert og unmethylated promotersekvenser ble produsert. Metylerte konstruksjoner ifølge
HS3ST2
promotor ble oppnådd med SSSI metylase (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) i nærvær av S-adenosylmethionin. Promoteraktivitet blant unmethylated konstruksjoner av
HS3ST2
promoteren var ikke proporsjonal med lengden av hver konstruksjon i cellene, men promotoren aktivitet ble redusert særlig når promotersekvenser mellom -742 bp og -495 bp ble slettet. For denaturert konstruerer, promoter aktivitet var lik i alle konstruksjoner og betydelig lav sammenlignet med tilsvarende unmethylated konstruksjoner. Denne observasjonen tyder på at kjernen promoteren omfatter en DNA-region på -742 bp gjennom -495 bp fra transkripsjons-initierings-setet.
to luciferase-aktivitet av fire HS3ST2 promotor konstruksjonene ble målt i H23 (A) og HEK- 293T (B) cellelinjer. En kb promoter konstruksjonen ble serie slettet, og luciferase aktiviteten til hver konstruksjon ble sammenlignet mellom konstruksjoner behandlet med (grå linje) og uten SSSI metylase (svart strek).
HS3ST2 hemmet celle migrasjon, invasjon, og spredning
For å undersøke funksjonen til
HS3ST2
i tumorigenesis i lungene, cellemigrasjon, invasjon, og spredning var undersøkt i H460 og H23 lungekreft celler.
HS3ST2
cDNA ble klonet inn pAcGFP-C1 og transfektert inn i H460 og H23 celler: data fra H23 celler er i figur S1. Overekspresjon av transfekterte pAcGFP-C1-
HS3ST2
ble overvåket ved hjelp av RT-PCR (figur 3A), QRT-PCR (figur 3B), og immunoblotting (figur 3C). Overekspresjon av
HS3ST2
betydelig celle migrasjon kapasitet redusert med 53% (
P
= 0,0017; Figurene 3D og 3E). Cell invasjon aktivitet redusert med 83% i H460 celler transfektert med pAcGFP-C1-
HS3ST2 product: (
P
= 0,0019, figur 3F og 3G); celleproliferasjon også betydelig redusert over tid (figur 3 H 3I). Disse observasjonene tyder på at
HS3ST2
kan hemme lunge tumorigenesis ved å redusere celle migrasjon, invasjon, eller celleproliferasjon i lungekreft.
(AC) pAcGFP-C1-
HS3ST2
var transfektert inn i H460-lungekreftceller. Spesifikk overekspresjon av
HS3ST2
sammenlignet med den tomme vektoren ble bekreftet ved RT-PCR (A), QRT-PCR (B), og western blotting (C). (DG) H460-celler ble sådd i en Boyden kammer med en tom vektor eller med en ug pAcGFP-C1-
HS3ST2
i transwell migrasjon (D migrerende celler ble målt ved absorbans ved 564 nm; invaderende celler ble tellet under et mikroskop. Resultatene presenteres i forhold til
i
vitro
migrasjon eller invasjon av ikke-induserte H460 celler (100%). (H 4D).
(A) HS3ST2 siRNA ble transfektert inn NHBE celler, og siRNA-mediert knockdown ble bekreftet av Western blot. (B) Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse bestemmes ved å evaluere absorbansen av det omdannede fargestoff ved en bølgelengde på 570 nm. (C plateepitelkreft, plateepitelkarsinom cDifferentiation data mangler for 68 tilfeller CSV ned CSV
For å analysere forholdet mellom
HS3ST2
hypermethylation til celleproliferasjon, Ki-67 uttrykk ble evaluert ved immunhistokjemisk farging (figur 5D). Ki-67 spredning indeksen ble funnet å være signifikant forskjellig i henhold til metylering status for
HS3ST2 product: (
P
= 0,02, figur 5E): middelverdien Ki-67 spredning indeksen var 29% og 22% i svulster med og uten
HS3ST2
hypermethylation hhv. Forholdet mellom Ki-67 spredning indeks og
HS3ST2
hypermethylation var også lik i adenokarsinom (
P
= 0,04) og plateepitelkarsinom (
P
= 0,009).
Survival analyse
Tilbakefall overlevelse (RFS) og total overlevelse ble sammenlignet i henhold til metylering status for
HS3ST2
over tumorstadium. For å analysere effekten av
HS3ST2
hypermethylation på pasientens prognose, stratifisert vi data av tumorstadiet fordi tumorstadium er signifikant assosiert med pasientens overlevelse i NSCLC.
HS3ST2
hypermethylation var ikke assosiert med RFS (data ikke vist). Men effekten av
HS3ST2
hypermethylation på total overlevelse viste et annet mønster i henhold til involvering av lymfeknute i 248 stadium I-II NSCLCs. For 193 node-negative stadium I-II NSCLCs, 5-års overlevelse var 59% og 71% hos pasienter med og uten
HS3ST2
hypermethylation henholdsvis (figur 6A). Og denne forskjellen var signifikant forskjellig (
P
= 0,04). Men total overlevelse var ikke signifikant forskjellig mellom pasienter med og uten hypermethylation av
HS3ST2
i 55 node-positive saker. (
P
= 0,69, figur 6B)
Totalt overlevelse ble sammenlignet i henhold til metylering av status
HS3ST2
i 193 node-negativ stadium i-II NSCLCs (A) og i 55 node-positive stadium i-II NSCLCs (B).
HS3ST2
hypermethylation i en gruppe som ikke har involvering av lymfeknute viste en signifikant negativ effekt på total overlevelse (
P
= 0,04).
COX proporsjonal farer analyse
Stratifisert Cox proporsjonal farer analyse (tabell 2) for 248 stadium i-II NSCLCs ble utført for å kontrollere for mulige konfunderende effekter av variabler som alder, kjønn, tumorstørrelse, adjuvant behandling, tilbakefall, og differensiering, og å beregne hazard ratio (HR). Pasienter med
HS3ST2
hypermethylation i 193 node-negative NSCLCs hadde en 2,12 ganger (95% konfidensintervall [CI] = 1,25 til 3,58;
P
= 0,005) større risiko for svikt i forhold til dem uten
HS3ST2
hypermethylation. Men total overlevelse hos pasienter med involvering av lymfeknute var ikke signifikant forskjellig i henhold til metylering status for
HS3ST2 plakater (HR = 0,84, 95% CI = 0,34 til 3,82;
P
= 0.69).
HS3ST2
hypermethylation
HR
en
95% CI
en
P
-verdi product: (A) Node-positiv casesNo1.00 (N = 55) Yes0.840.34-3.820.69 (B) Node-negative casesNo1.00 (N = 193) Yes2.121.25-3.580.005Table to.
