Abstract
Betulinic syre er et penta triterpenoid som viser anticancer funksjoner i menneskelige kreftceller. Denne undersøkelsen gir bevis for at betulinsyre er meget effektivt mot den humane livmorhalskreft cellelinje HeLa ved å indusere dose- og tidsavhengig apoptose. Den apoptotiske prosessen ble videre undersøkt ved hjelp av en proteomikk tilnærming for å avdekke protein uttrykk endringer i HeLa celler etter betulinsyre behandling. Proteomikk analyse viste at det var seks oppover- og tredve nedregulert proteiner i betulinsyre-induserte HeLa-celler, og disse proteinene ble deretter utsatt for funksjonsveien analyse ved bruk av multippel-analyse-programvare. UDP-glukose-6-dehydrogenase, 6-fosfoglukonat-dehydrogenase dekarboksylere, kjede A-Horf6 et nytt humant peroksydase enzym som er involvert i redoks prosessen, ble funnet å bli nedregulert i løpet av apoptose fremgangsmåten i oksidativt stress respons pathway. I samsvar med våre resultater på proteinnivå, ble det observert en økning i intracellulært reaktive oksygenarter i Betulinic syrebehandlede celler. Den proteiner glukose regulerte protein og last-utvalget protein TIP47, som er involvert i det endoplasmatiske retikulum vei, var oppregulert ved betulinsyre behandling. I mellomtiden, 14-3-3 familieproteiner, inkludert 14-3-3β og 14-3-3ε, ble nedregulert i respons til betulinsyre behandling, noe som er konsistent med den reduksjon i ekspresjonen av målgener
14 -3-3β Hotell og
14-3-3ε
. Videre ble det funnet at antiapoptotic
bcl-2
genet, ble nedregulert, mens den proapoptotiske
bax
-genet, ble oppregulert etter betulinsyre behandling i HeLa-celler. Disse resultatene tyder på at betulinsyre induserer apoptose av HeLa-celler ved å utløse både det endoplasmatiske retikulum veien og den ROS-mediert reaksjonsvei mitokondriell
relasjon:. Xu T, Pang Q Zhou D, Zhang A, Luo S, Wang Y, et al. (2014) proteomikk Undersøkelse Betulinic Acid apoptose of Human livmorhalskreft HeLa celler. PLoS ONE 9 (8): e105768. doi: 10,1371 /journal.pone.0105768
Redaktør: Daniela Flavia Hozbor, Universidad Nacional de La Plata, Argentina
mottatt: 18 april 2014; Godkjent: 26 juli 2014; Publisert: 22 august 2014
Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne forskningen ble finansielt støttet av Forestry næringens forskningsfond Special Fund for Public Welfare (201004069) og de grunnleggende forskning Midler til de sentrale universiteter ( DL13EA02-03). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Betulinic syre (3β-hydroksy-lup-20 (29) -en-28-oinsyre) (BA) er et naturlig forekommende lupane-type triterpene funnet i barken av hvite bjerketrær. BA spiller en avgjørende rolle som kilde til potensielle kreft forbindelser [1]. In vitro studier har vist at dette midlet er en potent effektivt mot en rekke forskjellige kreftceller, inkludert melanom, leukemi, colon-karsinom, lunge karsinom, prostatakarsinom og multippel myelom [2] – [8], og på samme tid, BA og dets analoger, kunne anvendes som potensielle terapeutiske midler for HIV-1-infeksjon [9], [10]. Det er vel kjent at mitokondriene spiller en viktig rolle i den intrinsiske reaksjonsvei hos pattedyr apoptose. En reduksjon i den indre mitokondrie transmembrane potensial er forbundet med BA behandling, noe som tyder på at den intrinsiske reaksjonsvei mitokondrielle er involvert i BA-indusert apoptose. Den mitokondrielle veien er innledes ved generering av reaktive oksygenarter (ROS) og reguleres av Bcl-2-familien av proteiner, som består av prosurvival (f.eks Bcl-2, Bcl-XL og Mcl-1) og proapoptotiske (Bax , Bad og BH3-bare proteiner) medlemmer [10], [11]. BA er blitt vist å indusere apoptose i en CD-95 og p53-uavhengig måte ved hjelp av en direkte effekt på mitokondrier [4], [12], [13]. Formasjoner av ROS og protein neosynthesis er rapportert å være nødvendig for BA-indusert celledød [14], [15], [16]. En tidligere studie av apoptose av BA fant at mitokondrie veien ble hemmet av BCL-2 /BCL-xL overekspresjon i humane myelomatose celler [15], induserer BA apoptose hovedsakelig gjennom en mitokondrie vei med svulst spesifisitet.
livmorhalskreft er den tredje vanligste typen av tumor hos kvinner [17]. Flere behandlinger brukes for kreft i livmorhalsen, men hver av dem har alvorlige bivirkninger. Derfor er det fremdeles nødvendig å finne en sikrere og mer effektiv behandling. BA er en plante-avledet penta triterpenoid som er giftig for kreftceller, men det har ingen effekt på utransformerte celler [1], [2], [8]. Det har blitt rapportert at BA induserer antiproliferativ aktivitet på livmorhalskreft [18], men de molekylære mekanismene for denne prosessen er ikke fullt ut forstått.
Hovedformålet med denne studien er å undersøke de underliggende molekylære mekanismer av potensielle kreft effekter av BA om menneskelivmorhalskreftceller. Global proteom profilering førte til identifisering av flere veier som reagerer på BA behandling og bidratt til å bedre forstå BAs apoptose relaterte mekanismer. I dette arbeidet har vi preget apoptose-relatert protein profilen til BA behandlet HeLa celler ved hjelp av en komparativ 2-DE proteomikk tilnærming. De molekylære biologiske funksjoner og prosesser som er involvert i mekanismen for BA-indusert apoptose vil bli diskutert. Endringer i uttrykket av fire gener som koder for apoptose relaterte proteiner ble analysert ved å utføre real-time PCR (QRT-PCR) analyse.
Materialer og metoder
Cell kultur og Proliferation Assay
BA ble kjøpt fra Boyle Chemical CO., LTD (Shanghai, Kina). Den menneskelige kreftcellelinje HeLa ble kjøpt fra Tumor Senter (Beijing, Kina). Celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Hyclone, Logan, UT, USA) med 10% FBS (PAA, Østerrike), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Hyclone, Logan, UT, USA). Celler ble sådd ut i 96-brønners mikroplater, og deretter inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2. Etter 24 timer ble mediet fjernet og erstattet med friskt medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av BA. Deretter ble 30 ul av 3 mg /ml MTT (Amresco, USA) i PBS tilsatt til hver brønn, og deretter ble platen ble ytterligere inkubert i 4 timer. Den gjenværende supernatanten ble fjernet, og 150 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn og blandet grundig for å oppløse de formazankrystaller som dannet. Etter 10 minutters inkubering, ble absorbansen for hver brønn avlest ved 490 nm ved anvendelse av en BioTek-ELISA-plateavleser (BioTek Instruments, Winooski, USA). Konsentrasjonen av BA å inhibere cellevekst med 50% (IC50-verdien), ble beregnet fra dose-responskurver. Alle bestemmelser ble utført i tre eksemplarer.
morfologiske endringer
For å oppdage morfologiske endringene som skjedde i løpet av apoptose, ble nukleær farging utført ved hjelp av en 5 mikrogram /ml Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, MO , USA) beis, og prøvene ble visualisert ved hjelp av et Nikon fluorescens mikroskop (ECLIPSE Ti-S, Nikon, Tokyo, Japan) [19].
Flowcytometri analyse av celle apoptose
BA- indusert apoptose ble observert av AnnexinV-FITC /PI farging (Beyotime Biotech, Beijing, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Flowcytometri (Partec Flow-cytometri, Tyskland) ble brukt til å analysere forskjeller i apoptose mellom kontroll og BA-behandlede (15 umol /L, 30 pmol /l og 50 umol /l) celler ved 48 timer etter behandling. Celler ble samlet opp og analysert ved å telle normale celler, på et tidlig stadium apoptotiske celler og sene stadier av apoptotiske /nekrotiske celler i tre felt av lys av mikroskopet. Datainnsamlings- og analyse ble utført ved anvendelse av Flomax programvare. Celler ble bearbeidet som beskrevet i produsentens protokoll og analysert i triplikat.
Protein forberedelse for 2-DE
HeLa-celler behandlet med 30 umol /l BA ble høstet etter 48 timers inkubering. Cellene ble vasket to ganger med iskald PBS, deretter ekstrahert med lyseringsbuffer inneholdende 7 mol /l urea, 2 mol /l tiourea, 4% CHAPS, 2% pH 3-10 /4-7 lineær IPG buffer (GE Healthcare, USA ), 20 mmol /l dithiothreilol (DTT, Sigma, USA), 40 mmol /liter Tris (Sigma, USA) og komplett mini EDTA-fri protease inhibitor cocktail (Roche, USA). Etter sonicating10 ganger i 30 s ved 30 s pauser i et is-vannbad og deretter inkubering ved 4 ° C i 1 time, ble cellelysater sentrifugert ved 14 000 rpm i en time ved 4 ° C. Proteiner i den resulterende supernatant ble kvantifisert ifølge Bio-Rad proteinanalyse-reagens i henhold til Bradford fremgangsmåten (Bio-Rad, Hercules, USA) [19].
To-dimensjonal gelelektroforese
celle protein lysatene (130 ug) ble blandet med rehydrering løsning inneholdende 7 mol /l urea, 2 mol /l tiourea, 2% CHAPS, 0,5% IPG buffer og 0,002% bromfenolblått og DTT til et sluttvolum på 450 ul. Prefabrikerte 24 cm immobilisert pH-gradient strimler (IPG, pH 3-10, pH 4-7, GE Healthcare) ble rehydrert i 12 timer ved 30 V. separasjon på en Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare, Tyskland) ble utført med følgende parametere: 100 V i 2 timer, 200 V i 1 time, 500 V i 1 time 1000 V i 1 time og 8000 V i 3 timer, etterfulgt av en trinn-for-hold og mønster på 8000 V i 8 timer. Etter isoelektrisk fokusering ble strimlene inkubert i 15 min i ekvilibrering oppløsning I (6 mol /l urea, 2% SDS, 30% glycerol, 1% DTT, 0,002% bromfenolblått, 50 mmol /liter Tris-HCl, pH 8,8) og i ytterligere 15 minutter i ekvilibrering oppløsning II (1% DTT ble erstattet med 2,5% jodacetamid). Deretter ble IPG strimler flyttet til toppen av polyakrylamidgeler og integrert ved anvendelse av 0,5% (w /v) agarose oppløsning inneholdende bromfenolblå. To-dimensjonal SDS-PAGE ble utført ved 25 ° C og 3,5 m /gel i 30 minutter og deretter 17,5 m /gel i 4 timer 30 min før den bromfenol blått fargestoff fram kommet til bunnen av gelene ved hjelp av Ettan DALT seks system (GE Healthcare). Gelene ble fiksert i en blanding av 40% etanol og 10% iseddik over natten. Proteinene ble visualisert ved sølvfarging og gel bildene ble anskaffet ved hjelp av en ImageScanner (GE Healthcare) med Bilde Master 2D Platinum Programvare Versjon 7.0 (GE Healthcare). For å oppnå pålitelige resultater fra 2-DE-bilder, var flekker godt oppløst i de tre biologiske replikater. En måling ble utført for hver biologisk replikere, og normaliserte volumer er beregnet ut fra total sted volum normalisering prosedyre av programvaren. Den normaliserte volumet av hver flekk ble antatt å representere dets ekspresjon overflod. Bare de stedene som forandret konsekvent og vesentlig (mer enn 1,5 ganger og
p
0,05). Ble valgt for massespektrometri analyse
massespektrometri og protein klassifisering
Peptide MS og MS /MS ble utført på en ABI 5800 MALDI-TOF /TOF Plus massespektrometer (Applied Biosystems, USA). Data ble kjøpt i en positiv MS reflektor bruker en CalMix5 standard for å kalibrere instrumentet (ABI5800 Kalibrering Blanding). Både MS og MS /MS-data ble integrert og behandlet ved hjelp av v3.6 programvare GPS Explorer (Applied Biosystems, USA) med standard parametere. Basert på kombinerte MS og MS /MS spektra, proteiner ble vellykket identifisert basert på 95% eller høyere konfidensintervall på deres score i maskoten V2.3search motor (Matrix Science Ltd., UK), ved hjelp av følgende søkeparametere: NCBInr-humandatabase ; trypsin som fordøyelsen enzymet; en savnet kuttesete; faste modifikasjoner av Carbamidomethyl (C); delvis modifikasjoner av acetyl (Protein N-term), deamidert (NQ), Dioxidation (W), Oksidasjon (M); 100 ppm for forløperion toleranse og 0,5 Da for fragment ion toleranse.
Basert på PANTHER klassifisering (versjon 7.2, https://www.pantherdb.org/), molekylær funksjon og biologisk prosess av den tilsvarende identifisert proteinene ble klassifisert [20]. Proteinet interaksjon nettverk generert med STRING (versjon 9.05, https://string-db.org) avslørte de funksjonelle sammenhengene mellom ulike proteiner [21], [22].
Måling av oksidativt stress
nivåene av intracellulær ROS ble bestemt ved hjelp av en ROS-analysen kit (Beyotime Biotech, Kina) etter produsentens protokoll. Cellene ble høstet etter 48 timer av 30 umol /l BA behandling og deretter vasket to ganger med PBS og inkubert med DCFH-DA (10 umol /l) ved 37 ° C i 40 min i et mørkerom for endelig analyse ved strømningscytometri. Alle bestemmelser ble utført in triplo.
RNA isolering og QRT-PCR-analyse
Total RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen, USA). Revers transkripsjon ble utført ved å bruke en PrimeScriptTM revers transkriptase (Takara, Tokyo, Japan), og transkripter ble deretter utsatt for QRT-PCR ved anvendelse av en SYBR grønn PCR-reagenser Kit (Takara, Tokyo, Japan). Kvantitative analyser ble utført i triplikat ved anvendelse av 1 pl cDNA (1:10 fortynning) og en SYBR grønn Master mix (Takara, Tokyo, Japan) og analysert ved bruk av en ABI 7500-sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems, USA). Amplifikasjon av glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en intern kontroll, og for å normalisere dataene. Detaljene i de benyttede primere er vist i tabell 1 [23].
Statistisk analyse
Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) av triplikate prøver. Statistisk analyse ble utført med statistikkprogram (SPSS versjon 17.0). Data ble analysert ved anvendelse av en-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Bonferroni s multiple sammenligninger. En verdi på
p
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Effekt av BA på spredning og apoptose av HeLa celler
HeLa celler var. behandlet med forskjellige konsentrasjoner (15 umol /L, 30 pmol /L, 50 pmol /L) av BA i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Den celleviabilitet viste en generell nedgang med økende konsentrasjoner av BA i mediet og behandlingsvarighet som analyseres ved hjelp av et MTT-assay (fig. 1A). Dette resultatet tyder på at BA hemmer proliferasjonen av HeLa-celler i en dose- og tidsavhengig måte. IC
50 var 30,42 ± 2,39 mikrometer når HeLa-celler ble behandlet med BA i 48 timer.
(A) Effekt av BA mot Hela celler som bestemmes av MTT analysen. Celler ble behandlet med konsentrasjoner av BA (0 umol /L, 15 pmol /L, 30 pmol /L, 50 pmol /L) for en angitt tid (24 h, 48 h, 72 h). Verdiene for hver konsentrasjon som ble testet BA representerer gjennomsnittet av tre forsøk ble datasett presentert som gjennomsnitt gjennomsnitt ± SD; **
p
0,01 sammenlignet med kontrollgruppen (0 umol /l BA). (B) Hoechst 33258-farging av HeLa-celler behandlet med 15 mikromol /L, 30 mikromol /l BA. Røde piler indikerer flere apoptotiske celler med typiske kondensering av kromatin.
For å finne ut om den antiproliferative aktivitet indusert av BA på HeLa-celler som ble formidlet av induksjon av apoptose, evaluert vi apoptose ved morfologisk undersøkelse med fluorescens mikroskopi og flowcytometri. Etter behandling med 15 umol /L og 30 umol /l BA i 48 timer, ble HeLa-celler farget med 5 ug /ml Hoechst 33258 og visualisert ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. Den typiske morfologi av apoptose ble påvist i BA-behandlede HeLa-celler (Fig. 1B). Denne viste det var en signifikant økning i andelen av apoptotiske celler etter BA behandling sammenlignet med kontrollceller. I tillegg BA forårsaket doseavhengig apoptose som vist ved annexinV-FITC /PI ved hjelp av flow cytometri. Den totale andelen av apoptotiske celler var 20,53 ± 0,81% (13,45 ± 0,80% av cellene tidlig apoptotiske og 7,07 ± 0,51% av celler sent apoptotiske) og 38,56 ± 1,79% (30,92 ± 1,22% av cellene tidlig apoptotiske og 7,64 ± 0,53% av cellene sen apoptotiske) for celler behandlet med 30 umol /L og 50 umol /l BA etter 48 timer, henholdsvis (som vist i fig. S1).
2-DE-analyse av forskjeller i protein ekspresjon indusert av BA
Proteomikk er en kraftig plattform for å undersøke protein uttrykk og modifikasjon som svar på konkrete fysiologiske forhold i biologiske systemer. De proteom kontroll og 30 umol /L BA-behandlede HeLa-celler ble analysert ved to-DE. To gradient-range IPG strimler (pH 3-10 og 4-7) ble brukt som den første dimensjonen. Representative 2-DE protein mønstre i pl-område på 3-10 viste at proteinene i hovedsak fokusert på pH-området 4,2 til 7,0 (Fig. 2A). For ytterligere å skille denne prøven, ble smal trekkende pH-gradienter (4-7) (Fig. 2B), slik at vi kan øke både protein belastning på geleer og oppløsningen av proteiner i dette området. Protein flekker med forandringer enn 1,5 ganger (
p
0,05) ble deretter utsatt for protein identifikasjon av MALDI TOF /TOF-MS-analyse (tabell S1). Totalt 18 protein flekker fra det brede utvalget IPG-baserte 2D gels (pH 3-10) og 19 protein flekker fra smalere utvalg IPG-baserte 2D gels (pH 4-7) viste reproduserbare og statistisk signifikante endringer i BA-behandlede prøvene sammenlignet med kontrollprøver (fig. 2). Proteiner fra alle protein flekker ble vellykket identifisert ved MS og maskot søk i databaser med høy selvtillit (tabell 2). Protein profilering (pH 3-10) viste 5 oppregulert proteiner og 13 nedregulert proteiner i BA-behandlede celler. I tillegg protein profilering (pH 4-7) viste en oppregulert protein og 18 ned-regulerte proteiner i BA-behandlede celler. Uventet, det var bare en protein (gi4826760) i overlappingen mellom pH 3-10 (Spot NO. 868) og pH 4-7 (Spot NO. 626) gels.
(A) 2-DE ble utført med 130 mikrogram protein ved hjelp av 24-cm pH 3-10 NL IPG strimler og 12,5% SDS-PAGE. (B) 2-DE ble utført med 130 mikrogram protein ved hjelp av 24-cm pH 4-7 NL IPG strimler og 15% SDS-PAGE. Gelene ble visualisert ved sølvfarging og analysert med bilde Master Software.
Funksjonelle kategorier av ulikt uttrykte proteiner
For å bedre klassifisere de identifiserte proteiner, to uavhengige kategorier av genet ontologier ble brukt for å beskrive funksjonen av genproduktene: molekylær funksjon og biologiske prosesser, som er identifisert ved PANTHER- klassifiseringssystemet. Fordi EEF (gi530425157, spot 932) var fast bestemt på å være den samme som EEF2 (gi4503483, spot 673) og GLOD4 (gi4929769, spot 146) ble ikke identifisert av PANTHER klassifiseringssystemet ble 34 endret proteiner analysert av programvaren. De identifiserte proteinene ble kategorisert i 9 grupper basert på biologiske prosesser: metabolske prosesser (31,90%), cellulære prosesser (19,10%), cellulær komponent organisasjon eller biogenesis (14,90%), utviklingsprosesser (10,60%), lokalisering (10,60%), biologisk regulering (4,30%), som reaksjon på stimuli (4,30%), flercellede organisme prosesser (2,10%) og immunsystemprosesser (2,10%) (fig. 3A). BA behandling inhiberte proteinfolding (flekk 81, 655, 1109, 613, 981), som er viktig for proteinsyntese. I tillegg er glykolyse (øye 372), oversettelse (spot 673, 885) og mRNA spleising (øye 868) involvert i metabolske prosesser og ble nedregulert av BA-behandling. BA undertrykker de fleste biologiske prosesser for å blokkere normale metabolske prosesser, for eksempel cellulære prosesser (øye 361, 128, 1087, 970, 823, 991, 842), utviklingsmessige prosesser (øye 361, 128, 1087, 970), lokalisering (øye 120, 970, 991), reaksjoner på stimuli (spot 81), flercellede organisme prosesser (stikk 81), og immunsystem prosesser (stikk 81). Faktisk er noen proteiner involvert i flere biologiske prosesser, og proteiner som var involvert i cellulære prosesser bidro også til mobilnettet komponent organisasjon (spot 361, 128, 1087, 970). I henhold til deres molekyl funksjon, ble de modulerte proteinene klassifiseres i 5 grupper: katalytisk aktivitet (36,00%), strukturell molekyl aktivitet (32,00%), binding (20,00%), translasjon regulator aktivitet (8,00%), og antioksidantaktivitet (4,00% ) (fig. 3B). I den katalytiske aktivitet kategori, protein-disulfid-isomerase-aktivitet (øye 655, 1109) og oksidoreduktase aktivitet (øye 542, 526, 1120, som er i det mitokondrielle elektrontransportkjeden) ble hemmet av BA behandling. Samtidig antioksidantaktivitet (øye 542) ble også redusert med BA behandling. I tillegg har de fleste proteiner involvert i strukturell molekyl aktivitet (spot 81, 361, 1085, 1087, 970), binding (øye 128, 573, 868) og oversettelse regulator aktivitet (øye 673, 885) ble betydelig redusert i BA behandlet HeLa-celler .
Basert på PANTHER klassifisering og genet kategori, biologisk prosess (A) og molekylær funksjon (B) av de tilsvarende identifiserte proteinene ble klassifisert.
Et protein interaksjon nettverket ble generert av STRING, som gir en forbedring i funksjonell analyse (fig. 4). Proteinet interaksjon nettverket gir en plattform for å analysere de identifiserte proteiner «funksjoner, protein-protein interaksjoner, biologiske pathways og molekylære funksjoner. Følgelig ble fire store nettverk generert: (1) neurotrofin signalveien, (2) langvarig depresjon, (3) arytmogene høyre ventrikkel kardiomyopati, og (4) VEGF signalveien. MAP2K2 (sted 942), YWHAB (øye 823) og YWHAE (øye 842) var de sentrale proteiner i de samvirkende nettverkene, og deres nivåene ble redusert med BA behandling, som kan spille en viktig rolle i den neurotrofin signalveien. Av de identifiserte proteinene blir 14-3-3 proteiner involvert i mange fysiologiske trasé, og disse proteinene har vist seg å være ansvarlig for vekst og apoptotisk kapasitet på mange ondartede svulster.
De endrede proteiner fra proteomikk analysen ble lastet opp til STRING verktøy for å identifisere funksjonelle signalnettverk. De predikerte funksjonelle linker bestå av opptil åtte linjer. En farge for hver type bevis
ROS generasjon i BA-behandlede HeLa-celler
ROS spiller en viktig rolle i apoptoseinduksjon fordi det er involvert i mitokondriemembranen permeabilization og celledød induksjon. I henhold til proteinet profilering av BA-behandlede celler, UDP-glukose-6-dehydrogenase (øye 526), 6-fosfoglukonat-dehydrogenase (base 1120) og peroksydase enzym (øye 542) var involvert i den biologiske prosessen med oksidase stressrespons, hvilken korrelerer med BA-indusert apoptose av HeLa-celler. Nivået av ROS-produksjon ble påvist etter behandling av HeLa-celler med BA (15 umol /L, 30 pmol /L) i 48 timer. Nivået av ROS i BA-behandlede celler økt betydelig. Nivået av ROS i BA-behandlede celler var 9,28 ganger og 12,77 ganger høyere enn nivået på ROS i kontrollceller for behandlinger av 15 mikromol /l og 30 mikromol /l, henholdsvis, og en oppregulert tendensen ble observert i hele eksperimentet (fig. 5). Disse resultatene tyder på at BA induserer apoptose gjennom aktivering av ROS-mediert celle-død mekanismer i HeLa-celler.
HeLa-celler ble behandlet med 15 umol /L, 30 pmol /l BA i 48 timer og deretter inkubert med 10 mmol /l DCFH-DA i 40 min. Det fluorescerende intensitet av DCFH ble målt ved flow-cytometri. (A) Faktisk spektra fra et representativt enkelt eksperiment. (B) Fluorescensintensiteten av fargede celler ble bestemt ved flow-cytometri. Søylene viser middelverdier av tre eksperimenter (± SD). **
p
0,01 sammenlignet med kontrollgruppen (0 umol /l BA)
QRT-PCR-analyse av gener som er involvert i BA-indusert celle apoptose
.
Fordi 14-3-3 proteiner er involvert i mange fysiologiske reaksjonsveier, inkludert vekst og apoptose, uttrykk forandringer i de to gener som koder for det identifiserte 14-3-3 familien av proteiner som ble valgt ut for videre analyse ved QRT-PCR. Den nedregulering av de to utvalgte gener (
14-3-3β Hotell og
14-3-3ε
) ved transkripsjon nivået var i samsvar med de to-DE data. Uttrykket nivåer av
14-3-3β Hotell og
14-3-3ε
signifikant nedregulert av BA behandling. Gener
BCL-2 Hotell og
Bax
ble undersøkt for ytterligere å utforske rollene til ROS opphopning i BA-indusert apoptose fordi mitokondrie veien er regulert av prosurvival Bcl-2 og proapoptotiske Bax. Ekspresjonsnivået av
Bcl-2
ble observert til å være betydelig lavere enn kontrollnivået. I kontrast, uttrykk for proapoptotiske
Bax
ble betydelig økt i forhold til kontrollene ved QRT-PCR (Fig. 6).
HeLa-celler ble behandlet med 30 mikromol /L BA i 24 timer og deretter Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av en Trizol reagens. Søylene viser middelverdier av tre eksperimenter (± SD). *
p
0,05, **
p
. 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen (0 mikromol /L)
Diskusjoner
BA, til et naturlig forekommende penta triterpenoid med potensial dreper melanomceller [1], er blitt vist å indusere apoptose i mange cancercellelinjer [2] – [8]. BA er blitt rapportert å være blottet for cytotoksiske virkninger overfor friske celler. Normale celler, slik som dermale fibroblaster, lymfoblaster fra perifert blod [2], [14] melanocytter og humane astrocytter [15], har vist seg å være motstandsdyktig mot BA behandling in vitro. Flere studier har gitt betydelig innsikt i BA-indusert cytotoksisitet. BA også undertrykkes tumorvekst in vivo i et antall dyrestudier. I en xenograft mus modell av eggstokkreft administrasjon av BA betydelig økt overlevelse [25]. Schettino, M T utnyttet BA i behandling av humant papilloma virus som anses nødvendig for utvikling av livmorhalskreft, tyder resultatene BA kan være en av lovende legemidler til behandling av livmorhalskreft [26]. Målet med denne studien var å belyse den molekylære mekanismen (e) av apoptotiske virkninger av BA i en livmorhalskreft cellelinje (HeLa) og for å undersøke effekten av BA på veksten av HeLa celler.
for å bestemme den passende konsentrasjon av BA for proteomic forsøkene ble HeLa-celler behandlet med en serie av BA-konsentrasjoner i 24 timer, 48 timer og 72 timer, og deretter cellenes levedyktighet ble målt ved hjelp av et MTT-analyse, og apoptose hastigheten ble analysert ved flow cytometri. Resultatet avslørte BA hemmer proliferasjonen av HeLa-celler i en dose- og tidsavhengig måte, og IC
50 var 25,93 ± 1,87 uM i 72 timer, som var konsistent med IC
50 (26,0 ± 2,1 uM) fra Rita C testet i HeLa-celler eksponert for BA behandling i 72 timer [24]. Det ble observert betydelig veksthemming og celle apoptose når cellene ble eksponert for 30 umol /l BA i 48 timer. For å overholde en standard som celle apoptose bør induseres men nok levende celler bør også opprettholdes for protein utvinning og proteomikk studien, 30 mikromol /l BA ble valgt for behandling av HeLa-celler.
Proteomics tilbyr en metode for å identifisere hvilke proteiner mekle apoptotiske baner i celler behandlet med kjemoterapi [27] – [29]. Fordi den molekylære mekanismen involvert i induksjon av spredning hemming og apoptose av BA er fortsatt ikke klart, gjennomførte vi en proteomikk ordningen til globalt søk etter differensielt uttrykte proteiner i HeLa celler påvirkes av BA. De fleste proteiner (30 plasser) ble redusert og noen proteiner (6 flekker) ble forbedret med BA behandling. Funksjonell kategori analyse tyder på at endringer i proteinekspresjon etter BA behandling er forbundet med forskjellige biologiske prosesser og molekylære funksjoner. Disse resultatene tyder på at BA-indusert apoptose av HeLa-celler i hovedsak baserer seg på hemming av proteiner involvert i syntese og metabolisme.
Blant de femten metabolske prosesser knyttet proteiner, to av oppregulert proteiner (HSPA5, spot 613 og PLIN3, flekk 248) er involvert i det endoplasmatiske retikulum (eR) bane, som er involvert i komplekse apoptotiske respons. ER stress respons kan fremme cellulær reparasjon og forlenget overlevelse ved å redusere belastningen av ufoldete proteiner gjennom global dempning av proteinsyntese eller opp-regulering av anstand, enzymer og strukturelle komponenter av ER [30]. Selv om mekanismen er fortsatt uklart når ER stress er overveldende, celler gjennomgå apoptose [31]. Den glukoseregulerte protein HSPA5 (øye 613), som er en ER-resident chaperon, svarer til ER sti gjennom et nettverk av regulatorer og nye mekanismer som fører til vekst arrest [32]. Cargo, inkludert PLIN3 (øye 248), er translocated inn på akuttmottaket og deretter innlemmet i små vesikulær bærere som formidler transport til Golgi avdelinger [33]. En annen oppregulert protein er IL18 (flekk 27), en ny pro-inflammatorisk cytokin som induserer ekspresjon av tumor nekrose faktor a (TNF-a) og Fas-ligand, så vel som kjernetranslokasjon av nukleær faktor kB (NF-kB) [ ,,,0],34], [35]. NF-kB er en viktig regulator for stress-indusert transkripsjonen aktivering, og BA er også blitt rapportert å inhibere inflammatoriske aktivering av NF-kB [36]. I dette arbeidet, ble oppregulert protein uttrykk oppdaget, noe som kan megle ER prosessen med BA i HeLa celler.
To nedregulert antioksidantaktivitet proteiner, UGDH (øye 526) og PGD (spot 1120) , katalyserer oksidasjonen av C6-alkoholer til karboksylsyrer i to suksessive NAD
+ – avhengige trinn uten frigjøring av et mellomliggende aldehyd, og disse proteinene er meget viktig for den elektronoverføring kjeden i mitokondriene [37], [38]. I tillegg kan antioksidantaktivitet protein PRDX6 (øye 542) gi beskyttelse mot nitroxidative stress og reparasjon oksidativt skadede molekyler, og dette proteinet spiller en viktig rolle i spyle ROS i fysiologiske forhold [39]. På samme tid, ble nivået av ROS produksjon detektert ved strømningscytometri økt etter behandling av HeLa-celler med BA, og dette resultatet er i overensstemmelse med resultatene av tidligere oksidoreduktase aktivitetsanalyser og kan bidra til å forklare de apoptotiske virkninger av BA. Disse resultatene indikerer at mitokondriene reaksjonsveien ble aktivert ved BA, som deretter indusert apoptose av HeLa-celler. Oksidativt stress har vært kjent for å være en mediator av apoptose indusert av en rekke triggere, og mitokondriene anses som sensorer for oksydativ skade og kan spille en viktig rolle i apoptose [40], [41]. Den BCL-2 familie av proteiner kan regulere mitokondriene sti gjennom å endre mitokondriemembranen permeabilization [42]. Antiapoptotic Bcl-2 og proapoptotiske Bax er svært viktig for formidling av den ytre mitokondriemembranen permeabilization og mitokondrie vei apoptose [43]. Vi fant ut at BA behandling trykkes uttrykk for
BCL-2
transkripsjoner, tilrettelagt uttrykk for
Bax
av QRT-PCR.
