Abstract
Innledning
Vi har tidligere identifisert felles forskjellig uttrykt (DE) gener i blærekreft (BC). I denne studien analyserte vi i dybden, uttrykket av flere grupper av disse DE genene.
Materialer og metoder
Prøver fra 30 menneske Bachelor og deres tilstøtende normalt vev ble analysert ved hele genomet cDNA mikromatriser, QRT-PCR og Western blotting. Vår oppmerksomhet ble rettet mot cellesykluskontroll og DNA-skadereparasjonsgener, gener relatert til apoptose, signaltransduksjon, angiogenese, så vel som cellulær proliferasjon, invasjon og metastase. Fire offentlig tilgjengelige GEO datasett ble ytterligere analysert, og uttrykket data av gener av interesse (Goiss) ble sammenlignet med de ifølge foreliggende studien. Forholdet mellom GOI ble også undersøkt. GO og KEGG molekylær sti analyse ble utført for å identifisere mulig anrikning av gener med spesifikke biologiske temaer.
Resultater
Unsupervised cluster analyse av DNA microarray data avdekket et klart skille i BC vs. kontrollprøver og lav kontra høy klasse svulster. Gener med minst 2-ganger forskjell ekspresjon i BC lignet med kontroller, så vel som i ikke-invasiv muskelsammenlignet med muskel invasive tumorer og i tumorer lave sammenlignet med høygradig, ble identifisert og rangert. Spesifikk oppmerksomhet ble betalt til endringer i osteopontin (OPN, SPP1) uttrykk, på grunn av sine mange biologiske funksjoner. Tilsvarende gener utviser lik eller lavt uttrykk i BC vs. kontrollene ble scoret. Vesentlige parvise korrelasjoner i genuttrykk ble scoret. GO analyse viste multi-fasett karakter av Gois, fordi de deltar i en rekke forskjellige mekanismer, inkludert celleproliferasjon, celledød, metabolisme, celleform, og cytoskeletal omorganisering. KEGG analyse viste at den viktigste veien var at av blærekreft (p = 1,5 × 10
-31).
Konklusjoner
Den nåværende arbeid legger til dagens kunnskap om molekylær signatur identifisering av BC. Slike arbeider bør gå frem for å få mer innsikt i sykdoms molekylære mekanismer
Citation. Zaravinos A, Lambrou GI, Volanis D, Delakas D, Spandidos DA (2011) Søkelys på forskjellig uttrykt gener i kreft i urinblæren. PLoS ONE 6 (4): e18255. doi: 10,1371 /journal.pone.0018255
Redaktør: I. Kong Jordan, Georgia Institute of Technology, USA
mottatt: 13 oktober 2010; Godkjent: 01.03.2011; Publisert: 05.04.2011
Copyright: © 2011 Zaravinos et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i urinblæren (BC) er den vanligste. malignitet i urinveiene, ansvarlig for betydelig dødelighet og sykelighet på verdensbasis. I Europa er anslagsvis 105.000 nye tilfeller av blærekreft diagnostisert årlig, mens ca 30 000 pasienter dør av blærekreft hvert år [1]. Dens forekomst øker direkte med alderen, blir sjelden før fylte 50, og det er tre til fire ganger mer vanlig hos menn enn kvinner. Nesten alle blære kreft er Kreftsvulster, som følge av overgangs epitel. Oppførselen til overgangsordning celle carcinoma (TCC) er svært mangfoldig og definert av to separate, men relaterte prosesser: tumor tilbakefall og progresjon. På presentasjonen, er 75-85% av svulster begrenset til slimhinnen, eller invadere
lamina propria slimhinner
. Det gjenværende Liggende med invasjon av muskellaget av blæreveggen eller utvide til perivesical vev, organer og tilstøtende bekkenveggen. Mer enn 60% av de overfladiske svulster vil gjenta seg minst en gang og fremgang til mindre differensierte eller invasive svulster med dårligere prognose i en betydelig prosentandel av pasienter [2]. Den mest nyttige prognostiske parametere er svulst klasse, scene, størrelse, før tilbakefall og synkron nærvær av CIS [3]. Likevel kan bedre forståelse av den naturlige historien til TCC forventes på klarlegging av de molekylære mekanismene for TCC.
Vi har tidligere identifisert vanlige forskjellig uttrykt (DE) gener i urin BC [4]. I den foreliggende undersøkelse ble vår interesse rettet mot analyse av ulike grupper DE gener, slik som gener som er involvert i kontrollen av cellesyklusen, DNA-skade reparasjon, apoptose, signaltransduksjon, transkripsjonsfaktorer, angiogenese, cellulær proliferasjon, invasjon og metastasering. Vi utforsket uttrykk profil i BC vs. friskt vev, i ikke-muskel-invasiv (stadium T1) vs. muskel-invasiv tumorer (stadium T2-T4), og i lave høy klasse svulster vs. av microarray analyse. Våre resultater ble ytterligere validert ved immunhistokjemi, qPCR og Western blotting. Videre utførte vi GEO beregningsanalyse i microarray data hentet fra andre offentlig tilgjengelige datasett, og sammenlignet dem med våre resultater.
Våre resultater fokusert på gener som spiller en betydelig rolle i de viktigste cellulære prosesser og viste en stor forskjell i deres uttrykk mønstre mellom BC og kontrollprøver. Gener med minst to ganger differensial uttrykk i BC vs kontroller, så vel som i ikke-muskel-invasiv vs. muskel-invasiv svulster, og i tumorer lave vs. høy klasse, ble identifisert og rangert.
Materiale og metode
Study design og clinicopathological data
Paret tumor og normale vevsprøver fra en rekke av 30 pasienter med nylig diagnostisert Bachelor gjennomgår transurethral blære tumor reseksjon ved Institutt for Urologi, » Asklipieio «General Hospital, Athen, ble kjøpt etter mengden vev er nødvendig for rutine patologi undersøkelse hadde blitt fjernet (tabell 1). Alle vevsprøver ble klassifisert og gradert etter samme patolog. Kreftpasienter ble kategorisert i henhold til muskel-invasiv (T2, T3 eller T4) og ikke-invasive svulster (Ta, T1 og CIS). For sammenligningsformål med tidligere rapporter, ble 1973 World Health Organization (WHO) gradering system [lav karakter (karakterer 1-2) og høy grad (grad 3)] brukt i denne studien som fortsatt er den mest brukte system tross erstattet av 2004 WHO /International Society of urologisk patologi (ISUP) klassifiseringer [5]. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter som er inkludert i denne studien. Studien protokollen ble godkjent av etikkomiteen ved University of Crete. Kriteriene som ble brukt var elektivt resected primære Bachelor og tilgjengeligheten av DNA fra normal og svulstvev for biomolekylære analyser. Eksklusjonskriterier var en historie med tidligere neoplasmer og cellegift eller strålebehandling før operasjonen
Vevsprøver ble oppnådd ved kirurgi fra svulsten og følgende tre grovt normale utvalgte områder (kald kopp biopsier). Posterior vegg, trigone, og området grenser til svulsten. Deler av resected normale prøver ble sendt til histopatologisk analyse. Tumor og normalt vev ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen, transportert og lagret ved -80 ° C til DNA-ekstraksjon.
Pasienter med ikke-muskel-invasiv BCs ble fulgt opp med periodiske cystoskopisk undersøkelser og intravesikal behandling som angitt. Pasienter med invasive BCs ble tilbudt radikal cystektomi med eller uten systemisk kjemoterapi. Etter en gjennomsnittlig oppfølging på 24 ± 3 måneder, 8 (26,6%) av pasientene hadde tilbakevendende svulster. I Ta svulster /T1 frekvensen av tilbakefall var 29,4% (5/17) sammenlignet med 23% (3/13) av T2-T3 svulster. Hos pasienter med ikke-muskel-invasiv Bachelor, progresjon rente var 11,1% og 22,2% for klasse 2 og klasse 3 svulster, henholdsvis. Alle tilbakefall ble påvist av biopsi.
Immunohistochemistry
Profiler, 3 mm tykk, av formalinfiksert, ble parafin-embedded tissue kuttet og lagt på objektglass belagt med 3-aminopropyltriethoxysilone. Platene ble tørket ved 56 ° C i 1 time før immunohistokjemisk farging. Vevssnitt ble deparaffinized i xylen før rehydratisering i graderte alkoholer, og endogen peroksidase-aktivitet ble blokkert ved behandling med 3% H
2o
2 ved romtemperatur i 15 min. Antigen avsløring ble utført ved 30 minutters inkubering ved 80 ° C i 10 mM trinatriumcitratoppløsning (pH 6.1). Farging og åpenbaring ble utført på en Dako automatisere. Platene ble inkubert ved romtemperatur med primære polyklonale geite-antistoffer mot anti-ErbB2 (1:800; Dako), cyklin D1 (1:100, SP4, Epitomics), monoklonalt antistoff mot anti-p53 (1:250, E26; Epitomics) og monoklonalt antistoff mot anti-Ki-67 (1:100, SP6, Epitomics). Epitoper av det primære antistoff ble lokalisert ved immunperoksydase teknikk ved hjelp av sekundære antistoff avidin-biotin kompleks og peroksydasesubstrat kit (kit 5001, Dako) i henhold til produsentens protokoll. Seksjonene ble deretter behandlet med Chromagen 30-30 diaminobenzidene -tetrahydroklorid å identifisere områder av immunoprecipitation ved lysmikroskopi. Til slutt, delene ble vasket, kontra med hematoksylin og montert under dekkglass. Ingen spesifikk farging ble observert når det primære antistoff ble utelatt fra protokollen (negativ kontroll). Spesifisiteten til farging ble ytterligere kontrollert ved samtidig farging av brystkreft prøver med kjent ErbB2, cyklin D1, p53 og Ki67 uttrykk mønstre. En erfaren patolog scoret fargeintensitet på fire nivåer (negative, svake, moderate og sterke), vurderer både fargeintensitet og antall fargede celler. I korte trekk, representert andelen stillingen beregnet prosentandelen av positive-farget tumorceller (0 = 0%; 1 = 1%, 2 = 1 til 10%, 3 = 10 33%; 4 = 33 til 66%; 5≥ 67%), og intensiteten poengsum representert dypet av tumor cellefarging (1 = svakt positive, 2 = moderat positive;. 3 = sterkt positiv)
RNA rensing og cDNA forberedelse
Vi har isolert total RNA fra rått tumorbiopsiprøver ved hjelp av en kraft-homogenisator og TRIzol® reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), som beskrevet tidligere [6], [7]. Vi brukte 2 ug total RNA som utgangsmateriale for cDNA-preparat. Vi gjennomførte den første og andre-tråd cDNA syntese bruker StrataScript First-Strand Synthesis System, som tidligere beskrevet [8].
Microarray analyse
oligos microarray chips (~57K gener) var innhentet fra GE Healthcare (IL) og AppliedMicroarrays (MA) (Code 57K Menneskelig Whole Genome). Hybridisering ble utført med Code RNA forsterkning og merking kit, utnytte Cy5 fluorescerende fargestoff. Lysbilder ble skannet med en microarray scanner (ScanArray 4000XL). Bilder ble generert med ScanArray microarray oppkjøpet programvare (GSI Lumonics, USA). CRNAs fra tre forsøksoppsett ble benyttet i enkle eksperimenter med innvendige pigger som kontroller. De eksperimentelle oppsett besto av 10 urin BC prøver av ulike histologier (T1 /2-klasse 3, T1-klasse 1/2, T3-grad 3) og 5 kontrollprøver. De skannede bildene ble videre behandlet med Code Expression Analysis Software v5.0 fra Amersham Biosciences. Det eksperimentelle oppsettet ble analysert basert på referanse utforming som tidligere beskrevet [9], [10], [11]. Alle tumorprøver ble sammenlignet mot middelverdien for kontrollprøvene. Bakgrunn korreksjon ble utført ved å subtrahere median globale bakgrunn fra median lokal bakgrunn fra signalintensiteten. En terskel på 2 ble satt som cut-off, noe som betyr at flekk intensitet i minst en kanal bør være to ganger så mye som for bakgrunnen. Microarray data ble normalisert ved å dele stikk intensiteter av den globale median. Normaliserte data ble hentet, pre-behandlet og sortert med Microsoft Excel®. Array data er tilgjengelig på Gene Expression Omnibus (National Center for Biotechnology Information) med deponeringsnummer GSM678186 gjennom GSM678385 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27448). Videre ble hvert gen testet med hensyn til sin betydning i differensiell ekspresjon ved hjelp av en z-test. Gener ble ansett for å være vesentlig forskjellig uttrykt hvis de fikk en p-verdi 0,05. Den falske Discovery ble beregnet som tidligere beskrevet [12], [13], [14]. Gener ble videre klassifisert ved hjelp av to-veis (gener-mot prøver) gjennomsnittlig binding hierarkisk clustering med euklidske avstand ved hjelp av Genesis 1.7.2-programvaren (Technische Universitaet-Graz, Østerrike) [15].
Sanntids PCR validering
transkriberes produkter ble utsatt for real-time PCR-analyse med SYBR Grønn jeg i en Mx3000P programmerbar termisk controller apparat (Stratagene, La Jolla, CA). Primerene ble konstruert for å strekke seg over minst ett intron for å unngå amplifisering av kontaminerende genomisk DNA sammen med cDNA. Deres sekvens og de tilsvarende PCR-produkt størrelser er angitt i tabell S1. GAPDH og ACTB gener ble brukt som intern kontroll [16].
En mikroliter av cDNA fra normale eller TCC prøver, henholdsvis, ble forsterket i en PCR reaksjon med 2x Brilliant SYBR® Grønn QPCR Master Mix (som inneholdt 2,5 mM MgCl
2), 300 nM av hver primer og 30 uM Rox passiv referanse fargestoff i et endelig volum på 20 ul. Etter innledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, ble prøvene underkastet 40 cykler forsterkning som omfatter denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 60 ° C i 30 sek, og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek. Forsterker og forlengelsestrinn ble etterfulgt av en smelte kurve analyse hvor temperaturen ble økt fra 55 ° C til 95 ° C ved en lineær hastighet på 0,2 ° C /sek. Datainnsamlingen ble utført i løpet av både gløding og forlengelse, med to målinger ved hvert trinn, og til enhver tid under smeltekurve analyse. For å kontrollere resultatene av smelten kurve analysen ble qPCR produktene analysert ved elektroforese på 2% agarosegel farget med etidiumbromid og fotografert på en UV-transilluminator (figur S1). I hver reaksjon qPCR to negative kontroller ble inkludert, en uten cDNA templat og en med ingen revers transkripsjon behandling. Alle prøver ble behandlet i duplikat. Gene transkripsjonsnivåer ble beregnet ved anvendelse av ΔΔCt metode, som tidligere beskrevet [17], [18].
Total protein utvinning og Western blot-analyse
Etter tilsetning av 250 ul iskald GST- fisk lyseringsbuffer (10% glycerol, 50 mM Tris (pH 7,4), 100 mM NaCl, 1% (v /v) Nonidet P-40, 2 mM MgCl
2, og en protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland), den homogeniserte vevsprøver ble sentrifugert ved 14 000 xg i 15 min ved 4 ° C, for å fjerne uoppløselig materiale, og supernatanten ble oppsamlet og lagret ved -80 ° C. Protein konsentrasjon av hver prøve ble bestemt ved metoden til Bradford ved bruk av en proteinanalyse fargereagens (Bio-Rad, Hercules, CA). prøver ble oppløst i LDS-prøvebuffer (Invitrogen) og oppvarmet ved 70 ° C i 7 min. Like mengder av prøvene (20-30 ug) ble underkastet elektroforese i NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) og overført til en 0.45- um nitrocellulosemembran (Bio-Rad Laboratories, Inc.). membranen ble neddykket i 5% fettfri melk eller BSA, 0,1% Tween 20 og oppløst i Tris-bufret saltvann for å blokkere ikke-spesifikk binding. Membranene ble inkubert over natten ved 4 ° C med følgende primære antistoffer: mus polyklonalt anti-HRAS (fortynnet 1:1,000; Abnova, CA), muse-monoklonalt anti-CDKN2A (fortynnet 1:500; Abnova, CA), musemonoklonalt anti -p53 (fortynnet 1:500; klone DO-7; BD Transduction Laboratories), mus monoklonalt anti-VEGFA (utvannet 1:500, Santa Cruz Biotechnology, CA), kanin polyklonale anti-TGFβ1 (utvannet 1:1000, Novus Biologicals, CO) og mus monoklonalt anti-OPN (utvannet 1:500, Santa Cruz Biotechnology, California). Membranene ble deretter vasket og inkubert i 90 min. ved RT med et sekundært antistoff som inkluderte pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-kanin eller anti-mus IgG (fortynnet 1:1,500; Santa Cruz Biotechnology). Western blot ble normalisert ved hjelp av et monoklonalt anti
β-actin antistoff (fortynnet 1:5,000, Sigma Chemicals, St. Louis, MO). De spesifikke signalene ble visualisert ved ECL-reagens (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ) etter utredning til ECL film. Den relative tettheten av polypeptid band oppdaget på ECL filmen ble bestemt ved bruk av spot DENSO verktøy for AlphaEaseFC programvare.
GEO Datasett beregningsanalyse
Computational analyse ble utført for å ytterligere undersøke forskjellene i den OPN, VEGFA, TGFβ1, FGF2, EGFR, EGF, P14
ARF, p16
INK4A, p53, KRAS, HRAS, NRAS, Araf, BRAF, RAF1, RKIP, MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 og CyclinD1 transkripsjonsnivåer mellom ulike urinblæren krefttyper, sin metastatisk motstykke og den relative normalt vev. Fire offentlig tilgjengelig Gene Expression omnibus (GEO) datasett ble analysert på grunn av dette, med GEO serie deponeringsnummer GSE89, GSE7476, GSE3167 og GSE12630 [19], [20], [21]. Expression mønstre av genene ble hentet fra de normaliserte datasett og ble uttrykt som gjennomsnittlig nivå av loggen
2 intensitet (tabell S2).
Gene ontologi (GO) og Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG ) analyse
Gene ontologi (GO) og Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) molekylær pathway analyse ble utført for å identifisere mulig anrikning av gener med spesifikke biologiske temaer (https://www.genome.jp/kegg /pathway.html).
Statistisk analyse
Microarray data ble normalisert ved den globale median på spot intensiteter. Hvert gen ble testet med hensyn til sin betydning i differensiell ekspresjon ved hjelp av en z-test. GOI uttrykk nivåer ble først vurdert av one-sample Kolmogorov-Smirnov Godhet-of-Fit test for å fastslå om de fulgte en normalfordeling mønster. Den ikke-parametrisk Spearman rank korrelasjon ble brukt til å undersøke parvise korrelasjoner mellom mRNA nivåer og deres tilknytning til kontinuerlige variabler (alder, røyking, tumorstadium /klasse). Mann-Whitney U-test ble anvendt for å undersøke status ekspresjon av genene med de forskjellige parametre clinicopathological etter lagdeling. Kaplan-Meier-metoden ble brukt for å anslå total overlevelse som en funksjon av tid. Overlevelses forskjeller ble vurdert av Log-rank (Mantel Cox) og Gehan-Breslow-Wilcoxon-tester. Numeriske verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD), og medianverdier. Data hentet fra GEO databaser ble statistisk sammenlignet med Mann-Whitney U test. Statistisk signifikans ble satt til 95% nivå (p 0,05). Alle statistiske analyser ble utført med SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL).
Resultater
Immunohistokjemiske resultater
tumorprøver ble farget med antistoffer for ErbB2, cyclin D1, p53 og Ki-67 (figur 1). Hvis til stede, anti-ErbB2-farging i tumorprøver er en membranfarging, diffus i urothelium. Alle BC prøver (100%) viste moderat /sterk (++, +++) farging, mens ingen BC prøven viste ingen /svak farging (0, +) for ErbB2. Terskler for høye merkeindeksene ble satt for Ki-67 på ≥10% positiv tumor kjerner og for p53 ved 10 og 20%. T1-klasse 1/2 svulster viste svak farging for anti-Ki-67 (7,5% og 40%, henholdsvis), mens T1 /2-grade 3 svulster viste den sterkeste farging (+++, 70%). Tilsvarende T1-grad 1/2 tumorer viste svak farging for anti-p53 (10% og 35%, henholdsvis), mens T1 /2-klasse 3 tumorer oppviste den sterkeste immunfarging (53-70%). Angå Cyclin D1, alle svulster viste intens farging for anti-Cyclin D1, mens de av en høyere klasse utstilt relativt lavere farging. For T1-klasse 1/2 svulster, farging for anti-Cyclin D1 var 80%; mens for T1 /2-grade 3 svulster farging var 50%.
Svulster ble farget med anti-cerbB2, anti-Ki67, anti-p53 og anti-Cyclin D1. H . E, Representasjons hematoksylin-eosin lysbilder
microarray uttrykk og klynger på en 22-genet satt
Vi har tidligere identifisert 831 gener som ble forskjellig uttrykt i alle 10 BC prøver, samtidig. Av disse ble 33 gener oppregulert og 85 genene ble nedregulert i alle blærekreft prøvene sammenlignet med de 5 normale vev, samtidig (data ikke vist). I denne studien, utførte vi to-veis gjennomsnittlig binding hierarkisk clustering med euklidske avstand for en 22-genet sett som inkluderte følgende gener: VEGFA, Araf, BRAF, OPN (SPP1), MMP2, KRAS, NRAS, TGFβ1, akt1 , HRAS, TIMP1, EGF, RKIP (PBP), FGF2, EGFR, RAF1, CDKN2D, TP53, CDKN2A (P14
ARF /p16
INK4A), MMP9 og MKI67, i 10 BC prøver vs. 5 kontroller. Et detaljert riss av prøven klyngen dendrogram er vist i figur 2A. Vi analyserte loggen
2 forvandlet fold uttrykk mønster av GOI og partisjonert svulstene inn i 3 hovedgrupper basert på differensial uttrykk for disse 22 genene: Det første prinsippet gren inneholdt T1-grad 3, T2-grad 3, T1 grad 2 og T3-klasse 3 svulster. Den andre grenen besto av T1-grad 2 og T2-klasse 3 svulster. Den tredje grenen besto av svulster med in situ karsinom, T2-grad 3 (CIS). 22-genet settet ble delt i to hoved klynger. Den første klyngen var sammensatt av gener som var over-uttrykt (VEGFA, Araf, BRAF, OPN, MMP2, KRAS, NRAS, TGFβ1, akt1, HRAS og TIMP1) og den andre gruppen inneholdt gener som var like eller under-uttrykk (EGF , RKIP /PBP, FGF2, EGFR, RAF1, CDKN2D, TP53, CDKN2A, MMP9 og MKI67) i TCC vs. normalt vev. De relative ekspresjonsnivåer av det Goiss i hver tumor gruppe ble uttrykt som et forhold av de normaliserte ekspresjonsnivåene fra svulsten gruppen til de midlere nivå av de normale vev, som ble satt til 1,0 (figur 2B og Tabell S2).
hver linje på diagrammet representerer en genet og hver søyle en tumorprøve. Fargemetningen representerer forskjeller i genekspresjon på tvers av tumorprøver; rødt indikerer uttrykk høyere enn medianen (svart), og grønn indikerer uttrykk lavere enn medianen. Fargeintensiteten indikerer grad av genregulering (A). Brett ekspresjon av Goiss med hensyn til tumorhistologi, som detektert av mikromatriseanalyse (B).
fold uttrykket (gjennomsnitt ± SD) av Goiss i hver og en av de tre tumor gruppene sammenlignet normalt vev, som ervervet ved vår microarray analyse, er avbildet i (figur S2)
Verifisering av mRNA og protein uttrykk i forhold til clinicopathological egenskaper
mRNA uttrykk av genene. VEGFA, Araf, BRAF, OPN (SPP1), MMP2, KRAS, NRAS, TGFβ1, akt1, HRAS, EGF, RKIP (PBP), FGF2, EGFR, RAF1, TP53, CDKN2A (P14
ARF /p16
INK4A) , MMP9 ble bestemt ved qPCR i både blærekreft og normalt vev (tabell S3). Scatter tomter ble konstruert for bedre visualisering av genene som var oppregulert ( 2 ganger), nedregulert ( to ganger) eller like uttrykt (2 ganger forskjellsterskel) mellom BC og kontroller. Volcano tomter grafiske loggen
2 av ganger endring i uttrykket av hvert gen mellom BC prøver vs. sin p-verdi fra t-test, ble også bygget (figur 3).
Den sorte linje angir fold forandringer 1. de rosa linjene angir terskelen i genekspresjon fold-endring (2-gangers forskjell). qPCR avslørt opp- og ned-regulert gener i kreft i urinblæren. Total RNA fra normal tilstøtende vev og kreft i urinblæren ble karakterisert i tekniske triplo, og de relative uttrykk nivåer for hvert gen i de to vevstyper ble plottet mot hverandre i spredningsdiagram. VEGFA, OPN, P14
INK4A, p6
CDKN2A, NRAS og TGFβ1 ble oppregulert, mens FGF2 og EGF ble nedregulert med minst to ganger (utenfor lilla linjer). Genene KRAS, MMP2, akt1, p53, EGFR, MMP9 og HRAS utstilt lik uttrykk mellom blærekreft og normalt vev (A). Vulkanen Plot grafer loggen
2 av ganger endring i uttrykket av hvert gen mellom BC prøvene versus dens p-verdi fra t-test. Den svarte linjen angir fold endringer av 1. De rosa linjene indikerer terskelen i genuttrykk fold-endring (to-fold forskjell). Den blå linjen viser terskelen for p-verdien for t-test (0,01) (B).
Genene OPN, VEGFA, TGFβ1, p16
INK4A, p53, RKIP og NRAS var betydelig over uttrykt i BC vs. normalt vev (p 0,001; t-test) (figur S3A). De gjennomsnittlige mRNA expression verdier mellom BC og normalt vev for hvert gen er avbildet i tabell 2.
mRNA uttrykk nivåer av gener P14
ARF, akt1, HRAS, Araf, BRAF, RAF1 , MMP9, EGFR og KRAS, var ikke signifikant forskjellig mellom BC og kontroll vev (p 0,01; t-test). De gjennomsnittlige mRNA expression verdier mellom BC og normalt vev for hvert gen, var som følger: P14
ARF, 0,0325 ± 0,0488 vs. 0,0100 ± 0,0118 (p = 0,1087); Akt1, 0,0321 ± 0,0230 vs. 0,0262 ± 0,0174 (p = 0,3632); HRAS, 0,0015 ± 0,0021 vs. 0,0015 ± 0,0021 (p = 0,9752); Araf, 0,9931 ± 0,0047 vs. 0,9942 ± 0,0040 (p = 0,5201); BRAF, 0,8933 ± 0,0657 vs. 0,9053 ± 0,0486 (p = 0,8999); RAF1, 0,9348 ± 0,0527 vs. 0,9419 ± 0,0293 (p = 0,6681); MMP9, 0,0014 ± 0,0015 vs. 0,0023 ± 0,0054 (p = 0,1265); EGFR, 0,0078 ± 0,0073 vs. 0,0049 ± 0,0048 (p = 0,0948); . KRAS, 0,0876 ± 0,0997 vs. 0,0773 ± 0,0900 (p = 0,4035, Mann-Whitney U-test) (figur S3b)
EGF, FGF2 og MMP2 utstilt betydelig under uttrykk i BC vs. normalt vev: EGF , 0,00004 ± 0,000047 vs. 0,000151 ± 0,000235 (p = 0,0017); FGF2, 0,0003 ± 0,0004 vs. 0,0023 ± 0,0019 (p 0,0001); MMP2, 0,0752 ± 0,0858 vs. 0,1341 ± 0,0834 (p = 0,0007, Mann-Whitney U-test) (figur S3C)
mRNA uttrykk av genene som viste over, lik eller under-uttrykk i henhold til. vår qPCR analyse ble også undersøkt i forhold til scenen /grad av svulstene. Alle statistisk signifikante forskjeller i uttrykket av hvert gen blant kreft gruppene T2 /T3-grad 3, T1-grad 3 og T1-klasse 2, er avbildet i figur 4.
Grupper parene ble statistisk sammenlignet med Mann -Whitney U test. Barer skildrer medianverdier (A). Scatterplot som viser mRNA nivåer av gener som var like uttrykte blant urinblæren kreft i ulike stadium /klasse, og normalt vev. Grupper parene ble statistisk sammenlignet med Mann-Whitney U test. Barer skildrer medianverdier (B). Scatterplot som viser mRNA nivåer av gener som var under-uttrykk i ulike urinblæren kreft i annet stadium /klasse, versus normalt vev. Gruppe parene ble statistisk sammenlignet med Mann-Whitney U test. Barer skildrer medianverdier (C).
uttrykk for OPN (SPP1), TGFβ1, VEGFA, CDKN2A (P14
ARF /p16
INK4A), HRAS og TP53, var også bekreftet på proteinnivået, ved densitometrisk analyse av Western-blots (figur 5). De normaliserte proteinnivåer i BC lignet med normalt vev var som følger: OPN, 0,645 ± 0,287 vs. 0,261 ± 0,020 (p = 0,0286); TGFβ1, 0,837 ± 0,114 g 0,300 ± 0,195 (p = 0,0286); VEGFA, 0,678 ± 0,183 g 0,295 ± 0,133 (p = 0,05); CDKN2A, 0,687 ± 0,157 g 0,429 ± 0,088 (p = 0,0286); HRAS, 0,663 ± 0,258 g 0,420 ± 0,121 (p = 0,1143); p53, 0,760 ± 0,167 g 0,448 ± 0,295 (p = 0,2000, Mann-Whitney U-test)..
β-aktin (43 kDa) ble brukt som lasting kontroll
Sammenheng mellom mRNA /protein uttrykk for Gois og overlevelse av blærekreftpasienter
i alt 30 urinblæren krefttilfeller ble undersøkt for generelle overlevelse. Pasienter med svulster i stadium 1 presenteres bedre total overlevelse sammenlignet med de av trinn 2 eller 3 [p = 0,0008, χ
2 = 14,32, Log-rank (Mantel Cox) test; p = 0,0041, χ
2 = 8,260, Gehan-Breslow-Wilcoxon test]. Videre pasienter med karakteren 2 svulster viste en bedre total overlevelse sammenlignet med de av klasse 3 svulster [p = 0,0475, χ
2 = 6,094, Log-rank (Mantel Cox) test].
median verdi for MMP2 mRNA uttrykk i blærekreft prøvene var 0,038. Disse ble delt inn i to grupper med uttrykket ovenfor og nedenfor dette medianverdien. Tilsvarende har vi delt sakene inn i grupper basert på medianverdier for MMP9 (0,0007), OPN (0.031), VEGFA (0.141), TGFβ1 (0,0001), FGF2 (0,0002), P14
ARF (0,011), p16
INK4A (0,013), p53 (0,013), akt1 (0,025), EGFR (0.005), EGF (0,00002), HRAS (0,0011), KRAS (0,051), NRAS (0,024), Araf (0,994), BRAF (0,916 ), RAF1 (0,956), RKIP (0,764) mRNA uttrykk (tabell 2)
sakene med tumorer viste lave nivåer av VEGFA (. median verdi, 0,141) og EGFR ( medianverdien, 0,0051 ) mRNA uttrykk utstilt verre generelle overlevelse enn de sakene som uttrykker økt VEGFA ( medianverdien, 0,141) og EGFR ( medianverdien, 0,0051) mRNA nivåer, henholdsvis [for VEGFA, p = 0,04; for EGFR, p = 0,02; Log-rank (Mantel Cox) test]. Pasienter med høy TGFβ1, FGF2, P14
ARF, akt1, RKIP, KRAS og p53 mRNA nivåer viste også en bedre total overlevelse mønster, men sammenhengen var ikke statistisk signifikant. Kaplan-Meier-kurver for alle Gois er avbildet i Figur 6.
Sakene med tumorer viste lave nivåer av VEGFA ( median verdi, 0,141) og EGFR ( medianverdien, 0,0051) mRNA uttrykk, utstilt verre generelle overlevelse, enn de sakene som uttrykker økt VEGFA ( medianverdien, 0,141) og EGFR ( medianverdien, 0,0051) mRNA nivåer [for VEGFA, p = 0,04; for EGFR, p = 0,02; Log-rank (Mantel Cox) test]. Forskjeller i overlevelse ble vurdert ved hjelp av Log-rank (Mantel Cox) test. Statistisk signifikans ble satt til 95% nivå (p 0,05)
Sammenligning av GEO datasett
Vi ytterligere sammenlignet våre qPCR resultatene til 4 offentlig tilgjengelige BC microarray GEO datasett. GSE89 av Dyrskjot et al. (2003) [19]; GSE7476 av Mengual et al. (2009) [21]; GSE3167 av Dyrskjot et al. (2004) [20] og GSE12630 av Monzon et al. (2009) [22]. All logaritmisk
2 forvandlet prosenter av BC prøver vs kontroller er avbildet i tabell S2.
Datasett GSE12630 inneholdt data bare fra overgangsordning celle carcinoma av urinblæren og metastatisk urothelial karsinom. Siden ingen data fra normalt vev var tilgjengelige for dette datasettet, hentet vi normalt vev data fra datasettet GSE89 og beregnet en gjennomsnittlig log
2 forvandlet prosenter av BC kontra disse hentet data, som vi brukte som kontroller (tabell S2) .
korrelasjonsanalyse
Vi har undersøkt korrelasjonen av mRNA-nivåer i Goiss i BC, så vel som i normalt vev, utføring av Spearman rank test (tabell S4). I BC, ble MMP2 signifikant korrelert med BRAF (p = 0,032), RAF1 (p = 0,039) og RKIP (p = 0,014).
