Abstract
Wnt /β-catenin signalveien spiller viktige roller i utviklingen av kreft i tykktarmen.
DACT1
har blitt identifisert som en modulator av Wnt signalering gjennom sin interaksjon med Dishevelled (Dvl), en sentral formidler av både de kanoniske og noncanonical Wnt veier. Men funksjonene til
DACT1
i Wnt /β-catenin signalveien fortsatt uklare. Her presenterer vi bevis for at
DACT1
er en viktig positiv regulator i tykktarm kreft gjennom å regulere stabilitet og sublocation av β-catenin. Vi har vist at
DACT1
fremmer kreftcelle spredning
in vitro Hotell og tumorvekst
in vivo Hotell og forbedrer trekkfugl og invasiv potensial for tykktarmskreftceller. Videre, jo høyere ekspresjon av
DACT1 øker
ikke bare de nukleære og cytoplasmiske fraksjoner av β-catenin, men øker også dens membran-assosiert fraksjon. Overekspresjon av
DACT1
fører til økt akkumulering av nonphosphorylated β-catenin i cytoplasmaet, og spesielt i kjernene. Vi har vist at
DACT1
samhandler med GSK-3β og β-catenin.
DACT1
stabiliserer p-catenin via
DACT1
indusert effekter på GSK-3β og direkte samhandler med β-catenin proteiner. Nivået av fosforylert GSK-3β på Ser9 er betydelig økt etter økt uttrykk for
DACT1
.
DACT1
medierer den subcellulære lokalisering av β-catenin via øke nivået av fosforylert GSK-3β ved Ser9 å inhibere aktiviteten av GSK-3β. Til sammen våre studie identifiserer
DACT1
som en viktig positiv regulator i tykktarmskreft og antyder en mulig strategi for terapeutisk kontroll av β-catenin-avhengige veien
Citation. Yuan G, Wang C, Ma C, Chen N, Tian Q, Zhang T, et al. (2012) onkogen Funksjon av
DACT1
i Colon Cancer gjennom forskrift av β-catenin. PLoS ONE 7 (3): e34004. doi: 10,1371 /journal.pone.0034004
Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA
mottatt: 18 juli 2011; Godkjent: 21 februar 2012; Publisert: 21 mars 2012
Copyright: © 2012 Yuan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Science Foundation of China National, nr 30770440. de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklærte at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Mutasjoner og feilregulert uttrykk for komponenter av den gamle Wnt signalveien er knyttet til onkogenese i flere systemer, og har vært spesielt involvert i initiering av tykktarmskreft [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Over 90% av kolorektal kreft kommer fra aktive mutasjoner i Wnt veien [1]. Mutasjoner er blitt beskrevet i den adenomatøs polypose coli (
APC
) -genet i tilfeller av familiær adenomatøs polypose (FAP), og denne mutasjon forekommer også i en høy andel av sporadiske kolorektal kreft [9], [10].
APC
mutasjoner representerer en tidlig hendelse i kolorektal tumorigenesis [11].
β-catenin (offisielle symbol CTNB1) regnes for å være en sentral aktør i Wnt signalveien. Selv Wnt aktivering kan skje gjennom mutasjoner som påvirker fosforyleringsseter innenfor ekson 3 av β-catenin i et mindretall av kolorektal tumorer [12], [13], mange andre komponenter av Wnt signalveien bidra til tykktarmskreft via dysregulating aktiviteten eller lokalisering av β-catenin [14], [15].
DACT1 plakater (Dapper1 /Dpr1) genet, som ligger på kromosom 14q22.3, koder for et 836 aminosyre protein med en antatt leucin glidelås (LZ) domene i den amino-terminale ende og en konsensus PDZ binding (PDZ-B) motiv i den karboksy-terminale ende som gjør det mulig for
DACT1
protein til å interagere med Dishevelled (Dvl) PDZ domene [ ,,,0],16]. Bioinformatiske analyser har avdekket at
DACT1
mRNA uttrykkes i amnion, fosterets hjerne, øye, hjerte, voksen hjerne marg, magekreft (signetring cellefunksjoner), RER + kolon tumor, akutt lymfatisk leukemi, bakterie celle tumor , chondrosarcoma, og parathyroid svulster [17]. Videre, basert på den evolusjonære og funksjonell bevaring av Wnt signalmolekyler, så vel som det humane kromosomale lokalisering av DACT1,
DACT1
genet blir også anslått til å være en potent kreft-assosiert-genet [17].
DACT1
har blitt rapportert å være nedregulert i leverkreft [18]. En fersk rapport identifisert en sammenheng mellom
DACT1
uttrykk i lungekreft og dårlig histologisk grad, stor svulst størrelse, omfang av tumorinvasjon, og lymfeknutemetastase [19].
Selv om noen studier har vist assosiasjoner mellom
DACT1
uttrykk og kreft, funksjonen til
DACT1
i Wnt /β-catenin signalveien er fortsatt uklart. En mulig mekanisme er at DPR stabiliserer GSK-3β og Axin i APC-kompleks, slik som vist ved ko-immunoutfellingsstudier [16]. En annen mulighet er at DPR konkurrerer med Fz for binding til PDZ domenet av Dvl, og blokkerer dermed signaltransduksjon via Dvl, og følgelig hemmer Dvl-formidlet stabilisering av β-catenin [20]. Yau et al. rapportert at human Dpr1 ble nedregulert i leverkreft, og denne nedregulering var korrelert med det cytoplasmatiske akkumuleringen av β-catenin [18]. Men i denne rapporten, har vi funnet at
DACT1
er overuttrykt i tykktarmskreft, og det fungerer for å forbedre cellulær proliferasjon, migrasjon og invasjon i tykktarm kreft cellelinjer. Vi har vist at
DACT1
samhandler med GSK-3β og β-catenin. Vi har videre vist at
DACT1
stabiliserer p-catenin via
DACT1
indusert effekter på GSK-3β og direkte samhandler med β-catenin. Vi har også demonstrert
DACT1
inhiberer aktiviteten av GSK-3β via øke nivået av fosforylert GSK-3β ved Ser9, som endrer den subcellulære beliggenheten av β-catenin. Det fremmer spesielt β-catenin nivåer på plasmamembranen og i kjernen.
Resultater
DACT1
er overuttrykt i menneskets tykktarm kreft
For å identifisere de potensielle roller
DACT1
i utvikling og progresjon av colonic karsinom, vi brukte kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) for å vurdere nivået av genuttrykk. Vi sammenlignet uttrykket i seks kreft vev til de i seks sammenkoblede prøver av normal kontroll colonic slimhinnene. Resultatene viste at nivået av
DACT1
mRNA var signifikant forhøyet i alle seks prøver av tykktarmskreft (figur 1A). De genuttrykk Dataene ble ytterligere bekreftet ved Western-blotting, som ble utført ved bruk av oppløselige cellelysatene fremstilt fra kirurgiske prøver kolektomi. Resultatene bekreftet at høye nivåer av
DACT1
protein som er tilstede i tykktarmskreft (figur 1B).
(A)
DACT1
mRNA-nivåer ble bestemt ved hjelp av kvantitativ sanntid RT-PCR-analyse. Prøver av colon adenokarsinom (T, hvite søyler) og normal-vises kontroll slimhinnen (N, svarte striper) ble analysert i seks tilfeller av tykktarmskreft. (B) Uttrykk for
DACT1
protein i menneskelig kolon adenokarsinom (T) og normal-vises kontroll slimhinnen (N) i seks tilfeller, som bestemmes av Western immunblotanalyse. Uttrykket av GAPDH ble brukt som lasting kontroll.
DACT1
forbedrer celleformering
in vitro Hotell og tykktarm tumorigenesis
in vivo
for å forstå funksjonen til
DACT1
i tykktarmskreft, vi utforsket effekten av ektopisk
DACT1
uttrykk på cellevekst in vitro i cellelinjer med ulike nivåer av endogen
DACT1
uttrykk. Etter transfeksjon med en
DACT1
cDNA-ekspresjonskonstruksjonen, SW480 kolon kreftceller som uttrykker svært lave endogene nivåer av
DACT1
, viser en signifikant økning i cellulær proliferasjon (figur 2A). Omvendt, redusert celleproliferasjon når endogene
DACT1
uttrykk ble brakt til taushet av stabil transfeksjon med siRNA vektorer som målrettede
DACT1
i HCT116, LoVo og HT29 tykktarmskreft cellelinjer, som har mye høyere endogene nivåer av
DACT1 plakater (figur 2B-D). For å bekrefte disse resultatene, endogen
DACT1
uttrykk ble brakt til taushet av stabil transfeksjon med en annen siRNA vektorer (
DACT1
siRNA1) som målrettet forskjellige regioner av
DACT1
i HCT116 cellene og de samme resultatene ble observert (Figur S1 A-B)
(A) Venstre. overekspresjon av
DACT1
i stabilt transfekterte SW480 celler. Høyre: Vekstkurven proliferasjonsanalyse i
DACT1
-transfected SW480-celler (gjennomsnitt ± SEM; n = 3, * p 0,05 versus tom vektor-transfiserte celler). (B, C, D) Venstre:
DACT1
uttrykk i villtype, kontroll siRNA-transfektert, og
DACT1
siRNA-transfektert HCT116, LoVo og HT29 celler. Høyre: Vekstkurven forsøk i
DACT1
siRNA-transfektert HCT116, LoVo og HT29-celler (gjennomsnitt ± SEM; n = 3, * p 0,05 versus villtype-celler). (E) Gjennomsnittlig tumorvolum målt ukentlig etter injisering av dyr med kontroll siRNA-or
DACT1
siRNA-transfekterte HCT116-celler (gjennomsnitt ± SEM; n = 3, * p 0,05). (F) Representative bilder åtte uker etter injeksjon av mus tykktarm kreft celler med kontroll siRNA eller
DACT1
siRNA-transfektert HCT116-celler.
For å undersøke effekten av taushet av
DACT1
på kolon tumorvekst in vivo, HCT116-celler som stabilt uttrykte en kontroll siRNA eller
DACT1
siRNA ble brukt. Celler (5 x 10
6) ble injisert inn i det subkutane vev i nakne mus (n = 8 dyr per gruppe). Tumorene ble målt hver uke med en verniercaliper, og deres volumer ble beregnet i henhold til følgende formel: π /6 x lengde x bredde
2 [21]. Alle dyrene injisert med HCT116-celler som uttrykte kontroll siRNA utviklet svulster ved 14 dager etter injeksjon, mens bare 75% (6/8) av
DACT1
siRNA dyr utviklet svulster. Femti-seks dager etter injeksjon, svulster av kontroll siRNA dyrene var betydelig større (figur 2F). Det gjennomsnittlige tumorvolum var 2,068.78 ± 561,57 mm
3 i mus injisert med HCT116-celler som uttrykte kontroll siRNA, i forhold til det midlere tumorvolum hos mus injisert med HCT116-celler som uttrykte
DACT1
siRNA (503,46 ± 178,90 mm
3) (figur 2E). Disse dataene viser den viktige rollen
DACT1
fremme veksten av tykktarmskreftceller.
DACT1
forbedrer migrasjon og mangel på forankring av tykktarmskreftceller
Anchorage uavhengig spredning er et kjennetegn på onkogen transformasjon og regnes for å være bidrar til spredning av kreftceller bort fra sitt opprinnelige sted. Med denne kunnskapen, undersøkte vi kapasiteten på
DACT1
å drive forankringsuavhengig vekst av tykktarmskreftceller ved myke agar kolonidannelse analyser. Overekspresjon av
DACT1
forbedret forankringsuavhengig spredning av SW480 celler (figur 3A). Nedregulering av
DACT1
redusert forankringsuavhengig potensialet i HCT116, LoVo og HT29 celler (Figur 3B-D og S1C). Videre observerte vi at
DACT1
overekspresjon forbedret den vandrende potensialet i SW480 celler ved Transwell-analyser (figur 3E og jeg). Motsatt ble den vandrende potensialet i cellene reduseres når endogent
DACT1
uttrykk ble brakt til taushet av stabil transfeksjon med siRNA vektorer som målrettede
DACT1
i HCT116, LoVo og HT29 celler (figur 3F-I). Etter disse resultatene, konkluderer vi med at
DACT1
forbedrer forankring uavhengighet i tykktarm kreft celler og deres vandrende potensial.
(A) Soft agar-analysen i
DACT1
-transfected SW480 celler etter 14 dagers inkubering. (B, C, D) mykagar assay i siRNA-transfektert HCT116, LoVo og HT29-celler etter 14 dagers inkubering. (E) Representative bilder vises for overekspresjon av
DACT1
i stabilt transfekterte SW480 celler. Celler ble sådd ut i en transwell kammeret og tillatt å migrere over kammeret mot celle-spesifikk kondisjonert medium i 24 timer. Photomicrographs av farget trekkende celler ble tatt under lysfelt belysning (20 ×). (F, G, H) Representative bilder vises for
DACT1
siRNA-transfektert HCT116, LoVo og HT29 celler. Celler ble sådd ut i en transwell kammeret og tillatt å migrere over kammeret mot celle-spesifikk kondisjonert medium i 24 timer. Photomicrographs av farget trekkende celler ble tatt under lysfelt belysning (20 ×). (I) Kvantifisering av migrasjonsanalyse. Resultater ble oppnådd fra tre separate forsøk hver utført i tre eksemplarer. Migrasjon ble bestemt ved å telle celler i seks tilfeldige mikroskopiske felt per brønn (gjennomsnitt ± SEM; * p 0,05 versus kontrollgruppen celler).
DACT1
forbedrer invasjon av tykktarmskreftceller
in vitro
eller
in vivo
den farligste trekk ved malignitet er invasiv og metastatisk potensial av tumorceller. For å teste om celle invasjon var påvirket av
DACT1
, ble effekten av
DACT1
på celle invasjon gjennom Matrigel undersøkt. Overekspresjon av
DACT1
forbedret invasjonen av SW480 celler (figur 4A og E). Nedregulering av
DACT1
redusert invasiv potensialet i HCT116, LoVo og HT29 celler gjennom Matrigel (figur 4B-E). For å undersøke effekten av
DACT1
stanse på invasjonen av tykktarmskreftceller in vivo, infisert vi HCT116-celler som uttrykte en kontroll siRNA eller
DACT1
siRNA. Deretter ble 5 x 10
6-celler injisert inn i det subkutane vev i hver naken mus (n = 8 dyr per gruppe). Femti-seks dager senere, svulster i seks av åtte kontroll siRNA-transfektert hårløse mus hadde invadert inn i muskulaturen, mens bare to av svulstene i
DACT1
siRNA-transfektert dyrene hadde invadert inn i muskulaturen. Disse dataene ytterligere viser at
DACT1
gjorde påvirke invasiv potensial for tykktarmskreftceller in vitro og in vivo.
(A) Representative bilder vises for overekspresjon av
DACT1
-transfected SW480 celler. Celler ble sådd ut i en invasiv kammeret og tillatt å invadere kammeret mot celle-spesifikk kondisjonert medium i 24 timer. Photomicrographs av farget invaderende cellene ble tatt under lysfelt belysning (20 ×). (B, C, D) Representative bilder vises for
DACT1
siRNA-transfektert HCT116, LoVo og HT29 celler. Celler ble sådd ut i en invasjon kammeret og tillatt å invadere kammeret mot celle-spesifikk kondisjonert medium i 24 timer. Mikrofotografier av fargede invaderende cellene ble tatt under lysfelt belysning (20 ×). (E) Kvantifisering av migrasjon analysen. Resultater ble oppnådd fra tre separate forsøk hver utført i tre eksemplarer. Invasion ble bestemt ved å telle celler i seks tilfeldige mikroskopiske felt per brønn (gjennomsnitt ± SEM; * p 0,05 versus kontrollgruppen celler)
DACT1
regulerer cellesyklus om økende. β-catenin nivåer
til belysning av mekanismen som forårsaket de ovenfor angitte resultater ytterligere, testet vi protein nivåene av β-catenin og Wnt /β-catenin målgener, cyklin D1 [8] og c-myc [22]. Våre forsøk har vist at overekspresjon av
DACT1
resulterte i en betydelig økning i den totale nivåer av β-catenin, cyclin D1 og c-Myc i SW480-celler (figur 5A). Omvendt,
DACT1
siRNA, som mediert stanse av endogen
DACT1
uttrykk, redusert den totale nivåer av β-catenin, cyclin D1 og c-myc nivåer i HCT116, LoVo og HT29 celler ( Figur 5B).
(A) Representative vestlige blotter av tomme vektor-transfektert og
DACT1
-transfected SW480 celler. Overekspresjon av
DACT1
resulterer i oppregulering av β-catenin og T-celle faktor (TCF) målgener, cyclin D1 og c-Myc. GAPDH ble brukt som kontroll lasting. (B) Representative vestlige blotter av HCT116 og LoVo og HT29 celler som uttrykker kontroll siRNA eller
DACT1
siRNA. Stanse av
DACT1
uttrykk i HCT116 og LoVo og HT29 celler reduserte nivåer av total β-catenin, cyclin D1 og c-Myc. GAPDH ble brukt som kontroll lasting. (C) Effekten av
DACT1
overekspresjon på cellesyklusprofil SW480 celler. Tre dager etter serum sult, ble cellene analysert for deres cellesyklus-profil ved hjelp av FACS. Prosentandelen av celler i G1, G2 og S-faser er vist. (D, E, F) Effekten av
DACT1
siRNA transfeksjon av cellesyklusen profilen til HCT116, LoVo og HT29-celler. Tre dager etter serum sult, ble cellene analysert for deres cellesyklus-profil ved hjelp av FACS. Prosentandelen av celler i G1, er G2 og S faser vist.
Med tanke på at cyclin D1 og c-Myc er knyttet til cellesyklusregulering, undersøkte vi effekten av
DACT1
overekspresjon og lyddemping på cellesyklusregulering i tykktarm kreft celler. I disse forsøkene ble alle cellene synkronisert ved G0 /G1 faser av serum sult. Cellesyklus profilering ved FACS indikerte at overekspresjon av
DACT1
i SW480-celler var assosiert med en økning i andelen av celler i G0 /G1 faser (figur 5C). Konsekvent, stanse av
DACT1
uttrykk med siRNA resulterte i et økt antall celler i S + G2 /M faser i HCT116, LoVo og HT29 cellelinjer (figur 5D-F). Disse resultatene tyder på at S + G2 /M akkumulering av celler etter
DACT1
lyddemping er spesifikt knyttet til tap av
DACT1
protein. Samlet indikerer disse resultater at
DACT1
fremmer spredning av tykktarmskreftceller ved å lette overgangen fra G1 til S-fasen av cellesyklusen.
Dess cyklin D1, er CDK4 en annen nøkkel faktor som muliggjør G1 /S overgang. Vi merket oss at overekspresjon av
DACT1
i SW480 celler økte uttrykk for CDK4, mens CDK4 nivåene ble betydelig redusert i HCT116, LoVo og HT29 celler som uttrykte
DACT1
siRNA (figur S2). Sammen utgjør disse resultatene viser tydelig at
DACT1
stimulerer celleproliferasjon og tumorvekst ved å fremme oppføring av celler i cellesyklusen gjennom økende nivåer av β-catenin.
DACT en
forbedrer trekkfugl og invasiv potensial for tykktarmskreftceller gjennom å endre den subcellulære plasseringen av β-catenin
for å avsløre midler som
DACT1
øker β-catenin /TCF-regulert genekspresjon, den nøyaktige plasseringen av β-catenin ble observert under en laser scanning confocal mikroskop (LSCM) ved immunfluorescens. Resultatene viste at jo høyere ekspresjon av
DACT1
ikke bare øker de nukleære og cytoplasmiske fraksjoner av β-catenin, men også økt sin membran-assosiert fraksjon. Forandringen i nivået av det β-catenin membran-assosiert fraksjon var den mest signifikante funn (figur 6A-D og S1D)
(A) Mikrofotografier av tom vektor og
DACT1
. – overekspresjon SW480 celler immunofarget med et anti-β-catenin antistoff (rød). (B, C, D) Mikrofotografier av kontroll siRNA og
DACT1
siRNA i HCT116, LoVo og HT29-celler immunofarget med et anti-β-catenin antistoff (rød). (E) Representative blot av β-catenin nivåer i membranen (Mem), kjernekraft (Nuc), og cytoplasma (Cyto) fraksjoner og totale lysatene (Lys) i SW480 celler. Laminin B (atom uttrykk) og GAPDH (cytoplasmisk uttrykk) ble brukt som laste kontroller. «+» Representerer overekspresjon
DACT1
. «-» Er tom vektor. (F) Representative blot av β-catenin nivåer i membranen (Mem), kjernekraft (Nuc), og cytoplasma (Cyto) fraksjoner og totale lysatene (Lys) i HCT116 cellene. Laminin B (atom uttrykk) og GAPDH (cytoplasmisk uttrykk) ble brukt som laste kontroller. «+» Representerer kontroll siRNA. «-«. Er
DACT1
siRNA
For å bekrefte disse interessante resultater, utdrag fra kontroll /
DACT1
-overexpressing SW480 celler og kontroll /
DACT1
-silenced HCT116-celler ble separert i membranen, cytoplasma, og kjernefysiske fraksjoner. Deretter ble den relative overflod av β-catenin i disse fraksjonene analysert ved Western blotting (figur 6E og F). Tidligere rapporter har vist en viktig rolle for β-catenin i celleadhesjon som en del av et proteinkompleks som omfatter E-cadherin [23]. E-cadherin uttrykk mønster i tykktarm kreft celler var uendret av
DACT1
stanse eller overekspresjon (Figur S3). Disse dataene tyder på at økte nivåer av
DACT1
påvirke β-catenin nivåer og β-catenin /TCF-avhengig transkripsjon ved aktivering av Wnt signalveien. De foreslår også muligheten for at
DACT1
forbedrer trekkfugl og invasiv potensial for tykktarmskreftceller via β-catenin-mediert stabilisering av adherens krysset.
Sammenheng mellom
DACT1
og membran-assosiert β-catenin uttrykk
in vitro Hotell og
in vivo
fra resultatene av de ovennevnte forsøk, fant vi at
DACT1
var sterkt uttrykt i humane tykktarm kreft og at det fremmes cellevekst, migrasjon og invasjon potensial for tykktarmskreftceller gjennom dens virkning på β-catenin signalering. Basert på disse funnene, vi en hypotese om at
DACT1 Hotell og uttrykket nivåer av membran-assosiert β-catenin ville være positivt korrelert i tykktarm kreft cellelinjer og primære tykktarm kreft. Som vist i figur 7A og B, nivåene av
DACT1 Hotell og β-catenin i tykktarm kreft cellelinjer ble korrelert. De høyeste nivåene av β-catenin på cellemembranen ble observert i HCT116 cellene med høye nivåer av endogen
DACT1
. Mellomliggende nivåer av β-catenin på cellemembranen og
DACT1
proteiner ble funnet i HT29-celler. Både membran-assosiert β-catenin og
DACT1
ble minimalt uttrykt i SW480 celler.
(A) semikvantitativ RT-PCR analyse av
DACT1
uttrykk i HCT116, HT29 og SW480 celler. GAPDH ble anvendt som kontroll. (B) Immunofluorescensanalyse av
DACT1 Hotell og β-catenin uttrykk i HCT116, HT29 og SW480 celler. Original forstørrelse, 40 ×. (C, D) HE-farging av prøver av normal human colon slimhinne (N) og adenokarsinom (T) vev av et anti-β-catenin antistoff. Original forstørrelse, 40 ×. (E, F) immunfluorescens (IF) farging av prøver av normal human colon slimhinne (N) og adenokarsinom (T) vev av et anti-β-catenin antistoff. Original forstørrelse, 40 ×. (G, H) Immunohistokjemisk (IHC) farging av prøver av normal human colon slimhinne (N) og adenokarsinom (T) vev av et anti-β-catenin antistoff. Original forstørrelse, 40 ×.
For å studere sammenhengen mellom
DACT1 Hotell og membran-assosiert β-catenin uttrykk i tykktarm kreft ytterligere, ble immunhistokjemiske og immunfluorescens analyser utført av β-catenin i menneskets tykktarm normale og adenokarsinom vev (de seks ovennevnte tilfeller). Vi har observert fokal farging av membran-assosiert β-catenin i alle seks tumorer (100%; Figur 7C-H). Disse resultatene korrelerer godt med tidligere resultater med hensyn til p-catenin uttrykk i tykktarm kreft cellelinjer. Disse resultatene bekrefter at forhøyede nivåer av membran-assosiert β-catenin kan være avhengig av forhøyet uttrykk for
DACT1
.
DACT1
samhandler med β-catenin og komponentene av β-catenin ødeleggelse komplisert å stabilisere β-catenin
Vi var interessert i å klargjøre den mekanismen som forhøyede nivåer av
DACT1
resulterte i økt β-catenin uttrykk. I fravær av wnt ligander, er cytoplasmatiske nivåer av β-catenin regulert av ødeleggelse kompleks som inneholder Axin, APC, og glykogensyntasekinase-3β (GSK-3β), hvor β-catenin blir fosforylert av GSK-3β ved multippel serin og treonin rester i sin N endestasjonen. Fosforylert β-catenin blir deretter ubiquitinmolekyler, som fører til hurtig nedbrytning proteasomal [4], [24], [25], [26], [27], [28]. For å avgjøre om
DACT1
øker β-catenin nivåer ved å påvirke β-catenin stabilitet, HCT116-celler (med eller uten
DACT1
lyddemping) ble inkubert med 10 mikrogram /ml cycloheximide (CHX) for å forebygge nytt β-catenin syntese. Deretter ble β-catenin nivåer målt ved Western blotting for å reflektere graden av β-catenin proteinnedbrytingen. Stanse av
DACT1
uttrykk betydelig økt β-catenin nedbrytningshastigheten, noe som resulterer i en tydelig reduksjon i nivåene av gjenværende β-catenin (figur 8A). Denne effekten av
DACT1
på β-catenin stabilitet ble bekreftet av en immunfluorescens analysen. Vi fant ut at β-catenin ble degradert raskere i HCT116-celler som uttrykte
DACT1
siRNA enn i HCT116-celler som uttrykker kontroll
DACT1
siRNA (figur 8B).
(A ) Western blot-analyser i HCT116-celler ble utført for å bestemme β-catenin stabilitet. (B) immunfluorescens forsøk i HCT116-celler ble utført for å bestemme β-catenin stabilitet. (C) Cellelysater fra SW480 celler transfektert med GFP-
DACT1
ble underkastet immunoutfelling (IP) med anti-Axin, anti-GSK-3P, eller anti-β-catenin antistoffer. Immunokomplekser ble oppløst ved SDS-PAGE og utsatt for Western blot analyser med et anti-GFP-antistoff. Blotting med en anti-GAPDH antistoff viste lik belastning. (D) subcellulære samlokalisering av endogen
DACT1 Hotell og β-catenin,
DACT1 Hotell og GSK-3β i HT29 celler. (E) Cellelysater fra HT29-celler ble underkastet immunoutfelling (IP) med et anti-
DACT1
antistoff. Immunokomplekser ble oppløst ved SDS-PAGE og utsatt for Western blot analyser med anti-GSK-3β, eller anti-β-catenin antistoffer. Blotting med en anti-GAPDH antistoff viste lik belastning.
For å finne den mekanismen som
DACT1
påvirkninger β-catenin stabilitet, vi undersøkt hvorvidt
DACT1
reagerer med komponentene i multiprotein kompleks som regulerer β-catenin stabilitet. Vår co-immunpresipitasjonsanalyse avslørte colocalization av
DACT1 Hotell og GSK-3β,
DACT1 Hotell og Axin i SW480 celler stabilt transfektert med en GFP-merket
DACT1
konstruere (figur 8C ). Videre
DACT1
samhandler med β-catenin i SW480 celler som overexpressed
DACT1 plakater (figur 8C). Vi undersøkte colocalization av
DACT1
med GSK-3β, og
DACT1
med β-catenin i villtype HT29 celler (uten APC eller β-catenin mutasjoner) (figur 8D-E) . Disse konsistente resultater indikerte at
DACT1
forstyrrer GSK-3β-avhengig fosforylering av β-catenin av ødeleggelse komplekse, og
DACT1
påvirker β-catenin stabilitet ved å samhandle med β-catenin.
DACT1
påvirker subcellulære lokalisert β-catenin gjennom å hemme GSK-3β aktivitet
β-catenin er kjent for å samle seg i kjernen [29] og nivåene er spekulert å øke på membranen lamellipodia, adherens membran kryss og membran volanger [30], [31] som svar på Wnt signal eller narkotika-mediert hemming av GSK-3β aktivitet. Videre basert på våre funn, spekulerte vi at
DACT1
hemmer GSK-3β. Noen faktorer som hemmer GSK-3β via fosforylering av Ser9 er blitt rapportert [32], [33]. Vi observerte protein uttrykk nivåer av GSK-3β med fosforylert Ser9 i HCT116-celler (med eller uten
DACT1
lyddemping). Resultatene viste at nivåene av fosforylert GSK-3β på Ser9 ble signifikant økt i HCT116-celler som uttrykte kontroll siRNA (figur 9A og B). For å bekrefte at
DACT1
regulert lokalisering mønster av β-catenin gjennom å hemme GSK-3β, testet vi effekten av GSK-3β hemming på HCT116-celler som uttrykte enten kontroll siRNA eller
DACT1
siRNA. Vi observerte en klar og betydelig forbedring i celler som vises membran-assosiert β-catenin flekker etter at de ble behandlet med 40 mM LiC1 for 1 time (figur 9C og D). Vi testet ytterligere ekspresjon av aktivert β-catenin i SW480 celler. Resultatene viste at økt akkumulering av nonphosphorylated β-catenin i cytoplasma og særlig i kjernen av SW480 celler som overuttrykt
DACT1 plakater (figur 9E og F). Alle disse resultatene støtter konklusjonen om at
DACT1
påvirker subcellulære lokalisering av β-catenin gjennom hemming av GSK-3β aktivitet.
(A) Mikrofotografier av kontroll siRNA og
DACT1
siRNA som uttrykker HCT116-celler immunofarget med et anti-fosfo-GSK-3β (Ser9) antistoff (rød). Stanse av
DACT1
i HCT116 cellene reduserer nivåene av fosfor-GSK-3β (Ser9). (B) Representative vestlige blotter av HCT116-celler som uttrykker kontroll siRNA og
DACT1
siRNA. Stanse av
DACT1
i HCT116 cellene reduserer nivåene av fosfor-GSK-3β (Ser9). GAPDH ble brukt som kontroll lasting. (C) HCT116-celler som uttrykker kontroll siRNA og
DACT1
siRNA ble behandlet i 1 time med GSK-3P hemmende legemidler (40 mM LiCl). Celler ble farget og analysert ved hjelp av mikroskopi for å påvise ekspresjon av β-catenin. LiCl behandling av HCT116-celler øker nivået av β-catenin på plasmamembranen. (D) Representative vestlige blotter av LiCl-behandlede HCT116-celler som uttrykker enten kontroll siRNA eller
DACT1
siRNA. LiCl behandling av HCT116-celler øker nivået av β-catenin på plasmamembranen. KDEL ble anvendt som en kontroll lasting. 1: HCT116-celler som uttrykker kontroll siRNA som hadde blitt behandlet med 40 mM LiCl i 1 time. 2: HCT116-celler som uttrykker kontroll siRNA som ikke hadde blitt behandlet med LiCl. 3: HCT116-celler som uttrykker
DACT1
siRNA som ble behandlet med 40 mM LiCl i 1 time; 4: HCT116-celler som uttrykker
DACT1
siRNA som ikke hadde blitt behandlet med LiCl. (E) Mikrofotografier av kontroll siRNA og
DACT1
siRNA som uttrykker HCT116-celler immunofarget med et anti-fosfo-GSK-3β (Ser9) antistoff (rød). Stanse av
DACT1
i HCT116 cellene reduserer nivåene av fosfor-GSK-3β (Ser9). (F) Representative vestlige blotter av HCT116-celler som uttrykker kontroll siRNA og
DACT1
siRNA. Stanse av
DACT1
i HCT116 cellene reduserer nivåene av fosfor-GSK-3β (Ser9). GAPDH ble brukt som en lasting kontroll.
Diskusjoner
Økt uttrykk for
DACT1
har onkogene funksjoner i tykktarmskreft
Våre undersøkelser har vist at
DACT1
er overuttrykt i menneskelige colonic adenokarsinomer. Dette resultatet er i tråd med tidligere observasjon at
DACT1
ble oppregulert i invasive brystsvulster [34].
