Abstract
Bakgrunn
epigenetisk og genetisk forandring spiller en stor rolle til utvikling av hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC). Forbruk av tobakk (røyking /tygging) og human papilloma virus (HPV) er også forbundet med en økning i risikoen for HNSCC. Arrangøren hypermethylation av tumor undertrykkelse gener er i slekt med transcriptional inaktivering og tap av genuttrykk. Vi undersøkte epigenetisk endring (promoter metylering av tumorrelaterte gener /loci) i tumorvev i sammenheng med genetisk endring, virusinfeksjon, og tobakk eksponering og overlevelse status.
Metodikk
Undersøkelsen inkludert 116 vevsprøver (71 svulst og 45 normalt vev) fra Nordøst indiske befolkningen. Metylering spesifikk polymerase chain reaction (MSP) ble benyttet for å bestemme metylering status for 10 kreftrelaterte gener /loci (
p16
,
DAPK
,
RASSF1
,
BRAC1
,
GSTP1
,
ECAD
,
MLH1
,
MINT1
,
MINT2 Hotell og
MINT31
). Polymorfismer av
CYP1A1
,
GST product: (
M1
T1
),
XRCC1 Hotell og
XRCC2
gener ble undersøkt ved hjelp av polymerase chain reaction-rflp (PCR-RFLP) og multipleks-PCR hhv.
hovedfunnene
Unsupervised hierarkisk clustering analyse basert på metylering mønster hadde identifisert to tumor klynger, som i betydelig grad avviker fra CpG island methylator fenotype (CIMP), tobakk,
GSTM1
,
CYP1A1
, HPV og overlevelse status. Analysere metylering av gener /loci individuelt, har vi funnet betydelig høyere metylering av
DAPK
,
RASSF1
,
p16 Hotell og
MINT31
gener (
P =
0,031, 0,013, 0,031 og 0,015 henholdsvis) i HPV (+) tilfeller sammenlignet med HPV (-). Videre, en CIMP høy og Cluster-en karakteristisk var også assosiert med dårlig overlevelse.
Konklusjoner
Arrangøren metylering profiler som gjenspeiler en sammenheng med tobakk, HPV, overlevelse status og genetisk forandring og kan handle som en markør for å bestemme subtyper og pasient utfall i HNSCC
Citation. Choudhury JH, Ghosh SK (2015) Arrangøren Hypermethylation Profilering Identifiserer undergrupper av hode- og halskreft med tydelige Viral, miljø-, genetiske og Survival kjennetegn. PLoS ONE 10 (6): e0129808. doi: 10,1371 /journal.pone.0129808
Academic Redaktør: Dajun Deng, Peking University Cancer Hospital og Institute, KINA
mottatt: 20 mars 2015; Godkjent: 13 mai 2015; Publisert: 22 juni 2015
Copyright: © 2015 Choudhury, Ghosh. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
på verdensbasis er hode og nakke kreft den femte vanligste kreftformen og står for mer enn 550.000 nye tilfeller hvert år [1]. Forbruk av tobakk (røyking og tygging), alkohol og HPV-infeksjon er kjente risikofaktorer mot utvikling og progresjon av hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) [2, 3]. I India har HNSCC dyp røyking, betel pund og tobakk tygge profil og relativt dårlig overlevelse [4-6]. Men HPV positive (+) HNSCC hadde tydelig risikoprofil og assosiert med en bedre overlevelse sammenlignet med HPV negativ (-) HNSCC [7]. Genetisk endring som mutasjoner og genetisk polymorfisme er også spille en viktig mekanisme i HNSCC [8-11]. I tillegg kan epigenetisk modifikasjon (variant av genekspresjon uten å påvirke primærsekvensen til DNA) å endre ekspresjonen av nøkkeltumorrelaterte gener og således betraktes som en viktig spiller i utviklingen av en rekke krefttyper [12-14].
Hypermethylation av CpG øyer i promoter-regionen i genene (de som er involvert i cellesyklus regulering, apoptose, DNA-skade reparasjon og avgiftning sti) er assosiert med kreft progresjon og utvikling. Således avvikende metylering av CpG øyene er en av de epigenetiske modifikasjoner lovende enormt potensial molekyl biomarkør for prediksjon og deteksjon av en rekke kreftformer [15, 16]. CpG island methylator fenotype (CIMP) assosiert svulster er en distinkt gruppe definert av CpG-rik promoter hypermethylation i flere gener og har en tydelig epidemiologi og molekylære funksjoner [17-20]. Begrepet CIMP ble først foreslått i kolorektal kreft som en molekylær markør [21], senere ble det også undersøkt i andre krefttyper. Imidlertid er rollen til CIMP veien i tumorgenesis av HNSCC fortsatt ukjent. Den store konfrontere i å studere og utforske CIMP tilhørende svulster er å definere spesifikke metylert loci som skal brukes som CIMP panel. Avvikende metylering av de normalt unmethylated CpG øyer er forbundet med transcriptional inaktivering og dermed tap av genuttrykk. Nyere undersøkelser utført på ulike kreftrelaterte gener også vist differensial metylering mønster i HNSCC [22-26]. For å evaluere og skjermen CIMP status for kreft, Park etal [27] foreslått et panel av gener som består
av p16 /CDKN2A
,
MINT1
,
MINT2
,
MINT31 Hotell og
MLH1
(omtalt som klassisk CIMP panel) .De frekvenser av hypermethylation i et panel av seks gener (
ECAD
,
p16
,
DAPK
,
MGMT
,
RASSF1 Hotell og
TIMP3
) ble funnet svært høy i hode og nakke kreft [28]. I en annen studie, avvikende metylering av
MINT1 Hotell og
MINT31
ble funnet å være assosiert med dårlig prognose [29]. Tidligere studier har også rapportert at
p16 Hotell og
DAPK
avvik metylering var assosiert med dårlig prognose i muntlig kreft [30, 31]. Derfor foreslo vi en CIMP panel på sju gener, inkludert;
DAPK plakater (død-assosiert protein kinase),
RASSF1 plakater (Ras foreningen domenefamilie 1),
BRCA1 plakater (brystkreft 1),
MLH1
(mutL homologi 1),
p16 plakater (cyclin-avhengig kinase inhibitor 2A),
ECAD plakater (epitel cadherin),
GSTP1 plakater (glutation S-transferase pi-1 ), og tre metylert loci som
MINT1
,
MINT2 Hotell og
MINT31 plakater (metylert i tumor 1, 2 og 31 henholdsvis). Nyere epigenetiske studier på ulike kreftformer i hovedsak fokusert på multigen tilnærming, foreninger med HPV-infeksjon og clinicpathological data og med genetiske forandringer [32-34]. HPV oncoproteiner E6- og E7 er kjent for å være assosiert med genomisk ustabilitet ved inaktivering av p53 og Rb tumorsuppressorgener proteiner for cellesyklus pathway [35], bortsett fra dette, HPV modulerer også avvikende DNA-metylering av vertsgenomet [36] og føre til kreftfremkall prosesser. De siste årene har mange studier hadde gjennomført for å forklare sammenslutning av HNSCC med veksling av xenobiotiske og DNA-reparasjon pathway gener samt gen-gen og gen-miljø interaksjoner [37, 38]. Tahara et al. [39] viste genetiske faktorer, som er relatert til DNA-reparasjon eller xenobiotiske veier kan ha en rolle i CpG øy hypermethylation relaterte magekreftutvikling. Men det var ingen slike studier med fokus promoter metylering profil i HNSCC med en kombinasjon av genetiske risikofaktorer knyttet til xenobiotics og DNA-reparasjon sti. Dermed variasjon i promoter hypermethylation mønster av HNSCC basert på vaner, genetisk forandring og HPV-infeksjon er fortsatt uklart.
For å forstå de underliggende mekanismene for forskjeller i mønstre av tumor-spesifikke hypermethylation, har vi analysert avvik arrangøren metylering profil av HNSCC bruker syv viktige kreftrelaterte pathway gener, inkludert
DAPK
,
RASSF1 plakater (apoptose pathway),
BRCA1
,
MLH1 plakater (DNA-reparasjon pathway),
p16 plakater (celle-syklus sti),
ECAD plakater (celle-celle adhesjon),
GSTP1 plakater (xenobiotiske sti) og tre denaturert loci (
MINT1
,
MINT2 Hotell og
MINT31
) i den høye forekomsten av kreft sone i Nordøst-India. Så langt vi kjenner til, er vi de første til å utforske; korrelasjonen av CIMP egenskaper med genetiske (polymorfismer av
GSTM1
,
GSTT1
,
CYP1A1
,
XRCC1 Kjøpe og
XRCC2
gener ) og miljøfaktorer (røyking, betel pund og tobakk tygging) og også med HPV og overlevelse status for HNSCC pasienter. Videre utførte vi hierarkisk klyngeanalyse for å identifisere ulike undergrupper av HNSCC basert på arrangøren metylering profilen.
Materialer og metoder
Innsamling av HNSCC vev
I denne studien, vi undersøkte 116 vevsprøver, inkludert 71 tumorprøver av HNSCC og 45 tilstøtende normalt vev, samlet fra forskjellige sykehusene i Nordøst-India fra 2009-2013. Pasientene ga sin skriftlig informert samtykke før innsamling av prøvene. Grunnleggende demografiske data som alder, kjønn, tobakk (røyking /chewing) forbruk, matvaner etc. ble samlet ved hjelp av en standard spørreskjema.
Etikk erklæringen
Samling, samtykkeskjema og analyse av vevsprøver ble godkjent av Institutional etisk komité (IEC), Assam University, Silchar, Assam, India.
DNA-ekstraksjon
Genomisk DNA ble ekstrahert fra biopsiprøver, kirurgisk skåret kreft vev og tilstøtende normalt vev ved hjelp av standard fenol /kloroform ekstraksjon protokoll og også av Bioline Isolate Genomisk DNA MINIKIT (Bioline, UK) etter produsentens anvisninger. Det ekstraherte DNA ble deretter løst opp i TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) buffer og lagret ved -80 ° C for videre analyse [40].
HPV-påvisning
vevsprøvene ble screenet ved hjelp av sett av konsensus primere My9 /My11 for å forsterke HPV L1 genet fragmenter, som kan oppdage høyrisiko stammer av HPV [32]. Amplification ble utført på 20 ul reaksjonsblandinger som inneholder 2X Biomix (Bioline, UK), forover og bakover primere, 2 mL prøve og nuklease fritt vann. PCR-reaksjonsblandingen ble utsatt for innledende denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 35 sykluser ved 94 ° C i 45s, 47 ° C i 1 minutt og 72 ° C i 1 min. Den endelige forlengelse ble utført ved 72 ° C i 10 min. Alle mulige forholdsregler, inkludert negative kontroller ble tatt for å minimere smitteoverføring. PCR-produktene ble observert i 2% agarosegel med etidiumbromidfarging.
Genetiske polymorfismer av kreftfremkallende metabolizing (
GSTM1
,
GSTT1 Hotell og
CYP1A1
) og DNA-reparasjon (
XRCC1 Hotell og
XRCC2
) gener
polymorfismer av
CYP1A1 plakater (T3801C),
XRCC1
( Arg399Gln) og
XRCC2 plakater (Arg188His) gener ble analysert ved hjelp av polymerase-kjedereaksjon-rflp (PCR-RFLP) -metoden. Det polymorfe stedet for
CYP1A1
,
XRCC1 Hotell og
XRCC2
ble forsterket ved hjelp av publiserte forover og bakover primere [37, 41] i 20 mL PCR reaksjoner. Hver PCR-reaksjonsblandingen inneholder 10 til 100 ng genomisk DNA, 20 pmol av hver primer, 10x reaksjonsbuffer, dNTP miks,
Pfu
DNA-polymerase, MgCl
2 og nuklease fritt vann (NFW). PCR-reaksjonsblandingen ble satt med en innledende denaturering ved 94
° C i 5 minutter, etterfulgt av 35 sykluser av 94
° C for denaturering for 45s, 62
° C /58
° C /60
° C (for
CYP1A1
,
XRCC1 Hotell og
XRCC2
henholdsvis) for 45s for primersammensmeltning og utvidelse på 72
° C i 1 min. Den endelige forlengelse ble utført ved 72
° C i 10 minutter. PCR-produkter av
CYP1A1
,
XRCC1 Hotell og
XRCC2
ble kuttet separat med restriksjonsenzymet
Msp1
,
HpaII Hotell og
HphI
enzymer (New England Biolabs, USA) hhv. Den fordøyde produkter ble deretter løst på 3% agarosegel for å vurdere størrelsen av PCR-RFLP-produkter [37]. Genotyping av
GSTM1 Hotell og
GSTT1
ble gjort av multipleks PCR, ved hjelp av
CYP1A1
genet som en intern kontroll, i et totalt volum på 10 ul reaksjonsblanding av 2X Biomix (Bioline, UK) og 10 pmol av hver av den fremre (F) og omvendt (R) primere (S2 Table). PCR-produktene ble elektroforese i 1,5% agarosegel farget med etidiumbromid.
Arrangøren hypermethylation analyse og vurdering av CIMP-status
Arrangøren metylering status av tumorrelaterte gener (
RASSF1
,
DAPK
,
ECAD
,
BRCA1
,
MLH1
,
p16 Hotell og
GSTP1
) og tre denaturert loci (
MINT1
,
MINT2
, og
MINT31
) ble analysert ved hjelp av metylering Spesifikke PCR (MSP) primere (S2 Table). For MSP-analysen, ble DNA-prøver utsatt for modifisering hjelp Imprint1 DNA Modifikasjon kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), følge instruksjonene som beskrevet av produsenten [18]. I denne prosedyren blir DNA-denaturering og bisulfitt modifikasjon utføres samtidig. Bisulfitt reagerer med enkeltkjedet DNA for å deaminate den cytosin (C) og transformerer unmethylated cytosin (C) til uracil (U) og etterlater 5-metyl- cytosin uforandret og dermed skaper forskjellige sekvenser for metylert og unmethylated DNA. Da har vi benyttet to forskjellige sett av primere for hver enkelt gen, en bestemt sett av primere for metylert DNA og den andre for unmetyhlated DNA. Vi har også brukt DNA fra lymfocytter fra perifert blod av friske individer uten HPV-infeksjon, som negativ kontroll, og DNA fra lymfocytter fra perifert blod behandlet med SSSI methyltranferase ble anvendt som positiv kontroll (for denaturert DNA). Alle PCR-reaksjonen ble utført i gradienten termosykler (Applied Biosystems, Inc, CA, USA) og de amplifiserte produkter for metylert og unmethylated DNA ble kjørt ved siden av hverandre på agarosegel for sammenligning. I denne studien ble CIMP panel klassifisert i tre grupper: CIMP-høy (minst 5 gener /loci metylert av 10), CIMP-lav (mindre 5/10 gener /loci denaturert), og CIMP-negative (0/10 gener /loci denaturert). Denne klassifiseringen er gjort på grunnlag av kriteriene tidligere brukte for CIMP status i andre typer av tumor [19, 42]. Metylering indeks (MI) ble også beregnet i hvert enkelt tilfelle via dividere antall denaturert gener /loci med det totale antall av gen /loci som studeres.
overlevelsesanalyse
Overlevelse ble beregnet i måneder fra begynnelsen av behandlingen til måneden deathusing Kaplan-Meier overlevelseskurver i SPSS programvare, versjon 18 (Windows). Dødsfall som skyldes sykdommer /komplikasjoner annet enn kreft ble utvist fra studien. Sammenhengen mellom ulike egenskaper (HPV, CIMP og klase) og ved dødsfall ble analysert ved hjelp av log-rank (Mantel-Cox) tester.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS programvareversjon 18 og tosidig
P
-verdi 0,05 (tosidig) ble ansett som statistisk signifikant. Vi brukte Wilcoxon rank-sum test for å sammenligne arrangøren metylering nivåer av HNSCC tumorprøver og normale prøver, som tillater sammenligning av to grupper av uavhengige utvalg [43]. De betydelige verdier ble ytterligere justert for multippel testing av Bonferroni metoden (
P
-verdi multiplisert med antall sammenligninger). Også å styrke sammenhengen mellom ulike faktorer og CIMP i HNSCC risiko,
P
-verdier ble beregnet etter justering konfunderende faktorer som alder, kjønn, HPV, røyking, betel-pund og tobakk tygging status som passer. Test for lineær trend ble også gjennomført for flere ordens CIMP status. Unsupervised hierarkisk clustering ble gjort ved hjelp av JMP 12 programvarepakke fra SAS, som identifisere undergrupper blant HNSCC pasienter basert på arrangøren metylering frekvens.
Resultater
Kjennetegn på pasienter
clinicopathological data av 71 studerte HNSCC pasienter er oppsummert i tabell 1, som består 51 (71,8%) menn og 20 (28,2%) kvinner med en aldersspredningen av 23-86 år (77,5% tilhører den aldersgruppen 45-86). Av de 71 HNSCC pasienter; 38 (53,5%) oral cancer (inkludert kinn, undersiden av tungen, tunge, gingivam, og munnslimhinnen) 16 (22,6%) hadde strupekreft, 8 (11,2%) hadde svelget kreft og ni (12,7%) hadde annet kreft typer i hode og nakkeregionen. Ifølge TMN klassifisering, de fleste av pasientene hadde avansert stadium (III /IV) (67,3%) ved diagnose. Blant de HNSCC pasienter, røykere, betel quid chewers og tobakk chewers var henholdsvis 71,8%, 66,2% og 74,6%.
Frekvenser av arrangøren hypermethylation i tumorprøver av HNSCC pasienter og normalt vev
Arrangøren hypermethylation status for
p16
,
DAPK
,
GSTP1
,
RASSF1
,
BRCA1
,
ECAD
,
MLH1
,
MINT1
,
MINT2 Hotell og
MINT31
gener av 71 HNSCC og 45 normale vev prøvene ble vist i tabell 2 . tumorvev hadde mye høyere gener /loci hypermethylation frekvens i forhold til normale vevsprøver (32,4% vs. 13,3% for
p16
, 29,6% vs. 11,1% for
DAPK
, 18,3% vs . 8,9% for
BARC1
, 31% vs. 15,6% for
GSTP1
, 32,4% vs. 8,9% for
ECAD
, 50,7% vs. 22,2% for
RASSF1
, 5,6% vs. 2,2% for
MLH1
, 43,7% vs. 13,3% for
MINT1
, 52,1% vs. 11,1% for
MINT2
og 46,5% vs. 17,8% for
MINT31
). Imidlertid ble det observert betydelig høy hypermethylation i
p16
,
DAPK
,
ECAD
,
RASSF1
,
MINT1
,
MINT2 Hotell og
MINT31 product: (
P
= 0,02, 0,02, 0,04, 0,02, 0,01, 0,01 og 0,01 henholdsvis) i HNSCC vev sammenlignet med normale vevsprøver . Metyleringen indeks (MI) (forholdet mellom antallet av metylerte promotorer og det totale antall av promotorer som studeres) varierte 0 til 0,9 av de 71 pasientene. Av de 71 pasientene HNSCC 14 (19,7%) hadde 0 (null) MI, 33 (46,5%) hadde MI på 0,1-0,5 og 24 (33,8%) pasienter som hadde MI på 0,6-0,9. HNSCC pasienter med ulike vaner og genetiske profiler ble funnet å vise differensial metylering indeks (MI). Mean MI av tobakk chewers /røykerne var høyere enn ikke tygger /røykere. Tilsvarende pasienter med
GSTM1
null,
CYP1A1
CC genotype og HPV (+) også vist høyere metylering indeks (fig 1).
Hver boks tomten representerer differensial metylering index (MI) blant røykere /tygger og ikke-røykere /chewers eller vill genotype kontra variant genotype eller HPV (+) vs. HPV (-). HNSCC pasienter
Arrangøren metylering status på HPV positive (+) og HPV negativ (-) HNSCC
i studien ble HPV påvist i 37 av 71 tilfeller (52,11%) ved bruk av konsensus primere. Korrelasjonen mellom metylering av kreftrelaterte gener og HPV ble oppsummert i Tabell 3. Resultater vist at arrangøren metylering av
DAPK
,
RASSF1
,
p16 Hotell og
MINT31
var signifikant høyere i HPV-positive (+) HNSCC pasienter sammenlignet med HPV negativ (-) pasienter (
P
= 0,031, 0,013, 0,031 og 0,015) (figur 2B). Et sterkt signifikant sammenheng ble funnet mellom HPV-positive (+) svulster og CIMP-høy gruppe (
P
= 0,028). Men det var ingen sammenheng mellom CIMP-lav og HPV (+) HNSCC (
P
= 0,477), sammenlignet med HPV (-). HNSCC svulster
(A) Kaplan-Meier overlevelse plott: (i) HPV (+) HNSCC tumorer som viser bedre overlevelse sammenlignet med HPV (-)-tumorer. (Ii) CIMP-høy gruppen av HNSCC tumorer som viser dårligere overlevelsen sammenlignet med andre. (Iii) To epigenetisk klynge viste også differensial overlevelse med cluster-en hadde en dårlig overlevelse. (B) Frekvens av arrangøren metylering av 10 kreftrelaterte gener /loci i HPV (+) og HPV (-) HNSCC [* P 0,05 (Mantel-Cox Log-rank)]. (C) Metylering indeks (MI) i tre CIMP-grupper av HNSCC svulster.
CIMP i HNSCC tumorvev
I denne studien CIMP status ble klassifisert som CIMP -Høy (fem eller flere denaturert gener), CIMP-lav (mindre enn fem denaturert gener) og CIMP-negativ (ingen denaturert gener). Av de 71 HNSCC prøvene, 39,4% (28/71) var CIMP høy, 42,3% (30/71) var CIMP-lav og 18,3% (13/71) var CIMP-negative.
Sammenheng mellom miljøfaktorer og CIMP
Når vi analyserte data om miljøfaktorer som røyking, betel pund tygging og med CIMP og fant røyking og tobakk tygde hadde sterk sammenheng med CIMP-høy (
P
= 0,008 og 0,034) sammenlignet med CIMP-negativ. Men betel pund tygge hadde ingen signifikant korrelasjon med CIMP-markører. Vi hadde heller ikke funnet noen signifikante forskjeller mellom CIMP-lav Vs CIMP-negative og CIMP-høy Vs CIMP lavt når det gjelder tobakksrøyking eller tygging (tabell 4).
Sammenheng mellom genetiske faktorer og CIMP
Vi har også korrelert de genetiske endring data av kreftfremkallende metabolizing (
GSTM1
,
GSTT1 Hotell og
CYP1A1
) og DNA-reparasjon (
XRCC1 Hotell og
XRCC2
) gener med CIMP paneldata. De CIMP høye svulster hadde signifikant høyere frekvens av
GSTM1
null, sammenlignet med CIMP lave og CIMP-negative tumorer (henholdsvis
P
= 0,004 og 0,023). Det var imidlertid ingen signifikant sammenheng mellom
GSTT1 plakater (null),
CYP1A1 plakater (T3801C),
XRCC1 plakater (Arg /Gin) og
XRCC2
(Arg /Hans) variant genotyper og forskjellige CIMP markører (tabell 4).
overlevelse korrelerer med CIMP og HPV
overlevelse ble undersøkt med hensyn til CIMP markører ved hjelp av Kaplan-Meier overlevelseskurver (fig 2A). Analyse viste at den totale midlere overlevelsestid av 47 pasienter med 71 var 15 måneder [95% CI = 10,97 til 19,03], og den midlere overlevelsestid i CIMP-høy, CIMP-lav og CIMP-negative var 11 måneder [95% CI = 7,71 til 14,28], 18 måneder [95% CI = 13.73 til 22.26] og 19 måneder [95% CI = 5,14 til 32,85] henholdsvis (
P
trend
= 0,011). Igjen median overlevelsestid for Cluster-en og Cluster-to karakteristiske var 13 og 18 måneder, henholdsvis (
P
= 0,026) (S1 tabell). Den CIMP-high og Cluster-en var signifikant assosiert med dårlig overlevelse hos pasienter med HNSCC. Mens overlevelse for HPV (+) HNSCC pasienter var bedre (17 måneder) enn HPV (-) HNSCC pasienter (13 måneder) (
P
= 0,041)
Identifiserte kreft klynger. og sammenheng med miljømessige, genetiske og epigenetiske egenskaper
i denne studien, utførte vi unsupervised hierarkisk clustering og identifisert to klasser eller undergrupper basert på promoter metylering data på tumorprøver (fig 3). Vi hadde konstruert hierarkiske klynger ved hjelp av sju gener /loci, som etter justering sju genet /loci av ti funnet å være signifikant hypermethylated. De to identifiserte klynger fått klare miljømessige, genetiske og epigenetiske funksjoner og er oppsummert i tabell 5. Hyppigheten av røyking (86,2%) og tobakk-tygging (89,7%),
GSTM1
null (82,8%) og
CYP1A1 plakater (31,05%),
XRCC1 plakater (27,6%) og
XRCC2 plakater (48,3%) variant genotyper var høyere i Cluster-en i forhold til Cluster-2. Men bare røyking, tobakk tygging og
GSTM1
null genotype hadde vist statistisk signifikant variasjon mellom klynger (
P
= 0,048, 0,034 og 0,002 henholdsvis). Også hyppigheten av HPV-positive (+) HNSCC svulster var signifikant høyere (
P
= 0,009) i Cluster-en sammenlignet med Cluster-2. CIMP-high-gruppen (93,1%) er betydelig høyere i fra Cluster-en (
P
0,001) sammenlignet med Cluster-2, mens Cluster-to preget av CIMP-lav (66,7%) og CIMP -negative grupper (30,9%)
De ulike faktorene i heatmap ble representert av fargevariasjon. tobakk forbrukere, HPV tilstedeværelse og
GSTM1
null,
GSTT1
null (mørk rød farge); tobakk ikke-forbrukere og HPV fravær
GSTM1
stede og
GSTT1
stede (lys gul farge). For
CYP1A1
,
XRCC1 Hotell og
XRCC2
status: villtype (mørk rød); heterozygot (oransje rød) og homozygot variant allel (lys oransje) og for CIMP status: CIMP-høy (mørk rød), CIMP-lav (oransje rød) og CIMP-negative (lys farge)
Diskusjoner
utvikling og progresjon av HNSCC er en flertrinnsprosess modulert av genetiske, epigenetiske og miljøfaktorer [2, 44, 45]. De viktigste miljøfaktorer som tobakksrøyk, og tygge samt HPV-infeksjon kan føre til et bredt spekter av genetiske og epigenetiske forhandlingene som fremmer genomisk ustabilitet og bifaller svulst utvikling [3, 5, 9]. Arrangøren hypermethylation profilen til kreftrelaterte gener ble antatt å være avgjørende og hyppig i ulike kreftformer. Mange epigenetiske hendelser i kreftfremkallende trasé har nylig blitt observert og avslørte fremgangsmåter for påvisning av CpG øy promoter metylering mønster for å stratifisere høyrisikogrupper blant forskjellige krefttyper [15, 17, 18, 34]. Dette hjelper i deteksjon av tidlig debut av kreft, og spår kliniske resultater. Derfor er det uunnværlig å studere metylering status for et panel av representative gener i HNSCC. Her, i denne studien, vi analyserte avvik arrangøren metylering profilen til HNSCC bruker syv viktige kreftrelaterte pathway gener (
p16
,
DAPK
,
GSTP1
,
ECAD
,
RASSF1
,
MLH1 Hotell og
BRCA1
) og tre denaturert loci (
MINT1
,
MINT2
og
MINT31
) i den høye forekomsten av kreft sone i Nordøst-India. I vår studie har vi også relatere avvik metylering status av pasienter med genetiske (polymorfismer av
GSTM1
,
GSTT1
,
CYP1A1
,
XRCC1 Hotell og
XRCC2
) og miljøfaktor (røyking, betel pund og tobakk tygging) samt med overlevelsesdata.
Vi fant en signifikant høyt nivå av
p16
,
DAPK
,
ECAD
,
RASSF1
,
MINT1
,
MINT2 Hotell og
MINT31
hypermethylation i HNSCC vev sammenlignet med normale vevsprøver, noe som reflekterer den mulige involvering av epigenetisk endring mot utvikling og progresjon av HNSCC. Vår nåværende etterforskningen hadde dekket en bred gruppe av kreftrelaterte pathway gener, inkludert
p16 plakater (cellesykluskontroll),
DAPK
,
RASSF1 plakater (apoptose),
BRCA1
,
MLH1 plakater (DNA reparasjon),
ECAD plakater (celle-celle adhesjon),
GSTP1 plakater (kreftfremkallende metabolisme),
MINT1
,
MINT2 Hotell og
MINT31 plakater (metylert loci i tumorer).
Mange tidligere epigenetiske studier belyst eksistensen av HPV mediert DNA-metylering i HNSCC [46, 47] . Fersk studie fra nordøst India ved hjelp av et panel av 10 gener, forklarte rolle HPV og tobakk i tilblivelsen av UADT kreft [32]. Men vi videre analysert hypermethylation av individuelle gener /loci separat i HPV (+) og HPV (-) tilfeller. Vi fant arrangøren metylering av
DAPK
,
p
16,
RASSF1 Hotell og
MINT31
var signifikant assosiert med HPV (+) svulster HNSCC. Derfor HPV syntes å være en utløsende agent for endringer av CpG island metylering av tumorundertrykkende gener i HNSCC. Generelt er HPV (+) HNSCC forbundet med et mer gunstig overlevelse [9], vårt studium også utforsket HPV (+) pasienter i HNSCC hadde bedre overlevelse sammenlignet med HPV (-). Pasienter som reflekterer en mulig rolle i prognose
i mange krefttyper, spesielt i tykktarmskreft, CpG Island Methylator Phenotype (CIMP) ble brukt til å identifisere klinisk og patologisk relevante undergrupper av svulster. Toyota et al. introduserte CpG island methylator fenotype (CIMP) for å klassifisere kreft basert på metylering status av et panel av gener [21]. I tykktarmskreft, CIMP svulster fått klare epidemiologiske egenskaper, mikro ustabilitet (MSI) profil BRAF mutasjoner og overlevelse, sammenlignet med ikke-CIMP svulster [48, 49]. CIMPs er rapportert for en rekke kreftformer, herunder øvre aerodigestive veier (UADT) [32], munnhulekreft [50], og spiserørs plateepitelkarsinom [51] og brystkreft [19]. Det er imidlertid bare én studie var der i HNSCC, noe som forklarer CIMP i den undergruppen av HPV (+) tumor av HNSCC [33]. Den hypermethylation profilen til genet arrangører er mangfoldig for hver type kreft og også påvisningsmetoden og flere gen utvalg for CIMP-panel varierer mellom studiene. Basert på hypermethylation mønster av 10 kreftrelaterte gener /loci, klassifisert vi HNSCC i tre grupper: CIMP høye, CIMP lave og CIMP-negative. Vi observerte distinkte kjennetegn svulst innenfor CIMP høye og CIMP-negative grupper. Frekvenser av røyking, tobakk tygging og
GSTM1
null genotyper av pasientene var signifikant høyere i CIMP-høye grupper i forhold til CIMP-negative. Genetiske og miljømessige egenskaper kan henvise til CIMP karakteristikker av HNSCC svulster. Vi observerte også en tilbøyelighet dårlig overlevelse i CIMP-høye svulster i forhold til CIMP-negative gruppe; indikerer CIMP-høy kan være en prediktor for en dårlig prognose av HNSCC i Nordøst indiske befolkningen. Det er kanskje ikke uventet at vi har funnet en sammenheng mellom de CIMP høy og pasient dårlig resultat, hvis vi sammenlignet våre data på CIMP og overlevelse i HNSCC med andre tidligere beskrevet kreft [52, 53]. En dyp forståelse av CIMP kan tillate utformingen av bedre behandlingsstrategier for HNSCC.
epigenetisk gruppering av HNSCC pasienter ble gjort på grunnlag av DNA-metylering profiler i tumor vevsprøver. Hierarkisk klyngeanalyse identifisert to forskjellige undergrupper, en undergruppe av HNSCC pasienter med høy frekvens av røyking, tobakk tygge vaner,
GSTM1
null og
CYP1A1 product: (CC) variant genotype. Klyngen-en også preget av HPV (+) tilfeller, og inneholdt CIMP-høy gruppe, noe som reflekterer en mulig sammenheng mellom DNA metylering og genetiske og miljømessige faktorer i HPV assosiert HNSCC. Således kan epigenetisk og sammen med genetisk endring med en kombinasjon av miljøfaktorer spiller også en rolle i en undergruppe av HNSCC. I vår forrige undersøkelse, fant vi sterke samspillet mellom kreftfremkallende metabolizing gener (
GSTM1 Hotell og
GSTT1
) og miljøfaktorer i HNSCC [2]. Samspillet av fase-I (
CYP1A1
) og fase-II (
GSTM1
GSTT1
) tobakk karsinogener metabolizing gener kan belyse opphopning av større mengder giftige stoffer i kroppen som kan spille stor rolle under utviklingen av HNSCC. Også en av våre andre studien utforsket samspillet mellom tobakk og DNA-reparasjon (
XRCC1 Hotell og
XRCC2
) genet polymorfismer og krysstale mellom disse to DNA-reparasjonsgener mot mottakelighet av HNSCC [37] . Fersk studie av Tahara et al. [39] fant sammenheng mellom
GSTM1
null genotype og økt mottakelighet for CpG hypermethylation, men de fant redusert følsomhet overfor CpG hypermethylation av
DAPK
gen med
XRCC1
kodon 399 Gin
