Abstract
Bakgrunn
Thyroid kreft er den vanligste endokrine relatert kreft med økende forekomst i løpet av de siste fem årene. Aktuelle behandlinger for skjoldbruskkjertelen, som for eksempel kirurgi eller radioaktivt jod terapi, krever ofte pasienter til å være på livslang skjoldbruskkjertelhormon og gitt betydelige tilbakefall av skjoldbruskkjertelkreft, er nye forebyggende modaliteter nødvendig. Denne studien undersøker tilhører et naturlig kosttilskudd stoff som finnes i cruciferous grønnsaker, 3,3′-diindolylmethane (DIM), for å målrette metastatisk fenotype av skjoldbruskkjertelen kreftceller gjennom en funksjonell østrogen reseptor.
Metodikk /Principal funn
Thyroid kreftcellelinjer ble behandlet med østrogen og /eller svak og utsatt for
in vitro
adhesjon, migrasjon og invasjon analyser for å undersøke de anti-metastatiske og anti-østrogen effekt av DIM. Vi har observert at DIM hemmer østrogen mediert økning i skjoldbruskcellemigrering, adhesjon og invasjon, som også er understøttet av ER-α nedregulering (siRNA) studier. Western blot og zymografi analyser gitt direkte bevis for dette DIM mediert hemming av E
2 forbedrede metastase forbundet hendelser i kraft av å målrette viktige proteolytiske enzymer, nemlig MMP-2 og MMP-9.
Konklusjon /Betydning
Våre datarapporter for første gang at DIM viser anti-østrogen lignende aktivitet ved å hemme estradiol forbedret skjoldbruskkjertelkreft celleproliferasjon og
in vitro
metastase forbundet hendelser, nemlig adhesjon, migrasjon og invasjon. Viktigst, MMP-2 og MMP-9, som er kjent for å fremme og styrke metastaser, var fast bestemt på å være mål for DIM. Denne anti-østrogen som tilhører DIM kan føre til utvikling av en ny forebyggende og /eller terapeutisk kosttilskudd for tyroideacancer ved å målrette progresjon av sykdommen
relasjon:. Rajoria S, Suriano R, George A , Shanmugam A, Schantz SP, Geliebter J et al. (2011) Østrogen Induced metastatisk Modulatorer MMP-2 og MMP-9 er mål for 3,3′-Diindolylmethane i skjoldbruskkjertelen. PLoS ONE 6 (1): e15879. doi: 10,1371 /journal.pone.0015879
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 6 oktober 2010; Godkjent: 25 november 2010; Publisert: 18 januar 2011
Copyright: © 2011 Rajoria et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Cancer Institute 1R01CA131946 og klinisk finansiering fra New York øye og øre Infirmary, New York, New York. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
insidensen av skjoldbrusk proliferative sykdommer (TPD) inkludert i skjoldbruskkjertelen og struma, er stadig økende med skjoldbrusk kreft er den vanligste blant endokrine kreftformer [1], [2]. Nyere statistikk viser 37.000 nye tilfeller ble diagnostisert i USA alene i 2009, og over hele verden nesten 27 millioner pasienter er berørt [2]. Den godt differensiert papillær og follikulær skjoldbrusk kreft varianter utgjør mer enn 90% av alle skjoldbrusk kreft og er invasiv metastatisk [3]. Nåværende behandlinger for TPD omfatter kirurgi som involverer fullstendig eller delvis fjerning av skjoldbruskkjertelen, radioaktivt jod (I
131) terapi, kjemoterapi eller kombinasjoner av alle [4]. Disse behandlingene ofte krever at pasienter til å ta erstatning thyroidhormoner gjennom hele livet [4], [5] med gjentagelseshyppigheten blir uakseptabelt høyt, og nådde nesten 20-30% [5], [6]. I de senere årene har tilbakefall og ikke-respons på konvensjonelle skjoldbrusk behandlinger økte dermed beret etterforskning av nye forebyggende og terapeutiske tiltak fortrinnsvis ved hjelp av naturlige forbindelser i kosten.
Kosthold har alltid vært av stor betydning i sin forening med kreftutvikling og forebygging [7] – [9]. Med hensyn til kreft forebygging, har flere studier funnet en invers sammenslutning av kreftrisiko med inntak av kosttilskudd produkter, som for eksempel tomater, soya og cruciferous grønnsaker [7] – [10]. Spesielt har cruciferous grønnsaker som brokkoli, grønnkål, blomkål og kål blitt akseptert av flere organisasjoner, inkludert National Cancer Institute og Federal Drug Administration, å ha en forebyggende effekt mot kreftutvikling, spesielt i østrogen responsive vev [7], [8 ]. Cruciferous grønnsaker inneholde flere fyto-kjemikalier, inkludert indol-3-carbinol (I3C), som er et effektivt oralt Kjemopreventivt middel mot bryst og prostata-kreft [11] – [13]. I3C spontant omdannes til sin dimere produkt, 3,3′-diindolylmethane (DIM) ved en lav pH-verdi [11] – [14]. DIM er en stabil forbindelse og en sikkerhetsvurdering viser at langvarig bruk av DIM (opptil 12 måneder) hos mus ikke førte til noen åpenbar renal, cardio eller mage-tarm toksisitet [15]. Dette antyder at DIM kan være en lovende naturlig tilgjengelig bioaktiv forbindelse som kan anvendes som et middel antikarsinogene som det gir en sikrere og forutsigbar reaksjon.
For tiden er den nøyaktige cellulære og biokjemiske mekanismen hvorved DIM utøver sin antikarsinogene effekter fortsatt ikke helt klarlagt, men basert på tilgjengelig litteratur, forstyrrer DIM med ulike signaloverføringsveier. I bryst og prostata cancer, har DIM blitt observert å indusere dose-avhengig apoptose ved å hemme AKT-kinase og IKK-mediert IκBα fosforylering, og dermed fører til inaktivering av AKT og translokasjon av NFkB i kjernen, noe som resulterer i redusert cellevekst og proliferasjon [16] , [17]. Dessuten er det blitt rapportert at DIM utøver sin kjemopreventive virkninger i hormonavhengige cancere, for eksempel bryst ved oppregulering av p21
WAFI /CIP1 og aktivering av JNK-reaksjonsveien [18]. Interessant, en potensielt mål av DIM virksomhet er østrogen metabolismen. Dalessandri et al. har vist at DIM økte nivåer av 2-hydroxyestrones hos postmenopausale kvinner med en historie med brystkreft som resulterer i en generell økning i 2-hydroxyestrones til 16a-hydroxyestrone ratio [19] og dermed favoriserer anti-proliferative tilstander. Smith et al. har vist at DIM, sammen med en phytoøstrogen, genistein kan modulere østrogen metabolismen til 2-hydroksylering av østrogensensitive prostatakreftceller [20]. Nylig har vi også oppdaget i vårt laboratorium som DIM kan modulere østrogenmetabolisme hos pasienter med TPD resulterer i en økning i forholdet mellom 2-hydroxyestrones til 16a-hydroxyestrone (upubliserte data) antyder bruken av kost forbindelser, slik som DIM, i TPD forebygging.
Basert på all tilgjengelig informasjon og diskutert i litteraturen, ble denne studien designet for å definere mekanismen (e) ansvarlig for anti-kreft effekt av DIM i skjoldbruskkjertelkreft. Vi rapporterer at DIM kan ha terapeutiske effekter ved å opptre som en chemo-forebyggende middel som har anti-østrogen egenskaper i skjoldbruskceller i kraft av downregulating østrogen induserte cellulære fenotyper av vedheft, invasjon og migrasjon. Våre data indikerer at anti-østrogen som tilhører DIM tilskrives rettet mot ekspresjonen av matriks-metalloproteinaser (MMP), som er viktige proteaser som deltar i adhesjon, invasjon og migrering av kreftceller. Videre er det faktum at MMP’er er under transkripsjonen regulering av østrogenrespons elementet (ERE) gir ytterligere tilslutning som DIM besitter anti-østrogen egenskaper.
Materialer og metoder
Cellekultur
Fire tyroid-cellelinjer ble anvendt i denne studien, BCPAP (human papillær skjoldbruskkjertelkreft cellelinje), 8505C (human papillær skjoldbruskkjertelkreft cellelinje), CGTHW-1 (human follikulær skjoldbruskkjertelkreft cellelinje) og ML-1 (human follikulær skjoldbruskkjertelkreft). BCPAP, 8505C og CGTHW-1 ble dyrket i RPMI-1640 (Mediatech, Herndon, VA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Atlanta Biologicals, Atlanta, GA), penicillin 10.000 IU /ml, streptomycin 10.000 pg /ml (Mediatech) og 2 mM L-glutamin (Mediatech) mL-1 ble dyrket i DMEM (Mediatech) supplert med 10% FBS, penicillin 10.000 IU /ml, streptomycin 10 000 ug /ml og 2 mM L-glutamin. BCPAP, 8505C, CGTHW-en og ML-en cellelinjer ble kjøpt fra DSMZ, Braunschweig, Tyskland. MCF-7 (human brystcancer-cellelinje) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) og dyrket i DMEM supplert med 10% FBS, penicillin, streptomycin, insulin og L-glutamin.
Western blot analyse
Cellene ble høstet ved bruk av 0,25% trypsin (Mediatech), vasket med PBS og lysert (1 x 10
6/100 pl av lyseringsbuffer) ved hjelp av radioimmunopresipitasjonsanalyse analysen (RIPA) buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,2% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 0,5% NP40, 1 mM Pefabloc] og inkubert på is i 30 minutter med periodevis risting. Lysatene ble sentrifugert ved 14000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C og supernatanten ble oppsamlet. Cellelysatene (20 ug protein) ble underlagt 12% SDS-PAGE under reduserende betingelser (tilstedeværelse av β-merkaptoetanol) som tidligere beskrevet [21], [22]. Kort sagt ble proteinene overført til Immobilon-P-membraner ved 220 mA i 2 timer og membranene ble blokkert med 4% tørrmelk i TBST [200 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl og 0,01% Tween-20 tilsatt frisk /l 1 x TBS (TBST)] i minst 2-3 timer på et risteapparat ved romtemperatur. Deretter ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med enten ER-α (Abcam, Cambridge, MA), ER-β (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) antistoff eller aktin (Santa Cruz Biotechnology) i TBST. Membraner ble vasket tre ganger med TBST og inkubert med de respektive pepperrot peroksidase (HRP) konjugert sekundært antistoff, i 2 timer ved romtemperatur i TBST inneholdende 2% melk. Etter fire vasker med TBS-T og en vask med TBS ble membranene utviklet av ECL substrat (Pierce Rockford, IL) og oppdaget på Denville autoradiografi filmer.
XTT celleproliferasjonsanalyse
To tusen celler i 200 ul medium ble sådd i hver brønn i 96-brønners plater og inkubert over natten for å tillate at cellene skulle vedhefte. Mediene ble fjernet og 3,3′-diindolylmethane (DIM), vennlig levert av Dr. Michael Zeligs (BioResponse, Boulder, Colorado) ble tilsatt i konsentrasjoner på enten 10, 25, 50, 75, 100, eller 500 mikrometer i en totalt volum på 200 ul og inkubert i 24 timer. Mediene ble fjernet og friskt vekstmedier ble det tilsatt uten DIM fulgt av tilsetning av 50 ul XTT [1 mg /ml i serumfritt RPMI + fenazin metosulfat (25 nM)]. Etter 4 timers inkubering ble OD tatt i en mikroplateleser ved 450 nm og referanse ved 630 nm. Gjennomsnitts OD verdiene ble beregnet for hver dose ved de respektive tidspunkter og prosent overlevelse som en funksjon av tid og dose ble brukt til å sammenligne de eksperimentelle og kontrollgrupper.
klonogene analysen
Å bestemme virkningen av DIM på clonogenicity, BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML-1-celler ble sådd ut i seks-brønns plater (200 celler per brønn). Cellene fikk lov til å følge over natten etter som nye medier som inneholder ± 10
-8 M E
2 ± 50 M DIM ble lagt til eller ubehandlet. Etter 21 dager i kultur ble cellene fiksert og farget ved bruk av 0,025% Coomassie brilliant blue R250 (i 50% metanol og 10% eddiksyre) for å visualisere cellekolonier. Koloniene ble talt, og prosentvis hemming av clonogenicity ble bestemt i de behandlede cellene.
Transwell migrasjon analysen
BD BioCoat Kontroll Setter (BD Biosciences, Bedford, MA) med 8-mikrometer pore membran filtrene ble anvendt for migrering assay som tidligere beskrevet [21], [23]. I korthet ble cellene sultet i 18 timer ved bruk av sultemedium [fenolrødt-fritt medium supplementert med 10% trekull strippet FBS (Sigma Chemical Co.) og penicillin (10.000 IU /ml)]. Cellene ble så høstet ved trypsinering og 2,5 x 10
4 celler ble sådd ut i det øvre kammer i 500 ul medium inneholdende 1% FBS ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 mikrometer DIM. Det nedre kammer inneholdt 750 ul media supplert med 5% FBS. Etter 18 timers inkubasjon ble ikke-migrerende celler fjernes fra den øvre overflate av membranen ved forsiktig vasking under bruk av bomullspinne. Celler på den nedre overflaten av membranen ble deretter fiksert ved hjelp av metanol og farget ved anvendelse av 1% toluidinblått 1% boraks flekk etterfulgt av to vaskinger med destillert vann. Innskudd ble så tillatt å airdry og tellet i 10X felt. Data er uttrykt som antall migrerte celler pr 10X felt mikroskopibilde for hver prøve brønn og normalisert til celletellinger som oppnås fra den ubehandlede kontroll.
Scratch Sår Assay
trekkende evne BCPAP, 8505C, CGTHW -1 og ML-1-celler ble også undersøkt ved en ripe sår assay. 5 × 10
5 celler ble sådd ut i en seks brønn plate og lov til å overholde og vokse til 60-70% konfluente cellemonolagene. Deretter ble tre vertikale sår forårsaket per brønn med 2,5 ul steril pipette, etterfulgt av fjerning av eventuelt celleavfall og frigjorte celler. De sårede celle monolag ble deretter inkubert i frisk komplett media med eller uten 25 og 50 mikrometer DIM og østradiol. En horisontal linje ble gjort for å tillate visualisering av celler på samme punkt. Cellene ble inspisert hver tredje time inntil skrape celler for kontroll var fullstendig overført fra den ene enden av sår til annen, som var 24 timer for BCPAP, 8505C og CGTHW-1 og 48 timer for ML-1. Bildene ble tatt rett over eller under det horisontale merket ved hjelp av et lysmikroskop ved 5X.
celleadhesjonsanalyse
BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML-1-celler ble høstet som beskrevet og podet med en tetthet på 5 × 10
5 celler per brønn i 6-brønners kulturskåler i media supplert med ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 mikrometer DIM eller forblir ubehandlet og tillates å følge i 2 timer. Etter angitte tidspunkter, ble medium med ikke-klebet celler fjernet og brønnene ble forsiktig vasket to ganger med PBS for å fjerne eventuelle løst festede celler. Adherente celler ble deretter skrapet og telt ved bruk av 0,4% trypanblått-oppløsning (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Tallene for adherente celler ble tellet ved bruk av et hemocytometer og effekten av DIM på celleadhesjon ble uttrykt som prosent reduksjon i vedheftende celletelling for celler behandlet med DIM i forhold til kontrollceller.
Invasion assay
invasjon assay ble utført som tidligere beskrevet [21] med BD BioCoat vekstfaktor Redusert Matrigel bølgen kamre (BD Biosciences, Bedford, MA) med 8-um pore membranfiltre som var belagt med matrigel. Protokollen var hovedsakelig den samme som migrerings analyse med unntak av at vekstfaktor redusert Matrigel invasjons kamre ble rehydrert i 2 timer ved anvendelse av serumfritt RPMI-medium ved 37 ° C før lasting av cellene på innsatser. Når utvannet, 2,5 × 10
4 celler ble resuspendert i RPMI (500 mikroliter) inneholder 1% FBS med ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 mikrometer DIM og ble forsiktig overført til den øvre flate av filtre i kammeret. Celler ble tillatt å invadere i 18 timer hvoretter cellene ble farget og tellet på lignende måte som beskrevet for migrering analysen. Prosent invasjon ble beregnet basert på prosent av celler invaderer gjennom vekstfaktor redusert Matrigel invasjons kamre i forhold til de celler som migrerer gjennom kontroll-membran.
MMP deteksjon
Thyroid-celler ble sådd ut ved en densitet på 5 x 10
5 celler per brønn i 6-brønners kulturskåler og tillatt å over over natten hvoretter de ble deretter byttet til serumfritt medium og inkubert med ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 mikrometer DIM eller venstre ubehandlet i 24 timer. Kondisjonert medium ble høstet, sentrifugert for å fjerne eventuelle rester, og aliquoter ble lagret ved -80 ° C inntil analysert for MMP-2 og MMP-9 sekresjon og aktivitet som tidligere beskrevet [24], [25]. I korte trekk ble den totale proteinkonsentrasjon på det kondisjonerte medium bestemt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse fargestoff og likeverdige proteiner ble anvendt for hvert forsøk. For gelatin zymografi, ble SDS-PAGE-geler kopolymerisert med 0,1% gelatin (Sigma Chemical Co.) og 1 ug protein ble løst under ikke-reduserende betingelser. Etter elektroforese ble gelene vasket to ganger i renatureringsbuffer (2,5% Triton X-100 i destillert vann) i 1 time på en orbital-rystemaskin. De zymograms ble inkubert i 1 time ved romtemperatur fulgt av 36 timer ved 37 ° C i zymografi buffer (5 mM CaCl
2, 0.2 mM NaN
3 og 1 mM ZnCl
2 i 50 mM Tris- HCl) med buffer endres hver 12. time. Gelene ble deretter farget med Coomassie blue (G-250 flekk, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) og avfarget med 10% metanol og 7,5% eddiksyre. Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av kondisjonert medium fra skjoldbruskkjertelen kreftceller (like proteinkonsentrasjoner) som beskrevet i den foregående seksjon ved hjelp av MMP-2 og MMP-9 (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA) antistoffer. For MMP hemning, generell MMP inhibitor 1,10 phenanthroline (Sigma Chemical Co.) som brukes. 2,5 × 10
4 celler ble resuspendert i RPMI (500 mikroliter) inneholder 1% FBS med ± 10
-8 ME
2 ± 20 mikrometer 1,10 phenanthroline ± 25 mikrometer DIM og sådd på BD BioCoat kontroll~~POS=TRUNC Innsetting for migrasjon og matrigel belagt innsatser for invasjon som beskrevet i forrige avsnitt.
siRNA og transfeksjon forhold
for å kneble østrogen reseptor studier, ER-α små interfererende RNA (siRNA) og siRNA transfeksjon reagens (DharmaFECT1) ble oppnådd fra Dharmacon (Dharmacon, Inc., Lafayette, CO). BCPAP og MCF-7-celler ble sådd ut i 6-brønners plater og tillatt å holde seg over natten. -Celler ble transfektert i 48 timer, og deretter trasfected ble cellene høstet og sådd ut på BD BioCoat kontroll Setter (migrasjon) og matrigel belagt innsatser (invasjon) i media inneholdende 1% FBS ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 mikrometer DIM. Ikke-transfektert skjoldbrusk kreft celler behandlet med ± 10
-8 M E
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 mikrometer DIM ble brukt som egnede positive kontroller. Migrasjon og invasjon studier ble utført som beskrevet i forrige avsnitt.
statistiske beregninger
Eksperimenter som presenteres her representerer tre gjentak med statistisk signifikans bestemmes ved hjelp av en paret Students
t
test med en sannsynlighet ( «
p
« verdi) ≤0.05 brukes til å forkaste nullhypotesen.
Resultater
thyroid celler uttrykker østrogenreseptoren
den skjoldbrusk er ikke kjent for å opptre som en tradisjonell østrogen responsive vev, for eksempel brystkreft. For å bestemme statusen til østrogenreseptoren i skjoldbruskkjertelceller, brukte vi fire skjoldbruskcellelinjer som våre cellekulturmodeller. BCPAP og 8505C er menneskelige papillær skjoldbruskkreftcellelinjer, CGTHW-en og ML-en er menneskelige follicular skjoldbrusk kreft cellelinjer. Det ble observert at alle skjoldbruskcellelinjer analysert uttrykt begge isoformer av østrogenreseptor (ER), ER-α og ER-β (fig. 1) ved sammenlignbare nivåer. MCF-7, et klassisk ER uttrykkende brystcancer cellelinje, ble anvendt som en positiv kontroll for detektering av begge polymorfe former av ERs (ER-α og ER-β).
Hele celle-protein (20 pg) ble løst ved SDS-PAGE etterfulgt av Western blot analyse for eR-α (fortynning 1:500), eR-β (fortynning 1:1000) og aktin (fortynning 1:5000). Alle cellelinjer brukt i denne studien (BCPAP, 8505C, CGTHW-en og ML-1) uttrykker både ER-α og ER-β på sammenlignbare nivåer.
DIM har anti-proliferativ effekt på skjoldbrusk celler
DIM, et naturlig stoff fra cruciferous grønnsaker har blitt observert å ha anti-proliferative egenskaper mot flere hormon responsive kreft [14], [16] – [18]. Vi ønsket å evaluere effekten av DIM på den proliferative aktivitet av thyroid kreft og for å gjøre dette, en XTT-assay ble utført, og resultatene er vist i tabell 1. Alle cellelinjer (BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML -1) anvendt i denne studien ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av DIM i 24 timer. En doseavhengig inhibering i cellenes levedyktighet ble observert med en 50% hemning ved en konsentrasjon på omtrent 50 uM DIM i løpet av 24 timer med behandling i alle fire cellelinjer, BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML-1. Basert på disse observasjonene (tabell 1), ble 25 mikrometer DIM konsentrasjon brukes til videre karakterisere virkningene av DIM på skjoldbrusk celler både på molekylære og fenotypiske nivåer.
DIM hemmer klonogene evnen til skjoldbruskkjertelen cellene
en av kjennemerket egenskapene til kreftceller er evnen til å dele seg i henhold til isolerte betingelser ved anvendelse av minimal parakrine og autokrine muligens flere faktorer [26]. Anticancer virkning av DIM på evnen av BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML-1-celler å dele seg i det uendelige ble evaluert ved en klonogene celleoverlevelsesanalyse. To hundre celler per brønn i seks brønns plater ble behandlet med 50 uM DIM ± østradiol i 21 dager. Som vist i tabell 2, de ubehandlede skjoldbrusk-celler har evnen til å danne kloner, mens østrogen behandlingen resulterte i omtrent 8 (8505C) -33% (ML-1) vekst i klon formasjon avhengig av cellelinjer. DIM fullstendig opphevet klon dannelse av alle cellelinjer uten hensyn til om de ble behandlet med østradiol. Disse eksperimentene etablere differensial respons av ulike skjoldbruskkjertelen kreftceller til østradiol og anti-østrogen aktivitet av DIM.
DIM reduserer vandrende evne av skjoldbrusk celler
Kreftceller har en forbedret evnen til å migrere inn i nærliggende vev og visse midler slik som østradiol har blitt observert å hjelpe til i denne migreringen. Terapeutiske midler som kan senke den evnen som disse celler til å migrere kan antagelig effektivt redusere risikoen for metastasering. Vi har tidligere vist at skjoldbruskkjertelceller har evnen til å øke migreringen som respons på østrogen [21], og for å bestemme om DIM kan påvirke den vandrende potensialet av disse cellene,
in vitro
migrasjonsanalyser ble utført. Sultet skjoldbrusk celler ble sådd i et transwell migrasjon kammer med estradiol ± fulvestrant eller ± 25 mikrometer DIM og lov til å migrere. Vi har observert at skjoldbruskkjertelceller var i stand til å migrere og denne evne til å migrere ble forbedret når cellene ble behandlet med E
2 (grå søyler) i forhold til ubehandlede celler med 30% økning i migreringen for BCPAP, 50% til 8505C, 89% for CGTHW-1 og 63% for ML-1 (fig. 2A). Denne økning i cellemigrering ble opphevet når fulvestrant ble anvendt sammen med østradiol [prikkede søyler) som tyder på at den vandrende evnen til disse skjoldbrusk-celler er påvirket av østrogen og en østrogen-reseptor-antagonist har opphevet migrering av disse cellene. DIM (25 mm) betydelig redusert migrasjon av skjoldbrusk celler (svarte søyler). Denne reduksjon ble observert å være omtrent 37-57%, og var cellelinje avhengig. Videre fikk tillegg av østradiol sammen med 25 mikrometer DIM (stripete barer) ikke forbedre den vandrende evne av skjoldbrusk celler, betegner antiestrogen som evnen til DIM.
(A) 2,5 × 10
4 celler ble resuspendert i 500 mL av RPMI med 1% FBS ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 mikrometer DIM og sådd i det øvre kammeret av BD BioCoat kontroll Setter (8- mikrometer pore membranfiltre). 750 ul av RPMI inneholdende 5% FBS ble tilsatt til bunnkammeret som et kjemotiltrekkende. Etter 18 timer ble cellene som migrerte fiksert, farget og tellet under 10X objektiv. Gruppene er som følger- ubehandlede (hvite søyler), E
2 ble behandlet (grå søyler), E
2 + fulvestrant (stiplede søyler), 25 mikrometer DIM (svarte striper) og E
2 25 iM DIM ble behandlet (stripete barer). Dataene er uttrykt som antall celler tellet (migrerte celler) for hver prøve og normalisert til celletallet oppnådd fra den ubehandlede kontroll. Stjernen betegner statistisk signifikante forskjeller (
p
0,05) mellom de angitte prøvene. Scratch såret analyse for BCPAP (B) og CGTHW-en (C). 5 x 10
5-celler ble sådd ut og tillatt å vokse i semi konfluent monolag, hvoretter en «vertikal sår «er laget, og cellene ble deretter lov til å migrere i nærvær av enten 25 uM eller 50 uM DIM. Cellene ble visualisert under 5X hver tredje time og fotodokumentasjon ble tatt på 18 timer når cellene helt migrert fra den ene enden av «scratch» til andre enden i ubehandlede kontroller.
For ytterligere å validere effekt av DIM på trekkevne av skjoldbrusk-celler, ble en ripe sår assay utføres, noe som er en partiell
in vivo
fremstilling av metastatiske fenotype [27]. Thyroid celler (BCPAP, 8505C, CGTHW-en og ML-1) ble dyrket i en 60-70% konfluent monolag fulgt av dannelse av riper og påfølgende inkubasjon med ± DIM. Vi fant at den DIM forårsaket en reduksjon i cellemigrering med 50-60% (som observert visuelt) på en doseavhengig måte i skjoldbruskkjertelceller [BCPAP (Fig. 2B) og CGTHW-1 (fig. 2C)]. Lignende resultater ble observert med 8505C og ML-1 (data ikke vist). Vi har også tidligere sett at østradiol forbedrer migrasjon og denne migrasjonen ble hemmet av fulvestrant, ligner på scratch såret analyseresultatene oppnådd i denne studien bruker DIM [21].
DIM reduserer vedheft evne av skjoldbrusk celler
for å kunne spre tumorceller måtte forholde seg til den ekstracellulære matriks (ECM) av sekundære organer [26], [28]. Vi evaluerte effekten av DIM på adhesjon av skjoldbrusk celler ved å utføre en vedheft analysen. Skjoldbrusk-celler ble tillatt å overholde i nærvær av 10
-8 ME
2 eller ± 10
-6 M fulvestrant (en klassisk østrogen reseptor antagonist) ± 25 uM DIM i 2 timer og% adhesjon ble beregnet (fig. 3). Det ble observert en økning i adhesjon når cellene ble behandlet med E
2 (grå søyler), som ble opphevet med fulvestrant (prikkede søyler) som tyder på at adhesjonen er en aktiv fenotype i skjoldbruskkjertelceller muligens krever funksjonell ER aktivitet. Interessant nok ble det observert en signifikant reduksjon i adhesjon når cellene ble behandlet med 25 uM DIM (sorte stolper), med en reduksjon 58% i adhesjon for BCPAP, 42% til 8505C, 70% for CGTHW-1 og 45% for ML-1 . Kombinasjon av østradiol og 25 uM DIM (stripede stolper) kunne ikke forbedre adhesjonen av skjoldbrusk-celler, noe som tyder på at DIM kan hindre østrogen forbedret adhesjon og kan potensielt virke som et effektivt anti-østrogen /metastatisk middel, som nedgangen i celleadhesjon av DIM er lik den reduksjon i adhesjon observert med estrogen receptor antagonist fulvestrant.
5 x 10
5-celler ble suspendert i fullstendig medium inneholdende 10 ±
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 mikrometer DIM og belagt i 6 vel kultur retter. Etter 2 timer ble levedyktige klebet celler ble fjernet ved skraping og tellet ved trypanblått. Gruppene er som følger- ubehandlede (hvite søyler), E
2 ble behandlet (grå søyler), E
2 + fulvestrant (stiplede søyler), 25 mikrometer DIM (svarte striper), og E
2 + 25 mikrometer DIM ble behandlet (stripete barer). Data er uttrykt som% holdt celler sammenlignet med ubehandlede celler som ble satt til 100% adhesjon. Enkelt stjerne betegner statistisk signifikante forskjeller (
p
0,05). Mellom de angitte prøvene
DIM hemmer invasjonen av skjoldbrusk celler
Dannelse av sekundærmetastaser av tumorceller krever invaderer ECM av sekundære organer [26] og hemme denne invasjonen er en strategi i kreftbehandling som har vært mye undersøkt. Effekten av DIM på invasiv potensialet i BCPAP, 8505C, CGTHW-1 og ML-1 ble analysert ved bruk av et transwell invasjon kammer belagt med en biologisk matriks
in vitro plakater (matrigel). Thyroid celler ble lagt i en transwell kammer med estradiol ± fulvestrant eller ± 25 mikrometer DIM og fikk lov til å invadere gjennom matrigel. Vi har observert at skjoldbruskkjertelceller var i stand til å invadere gjennom matrigel og invasjon av disse cellene ble forbedret når cellene ble behandlet med E
2 (grå søyler) med en 40% økning i invasjon for BCPAP, 36% til 8505C, 30% etter CGTHW-1 og 31% for ML-1 (fig. 4). Denne økningen i celle invasjon ble opphevet når fulvestrant ble brukt i kombinasjon med østradiol (prikkede søyler) antyder at en østrogen-reseptor-antagonist kan blokkere invasiv tilbøyelighet av skjoldbrusk-celler. For å evaluere effekten av DIM på invasjonen av skjoldbrusk celler, ble alle cellelinjene behandlet med 25 mikrometer DIM (svarte striper) og en signifikant reduksjon (
p
0,05) i invasjonen ble observert. Denne reduksjonen i invasjon var omtrent 52% for BCPAP, 50% til 8505C, 80% for CGTHW-1 og 48% for ML-1 sammenlignet med kontrollceller (normalisert til 100% og
p
0,05 ). Videre pro-proliferativ østradiol, i kombinasjon med DIM (stripete barer), ble ikke bedre av invasiv evne av skjoldbrusk celler. Disse dataene antyder at DIM opphever østrogen forbedret cellulære prosessene for invasjonen dermed muligens rettet mot et stort skritt i tumorprogresjon og metastasering.
2,5 × 10
4 celler resuspendert i 500 mL medium som inneholder 1% FBS ± 10
-8 ME
2 ± 10
-6 M fulvestrant ± 25 uM DIM ble sådd ut i det øvre kammer av vekstfaktor redusert matrigel invasjons kamre. 750 ul vekstmedium inneholdende 5% FBS ble anvendt som kjemoattraktant i bunnkammeret. Prosent invasjon ble beregnet basert på antallet av celler som invaderer gjennom kamrene i forhold til cellene migrerer gjennom reguleringsmembran etter 18 timer. Gruppene er som følger- ubehandlede (hvite søyler), E
2 ble behandlet (grå søyler), E
2 og ICI (prikkede søyler), 25 mikrometer DIM (svarte striper) og E
2 25 mikrometer DIM ble behandlet (stripete barer). Data blir representert som% invasjon som er midlere antall invaderte celler pr 10X felt mikroskopibilde for hver prøve vel i forhold til migrasjon gjennom reguleringsmembranen og normalisert til den ubehandlede kontroll. Stjernen betegner statistisk signifikante forskjeller (
p
0,05). Mellom de angitte prøvene
DIM undertrykker østrogen indusert MMP sekresjon
MMP er pålitelige markører for svulst celle invasjon og migrasjon. Videre er ondartede svulster kjent for å ha økt MMP uttrykk sammenlignet med benigne tumorer, noe som fører til degradering av den ekstracellulære matriks, som resulterer i økt invasjon og migrering av tumorceller [29], [30]. Fytokjemikalier som genistein og i3c er blitt vist å målrette aktivitet og sekresjon av MMP i østrogenfølsomme kreft [31]. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting.
