Abstract
Bakgrunn
Nylig echinoderm microtubule-assosiert protein-lignende 4- anaplastisk lymfom kinase (
EML4-ALK
) fusion genet har blitt en viktig biomarkør for ALK tyrosinkinasehemmer (crizotinib) behandling i NSCLC. Men den beste påvisningsmetoden og betydningen av
EML4-ALK
variant typer forblir usikre.
Metoder
Reverse transkriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), fluorescens in situ hybridisering (FISH) og Immunhistokjemisk (IHC) flekk ble utført på tumorvev av 312 NSCLC pasienter for påvisning av
ALK
rearrangements. Mutasjon analyser for
EGFR Hotell og
KRAS
gener ble også utført.
Resultater
Tretten av de 312 pasientene (4,17%) hadde
ALK
rearrangements oppdaget av RT-PCR. Hvis RT-PCR data ble brukt som gullstandarden, fisk testene hadde lav sensitivitet (58,33%), men veldig god spesifisitet (99,32%). IHC flekken hadde bedre følsomhet (91,67%) enn fisk, men lavere spesifisitet (79,52%), når cut off var IHC2 +. Alle 8 pasienter med stor overflod av
EML4-ALK
positive celler i tumorvev (vurdert ved signalintensitetene av RT-PCR-produkt), ble også ha høy ekspresjon av ALK protein (IHC3 +) og positivt for fisk, bortsett fra én mislyktes i fisk. Varianter 3a + 3b (4/5, 80%) av
EML4-ALK
fusjonsgenet ble mer vanlig å ha høy overflod av
EML4-ALK
positive celler i tumor vev enn variant 1 ( 1/3, 33,3%). Meta-analyse av publiserte data for 2273 NSCLC pasienter viste at variant 3 (23/44, 52,3%) var den vanligste typen i kinesiske befolkningen, mens variant 1 (28/37, 75,7%) var mest vanlig hos kaukasiske.
Konklusjoner
Blant de tre deteksjonsmetoder, kan RT-PCR detektere ikke bare nærværet av
EML4-ALK
fusjonsgenet og deres variant typer, men også overflod av
EML4-ALK
positive celler i NSCLC tumorvev. De to sistnevnte faktorer kan påvirke behandlingen respons til anti-ALK-inhibitor. Inkludert RT-PCR som en diagnostisk test for ALK-hemmer behandling i prospektive kliniske studier anbefales
Citation. Wu Y-C, Chang I-C, Wang C-L, Chen T-D, Chen Y-T, Liu H-P, et al. (2013) Sammenligning av IHC, FISH og RT-PCR metoder for påvisning av
ALK
rearrangements i 312 ikke-småcellet lungekreft Pasienter i Taiwan. PLoS ONE åtte (8): e70839. doi: 10,1371 /journal.pone.0070839
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada og University of Ottawa, Canada
mottatt: 15. april 2013; Godkjent: 24 juni 2013; Publisert: 07.08.2013
Copyright: © 2013 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Health Research Institutes (NHRI-A1-MG-100-PP-04, NHRI-A1-MG-101-PP-04), og National Science Council (NSC97-2320-B-400-006- My3) for Dr. Shiu-Fenghuang. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) studie ble støttet av et stipend fra Pfizer (WS2084622) for Dr. Yi-Cheng Wu. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Vi har følgende interesser: fluorescens in situ hybridisering (FISH) studie ble støttet av et stipend fra Pfizer (WS2084622) for Dr. Yi-Cheng Wu. Pfizer i Taiwan kom for å besøke vårt team i år 2011 for å støtte en studie av ALK omorganisering i NSCLC pasienter i Taiwan, noe som var viktig for dem, siden disse dataene var fortsatt mangler i Taiwan (data fra Kina og Hong Kong har blitt publisert i år 2010 og 2009, henholdsvis). De ønsket å støtte en studie som kan omfatte mer enn 300 NSCLC pasienter (naive til ALK-hemmer behandling) og inkludert fisk gjenkjenning metoden. De ønsket først og fremst å vite forekomsten av ALK rearrangements i NSCLC pasienter i Taiwan. Pfizer annonserte at de ikke ville forstyrre studiedesign, metoder, resultater og fremtidige publikasjoner. Ved slutten av tilskuddet støtte, vi trenger bare å sende inn en kort rapport fra studien resultatene, som var lik andre finansieringskilder. Derfor bestemte vi oss for å ta imot denne bevilgningen fra Pfizer etter denne avtalen. I slutten av 2012, har vi levert en to-siders kort oppsummering rapport til Pfizer på tid (slutten av tilskuddet støtte), som bare inkluderte rådata. Etter det, trenger vi ikke å gi noen ytterligere opplysninger til Pfizer. Dr. Shiu-Fenghuang har blitt invitert som medlem av Pfizer rådgivende komité i NSCLC studie i Taiwan. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke vår tilslutning til alle de PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Introduksjon
lungekreft, spesielt ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) har vært den ledende årsak til kreft dødsfall i verden, og det pasientantallet øker fortsatt [1,2]. Den store suksessen til målrettet behandling med epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) tyrosin kinase inhibitor (TKI): gefitinib og erlotinib, for behandling av lunge adenokarsinom har gjort målrettet terapi blitt den mest populære modalitet for store kreft hos mennesker [3-7]. Søker etter andre enn EGFR i kreftbehandling lunge nye og effektive mål har ikke vært vellykket før år 2007, da Soda, et al identifisert echinoderm microtubule- assosiert protein-like-4 og anaplastisk lymfom kinase (
EML4-ALK
) fusjonsgenet med trans evne i NSCLC pasienter [8]. ALK-proteinet er et 200kDa reseptor tyrosin kinase. Dens signalvei omfatter celleproliferasjon, differensiering, og anti-apoptose [8,9]. Før identifisering av
EML4-ALK
fusjonsgenet,
Nucleophosmin Anmeldelser –
ALK plakater (NPM-ALK) fusjonsgenet ble først identifisert i anaplastisk storcellet lymfom [10]. Ulike kombinasjoner av ALK med andre proteiner har blitt oppdaget i ulike svulster, som for eksempel diffuse store B-celle lymfom, inflammatorisk myofibroblastic tumor, neuroblastom, plateepitelkarsinom i spiserøret, og nyrecellekarsinom [11-13]. Men
EML4-ALK
fusjonsgenet er unik for NSCLC [14]. ALK er nå anerkjent som en viktig onkogen driver i NSCLC. Multiple
EML4-ALK
varianter i NSCLCs har blitt identifisert, alle inneholder den samme C-terminal kinase domene, og gi gevinst-av-funksjon egenskaper [14]. Selv
EML4
genet er den dominerende fusjonspartneren av
ALK
i NSCLC, andre fusjonspartner gener også er blitt identifisert, som inkluderte
KIF5B-ALK, KLC1-ALK og TFG-ALK
fusjonsgener [15-18]. Flertallet av
ALK
rearrangements ble identifisert i adenokarsinom og ikke-røykere [8,14,18-28]. Insidensen av
EML4-ALK
fusjonsgenet i NSCLC var rundt 01.04 til 11.06% med ingen signifikante forskjeller mellom asiatiske og vestlige land [8,14,18-28]. Mens
EML4-ALK
fusjon ble identifisert i NSCLC, en ny ALK tyrosinkinasehemmer (ALK-TKI): ble crizotinib utviklet ved samme tid. Dette stoffet ble opprinnelig konstruert som en MET-tyrosinkinase-inhibitor for behandling av NSCLC, men det ble funnet å være en ALK-inhibitor, også. Dermed ble prospektive kliniske studier designet og startet raskt på NSCLC pasienter med
EML4-ALK
fusjonsgener. Fase II klinisk studie ble publisert i år 2010, som viste dramatisk respons og lengre progresjonsfri overlevelse til crizotinib behandling hos pasienter med
EML4-ALK
fusjonsgenet [29-31], lik EGFR-TKI på NSCLC pasienter med
EGFR
mutasjoner [3-7]. Crizotinib ble godkjent av Food and Drug Administration (FDA) i USA i år 2011 for behandling av NSCLC pasienter, og med en ledsager diagnostisk test, Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit, som kan bidra til å avgjøre om en pasient har unormal
ALK
genet [32].
EML4-ALK
fusjonsgenet blir en ny viktig molekylær markør for crizotinib behandling hos NSCLC pasienter. Men den beste påvisningsmetode for
EML4-ALK
fusjonsgenet fortsatt kontroversielt. Teoretisk revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) og fluorescens in situ hybridisering (FISH) finnes to standardmetoder for påvisning av fusjonsgener, men begge har betydelige begrensninger i klinisk praksis. RT-PCR krever Dypfryst vevsprøver for utvinning av RNA, og en pålitelig FISH analysen krever god fluorescens omfang og teknisk ekspertise. Immunhistokjemisk (IHC) flekken for påvisning av ALK over-uttrykk har vært en veletablert metode for påvisning av
ALK
rearrangements, som NPM-ALK, i hematologiske maligniteter i årevis [33,34]. Siden kostnadene ved IHC-flekk-analyse er mye lavere enn den for FISH-analyse, kan IHC flekker være et mye mer praktisk og kostnadseffektiv metode for screening
ALK
rearrangementer i NSCLCs, sammenlignet med fisk eller RT-PCR . Men følsomheten av IHC flekken fortsatt kontroversielt. Mange forskningsmiljøer rapportert gode korrelasjoner mellom IHC flekken og FISH for påvisning av
EML4-ALK
fusjonsgenet [16,35-38], men noen rapporterte at IHC flekken var ikke-sensitiv deteksjon av
EML4 -Alk
fusjonsgenet [25,39-41]. Det ville være mest ideelt å utføre alle tre metodene (IHC, fisk og RT-PCR) i en stor serie med NSCLC tumorer for direkte sammenligning av deres efficacies.
Tidligere har vi rapportert en god korrelasjon mellom IHC flekken for ALK og RT-PCR studie for identifisering av
EML4-ALK
fusjonsgener i 64 NSCLC pasienter [42]. Vi har utvidet vår studie til 312 NSCLC pasienter og utført alle tre metodene (IHC, FISH, og RT-PCR) for direkte sammenligning av sensitivitet og spesifisitet.
Resultater
ALK
omorganisering oppdaget av RT-PCR
klinikken-patologisk karakteristikk av 312 pasienter er vist i tabell S1. Blant de 312 pasientene inkludert for RT-PCR studie, tretten pasienter (13/312, 4,17%), tre mannlige (en var aldri røyker) og ti kvinnelige (syv ble aldri røykere), ble funnet å ha
ALK
omorganisering. Tolv hadde
EML4-ALK
fusjonsgenet og en hadde
KIF5B-ALK
fusjonsgenet. De patologi diagnosene var adenokarsinomer (ADC) i elleve pasienter, plateepitelkarsinom (SCC) i en pasient, og adenosquamous karsinom (ADSC) i en pasient. Ingen av de 13 pasientene hadde co-eksisterende
EGFR
eller
KRAS
mutasjoner. Forekomsten av
ALK
omorganisering i EGFR-villtype, ikke-SCC pasienter var 12% (12/100).
KLC1-ALK
, og
TFG-ALK
fusjonsgener ble ikke identifisert. Blant de 12 pasienter med
EML4-ALK
fusjonsgenet, tre var variant 1, en var variant 2, fem var variant 3a + 3b med 3b dominerende, to var variant 3a, og en var variant 3b.
ALK
omorganisering ble bare signifikant assosiert med kvinnelige kjønn (P = 0,0248) ved univariat analyse. Selv om flertallet (8/13, 61,5%) av pasientene med
ALK
omorganisering var i stadium I og ingen var i stadium IV, foreningen med tumorstadium var statistisk ikke-signifikant (p = 0,5740). Multivariat analyse for foreningen med fem klinisk-patologiske egenskaper, dvs. kjønn, alder, røyking historie, histologiske typer og tumor stadium, ble utført av binær logistisk regresjon test. I tillegg til kvinnelige kjønn (p = 0,007), ikke-røyker også ble signifikant assosiert med
ALK
rearrangements (p = 0,022), siden det var en stor forskjell i andelen røykere mellom mannlige og kvinnelige pasienter (aldri røykere var 38% hos mannlige versus 94,4% i kvinnelig, p 0,0001). Den tumorstadium forble ikke-signifikant. P-verdier for hvert trinn var: Stage I: P = 0,6220, Stage II: P = 0,4040, Stage III: P = 0,6190, og Stage IV: P = 0,9990, henholdsvis
ALK
omorganisering bestemmes av FISH
Blant de 312 pasientene var fisk studier er ikke utført på to pasienter, siden ingen resttumorvevet kan bli funnet i parafinsnitt. FISH studier mislyktes i ytterligere 5 pasienter. Som et resultat, fisk analysedata var tilgjengelig i totalt 305 pasienter. Ni pasienter (9/305, 2,95%) var positiv etter pause fra hverandre FISH studien. Alle av dem hadde adenokarsinom. Den ene var mannlig pasient (røyker), og åtte kvinnelige pasienter (to var nåværende røykere). Bare 7 av de 9 pasienter var også RT-PCR (+).
ALK protein ekspresjon detektert av IHC flekk
Totalt 310 pasienter hadde vellykket IHC flekken for påvisning av ALK proteinekspresjon, siden 2 pasienter uten tumor del i vevssnitt ble ekskludert. Alle de 78 pasientene med negativ IHC flekken ble RT-PCR (-) og FISH (-). For de 159 pasienter med IHC 1+, bare en pasient var RT-PCR (+), men FISH (-), det var den eneste SCC positivt for RT-PCR. For de 61 pasienter med IHC 2+, tre pasient var RT-PCR (+), men FISH (-), og ett pasienter var RT-PCR (-) men FISH (+). For 12 pasienter med IHC 3+ var ni RT-PCR (+). Syv av dem var også FISH (+), som inkluderte den eneste pasient med
KIF5B-ALK
fusjonsgenet (figur S1). En annen var FISH (-) og den siste mislyktes i fisk. For de resterende 3 pasienter med IHC3 + og RT-PCR (-), en var FISH (+) (figur S2), en var FISH (-), og en mislykket i fisk. De sistnevnte 2 pasienter hadde også EGFR mutasjoner.
EGFR mutasjonsanalyser
Blant de 312 NSCLC pasienter,
EGFR
mutasjonsraten var 43,91% (137/312). Alle var ikke-SCC, som omfattet 133 ADC og 4 ADSC.
EGFR
mutasjonsraten hos ikke-SCC pasienter var 57,81% (137/237). For ikke-SCC pasienter,
EGFR
mutasjoner ble bare signifikant assosiert med de som aldri røyker (p = 0,0002), men ikke med alder eller kjønn. Ingen av pasientene hadde co-eksisterende
ALK
eller
KRAS
mutasjoner.
KRAS mutasjon analyserer
Blant de 312 NSCLC pasienter,
KRAS
mutasjonsraten var 5,77% (18/312), som omfattet 16 adenokarsinomer og to adenosquamous karsinomer. Mutasjonsraten i ikke-SCC var 7,59% (18/237). Tolv pasienter var menn (10 var røykere) og seks var kvinner (ingen var røykere).
KRAS
mutasjoner ble bare signifikant assosiert med histologi type (non-plateepitelkarsinom) (p = 0,0091).
Sammenligning av de tre deteksjonsmetoder
Totalt 305 pasienter hadde data for alle tre deteksjonsmetoder (RT-PCR, fisk og IHC) for direkte sammenligning. Resultatene er vist i Tabell S2. Resultatene fra studien av alle 17 pasienter positive for enten RT-PCR eller FISH eller høy ALK uttrykk ble oppsummert i tabell S3. De histologiske trekk ved alle 17 pasienter ble anmeldt. Alle adenokarsinomer positive for ALK var sammensatt av blandede histologiske mønstre.
Den spesifisitet og sensitivitet av fisk og IHC henhold til RT-PCR data
Hvis RT-PCR resultater ble brukt som gullstandarden for ALK omleiring, og cut-off for ALK-proteinekspresjon ble IHC 2+, sensitiviteten og spesifisiteten til IHC var 91,67% og 79,52%, henholdsvis. Den positive prediktive verdien av IHC var bare 15,49% og den negative prognose verdi var 99,57%. Hvis cut-off IHC 3+, sensitiviteten og spesifisiteten av IHC var 66,67% og 99,32%, henholdsvis. Den positive prediktive verdien av IHC var 80,00% og den negative prognose verdi var 98,64%. For FISH testen, selv om dens følsomhet var bare 58,33%, spesifisiteten var svært høy (99,32%). Den positive prediktive verdien av fisk var 77,78% og den negative prognose verdi var 98,31%.
Vurdering av overflod av EML4-ALK-positive celler i tumor vev ved RT-PCR
overflod av
EML4-ALK
positive celler i tumorvev ble vurdert i henhold til de intensiteter av RT-PCR produkter på gel elektroforese. Resultatet av hver tumor ble sammenlignet med fisk og IHC data (Tabell S3). Åtte av de 13 RT-PCR (+) svulster hadde sterk intensitet av RT-PCR-produktene, som antydet høy overflod
av EML4-ALK
positive celler i tumor vev. Alle disse 8 pasientene var IHC 3+, og FISH (+), bortsett fra en mislykket i FISH studien. For de 5 pasienter med svak intensitet av RT-PCR-produktene, som foreslo lav overflod av
EML4-ALK
positive celler i tumor vev, alle av dem var FISH (-) og bare én var IHC 3+. Sistnevnte var en svulst tilhørte Variant 3a + 3b. Representative saker ble vist i Figur S3. Sammenlignet med de variant typedata, høy overflod av
EML4-ALK
positive celler i tumor vev var mer vanlig i Variant 3a + 3b (4/5, 80%) enn Variant 1 (1/3, 33,3 %) (tabell S3).
Meta-analyse av etnisitet og variant typer assosiert med
EML4-ALK
fusjonsgenet
Meta-analyse av atten studier (inkludert studien) som hadde utført RT-PCR undersøkelse for påvisning av
EML4 Anmeldelser –
ALK
fusjonsgenet ble utført og vist i tabell S4 og tabell S5 [8,15,16,18- 28,40,41,43]. Blant de 2273 NSCLC pasienter med tilgjengelige etnisitet og variant typen data for
EML4 Anmeldelser –
ALK
fusjonsgenet, Variant 3 (23/44, 52,3%) var den vanligste typen i kinesiske befolkningen, mens Variant 1 (28/37, 75,7%) var mest vanlig hos kaukasiske. Differansen var statistisk signifikant for både Variant 1 (p = 0,0000) og Variant 3 (p = 0,0020). Med hensyn til japanske pasienter, Variant 1 (11/33, 33%) var også de vanligste variantene, men det var ikke så dominerende som i kaukasisk.
Diskusjoner
I denne studien, forekomsten av
ALK
rearrangementer i NSCLC i Taiwan var ganske lav (4,17%) i henhold til RT-PCR-resultater. For
EGFR
-wild typen, ikke-SCC pasienter, var det 12% (12/100).
ALK
omorganisering ble bare signifikant assosiert med kvinnelig kjønn og ikke-røykere av multivariate analyser. Ovennevnte Resultatene var ganske lik tidligere publiserte rapporter fra asiatiske eller vestlige land. Vi fant ut at scenen distribusjon i NSCLC pasienter med
ALK
rearrangements var alle svært like, dvs. største tallet i stadium I og ingen eller svært få i stadium IV, mellom vår studie og 4 publiserte rapporter [21,24, 25,27], grunnen til at det ikke var signifikant assosiert med svulsten scenen var at pasienter uten
ALK
rearrangements hadde også høyest pasientnummer i stadium i og lavest i stadium IV i alle disse 5 studier (bare 2 til 14 pasienter i stadium IV). Denne ujevne fordeling fasen var sannsynligvis på grunn av tilgjengeligheten av ferske frosne vev for RT-PCR, som var lettere tilgjengelig i opererbare pasienter (fase I til III), og vanskelig for stadium IV pasient. Interessant forekomsten av
ALK
rearrangements i stadium III pasienter var høyere enn de andre stadier i vår studie og tre av de ovennevnte 4 rapporter [21,24,27]. Det ville kreve et stort antall tilfeller for å bestemme om forekomsten av
ALK
rearrangementer vil øke med tumorstadium, siden forekomsten av
ALK
rearrangementer var ganske lav.
Et viktig mål med denne studien var å sammenligne sensitivitet og spesifisitet blant de tre deteksjonsmetoder (IHC, FISH, og RT-PCR). Det viste at fisken hadde en lav følsomhet (58,33%), men med svært god spesifisitet (99,32%). I kontrast, IHC flekken syntes å ha bedre følsomhet (91,67%) enn fisk, men spesifisiteten (79,52%) var mye lavere, da avskåret var IHC2 +. For å forstå om de antistoffer som brukes vil påvirke IHC resultater eller ikke, har vi utført IHC flekker på alle RT-PCR (+) svulster med flere ALK antistoffer fra ulike selskaper, som inkluderte 5a4 (Histofine, Nichirei), 5a4 (Abcam), 5a4 (Novocastra), og D5F3 (Cell Signaling), for å sammenligne deres sensitivitet og spesifisitet. Alle de ovennevnte ALK antistoffer er blitt anvendt i publiserte rapporter [15,25,35,36,38-40]. Det viste seg at når tumorene hadde høy ALK uttrykket (IHC 3+) av anti-ALK-antistoff vi brukte (ZAL4), vil de også være positiv med høy intensitet ved alle andre anti-ALK-antistoffer (data ikke vist). I motsetning til dette, hvis tumorene hadde bare moderat ALK uttrykket (IHC 2+) ved ZAL4, ville disse tumorene være fullstendig negative for ALK av de andre anti-ALK-antistoffer. Som vist i tabell S3, fire RT-PCR (+) eller fisk (+) svulster i denne studien var IHC 2+. Dermed ZAL4 syntes å ha høyere sensitivitet for å påvise ALK uttrykk enn andre anti-ALK antistoffer, men med lavere spesifisitet.
Vi har undersøkt alle de gel elektroforese bilder av RT-PCR (+) svulster å sjekke om det kunne være korrelert med ALK protein uttrykk nivå i IHC flekken. Til vår overraskelse, RT-PCR-resultater hadde god korrelasjon, ikke bare med ALK proteinekspresjon, men også fisk data. Alle de 8 tumorer med sterk intensitet av PCR-produktene (som antyder høy overflod av
EML4-ALK
positive celler i tumorvev) hadde også høy ekspresjon av ALK protein av IHC flekker og alle positive for FISH-testene, med unntak en mislykket i fisk (tabell S3). Denne korrelasjonen er aldri blitt rapportert tidligere. Siden vi bare undersøkt 100 kreftceller i FISH test for hver svulst, det var rimelig at høy overflod av
EML4-ALK
positive celler i tumor vev ville ha større sjanse til å være positivt for fisk. Siden fisken er blitt godkjent som en pålitelig diagnostisk test for crizotinib (ALK-hemmer) behandling [32], kan våre funn tyder på at høy overflod av
EML4-ALK
positive celler i tumorvev kan også være relatert til behandling respons på ALK-hemmere.
Det var også interessant å finne at høy overflod av
EML4-ALK
positive celler i tumor vev var mer vanlig i Variant 3a + 3b (4/5, 80% ) enn Variant 1 (1/3, 33,3%). Høy ALK protein uttrykket (IHC3 +) var også mer vanlig i Variant 3a + 3b (5/5, 100%) enn Variant 1 (1/3, 33,33%). Dette var i likhet med rapporten fra Wallander, et al. De fant at det var 100% samstemmighet for påvisning av
EML4-ALK
variant 3a + 3b ved alle 3 deteksjonsmetoder (RT-PCR, fisk og IHC), men ikke for variant 1 i en studie med 46 kaukasiske pasienter [41]. Siden den vanligste varianten av kaukasisk NSCLC var Variant 1, kan det være en grunn til at IHC metoder ble funnet å være ikke-sensitive i rapportene fra noen av de vestlige studierapporter [25,40,41], men hadde god korrelasjon med FISH i studien rapporterer fra asiatiske land [35,36,38]. Nylig
EML4-ALK
varianter ble også funnet å ha forskjellig følsomhet for ALK inhibitor av in vitro-studie. Variant 1 var den mest følsomme for ALK-hemmer, etterfulgt av Variant 2 og Variant 3b (like bokstaver), og den siste var variant 3a [44]. Det ville være interessant å sjekke om de variant typer av
EML4-ALK Hotell og pasientenes etnisitet kan påvirke den terapeutiske responsen på ALK-hemmer eller ikke.
Et annet funn verdig for diskusjon var de to pasienter med EGFR mutasjoner og høy uttrykk for ALK protein (IHC3 +), men negativ i RT-PCR studie. En av dem var FISH (-) og en annen mislyktes i fisk. Siden sameksistens av
ALK Hotell og
EGFR
mutasjonene var svært sjeldent, en annen mulig forklaring på denne foreningen er at den høye uttrykk for ALK kan bli indusert av
EGFR
mutasjoner gjennom samspillet mellom disse to kinase proteiner. Samtidig aktivering av ALK og EGFR signalveier har blitt rapportert i lungekreftcellelinjer, og disse cellelinjene kan bare bli undertrykt av dual hemming av både ALK og EGFR [21,45].
I sammendraget, blant de tre deteksjonsmetoder for ALK rearrangements, kan RT-PCR oppdage ikke bare tilstedeværelsen av
EML4-ALK
fusjonsgenet og variant typer, men også overflod av
EML4-ALK
positive celler hos NSCLC tumorvev. De to sistnevnte faktorer kan påvirke behandlingen respons til anti-ALK-inhibitor. Inkludert RT-PCR som en diagnostisk test for ALK-hemmer behandling i prospektive kliniske studier anbefales.
Materiale og metode
Pasient og vev
Fersk frosne vevsprøver av 328 NSCLC pasienter (274 pasienter fra mai 2002 til april 2006 og 54 pasienter fra oktober 2009 til mai 2012) som fikk kirurgisk reseksjon ved Chang Gung Memorial Hospital og med signert informert samtykke ble innhentet fra vevet bank av Chang Gung Memorial Hospital for RNA-ekstraksjon og molekylær biomarkør studier. Ingen av pasientene har fått ALK inhibitor behandling før. Frosne snitt ble utført på hver ferskt frosset lunge cancer vev for bestemmelse av tumor% av en patolog (SFH) før studien. Bare pasienter med en svulst% høyere enn 70% ble inkludert for denne studien. Noen tumorvev med lav svulst% og rikelig fibrøs stroma ble microdissected manuelt i henhold mikroskop for å oppnå høyere svulst%. Alle pasienter inkludert også ha tilgjengelige parafinsnitt i lunge svulst for ALK IHC flekken og FISH studien. Til slutt, totalt 312 pasienter hadde tilstrekkelig prøver å komme inn i denne studien. Den kliniske data og røyking historie ble hentet fra medisinske poster. Ingen av pasientene har fått crizotinib behandling før. Denne studien protokollen hadde blitt gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital og National Health Research Institutes. Blant de 312 pasientene, har ALK omorganisering og IHC studere resultatene av 64 pasienter blitt publisert tidligere [42].
RNA ekstraksjon og komplementær DNA-syntese
Fersk frosne tumorvev ble brukt som utgangsmaterialer for total RNA ekstraksjon ved Trizol metode (Invitrogen, Carlsbad, California.). RNA kvalitet ble bekreftet ved gelelektroforese. To mikrogram av total RNA ble benyttet som startet materiale for komplementært DNA (cDNA) syntese ved å anvendes sammen med Superscript III revers transkriptase (200U /ul, Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Etter revers transkripsjon reaksjonen var ferdig, ble et totalvolum på 40 ul cDNA erholdt. Ett ul resulterende cDNA ble anvendt for ytterligere PCR-reaksjoner.
Polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) for deteksjon av forskjellig ALK omleiring med forskjellige partnere
EML4-ALK
fusjon -genet.
RT-PCR kombinert med Sanger-sekvensering av PCR-produktene ble utført. To primersett (vist i tabell S6) ble utformet i henhold til de publiserte rapporter for å identifisere
EML4-ALK
Variant 1 og Variant Non-1, henholdsvis [8,26,46]. Sistnevnte kunne oppdage
EML4-ALK
Variant 2 til 7. De termiske syklus forholdene var annerledes for Variant 1 og Variant Non-en. For
EML4-ALK
Variant 1, de termiske syklusbetingelser var preinkubering i 4 minutter ved 95 ° C for innledende aktivering, etterfulgt av 35 sykluser med denaturering i 30 sekunder ved 95 ° C, primersammensmeltning i 30 sekunder ved 55 ° C, og forlengelse i 2 minutter og 30 sekunder ved 72 ° C. for
EML4-ALK
Variant Ikke-en, den termiske syklusen var: 15 minutter ved 95 ° C, etterfulgt av 35 sykluser med denaturering i 30 sekunder ved 95 ° C, primersammensmeltning i 30 sekunder ved 66 ° C, og forlengelse i 1 minutt ved 72 ° C. Beregnet PCR-produkt størrelse (basepar) av hver variant ble oppført som følger: variant 1 (247 bp) , variant 2 (2303 bp), variant 3a (728 bp), variant 3b (761 bp), variant 4 (1664 bp), variant 5a (269 bp), variant 5b (386 bp), variant 6 (1619 bp) og variant 7 (1688 bp).
KIF5B-ALK
,
KLC1-ALK Hotell og
TFG-ALK
fusjonsgener.
Den mulige eksistensen av
KIF5B-ALK
,
KLC1-ALK Hotell og
TFG-ALK
, ble også undersøkt i alle pasientenes svulster som var negative for
EML4-ALK
fusjonsgenet. De primersett (vist i tabell S6) og PCR tilstand ble utformet i henhold til de tidligere publiserte rapporter [15-18]. De termiske syklusforhold for
KIF5B-ALK
var 95 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 30 sek ved 95 ° C, 30 sekunder ved 50 ° C, og 2 minutter og 30 sekunder ved 72 ° C for 40 sykluser. For
KLC1-ALK
, var 95 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 30 sek ved 95 ° C, 30 sekunder ved 55 ° C og 3 minutter ved 72 ° C. For
TFG-ALK
, var den 4 minutter ved 94 ° C, etterfulgt av 40 sykluser på 45 sekunder ved 94 ° C, 45 sekunder ved 65 ° C, og 1 minutt og 30 sekunder ved 72 ° C
etter at PCR-reaksjonen var ferdig, ble total PCR-produkt (20 ul) i hvert tilfelle anvendt for DNA-gelelektroforese. Dersom noe PCR-produkt med forventet størrelse ble oppnådd, ble nukleotidsekvensering (Applied Biosystems PRISMR 3730 DNA Analyzer Sequencer) utføres. Nukleotidsekvensene ble oppnådd ble verifisert ved BLAST-programmet ved NCBI. Alle positive resultater ble gjentatt av en annen tekniker for bekreftelse.
ALK
omorganisering bestemt av pause fra hverandre FISH studie
FISH deteksjon ble gjort på unstained 5-mikrometer tykk parafininnstøpte formalin-fikserte vevssnitt. I henhold til hematoxylin og eosin flekk av det samme vev blokken, ble tumordelen på hvert objektglass valgt og omringet av en patolog (SFH) forut for FISH studien.
ALK
sonde som ble brukt var Vysis ALK Break Apart FISH Probe (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL, USA). De deparaffinized vevssnitt ble først forbehandlet med 100 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7,0 oppløsning i 92 ° C i 15 minutter, etterfulgt av fosfat-bufret saltløsning (PBS) vaske, deretter spaltet med 300 ul Digest-all (Zymed, Inc., South San Francisco, CA) ved 37 ° C i 90 til 120 minutter, avhengig av størrelsen av vevssnittene. Fordøyelsen ble stoppet med 10% nøytralt formalin ved romtemperatur i 1 minutt og ble vasket med PBS igjen. Ti pl av
ALK
probe ble påført hver dehydrert og lufttørket lysbilde, og denaturert ved 94 ° C i 4 minutter, deretter hybridisert over natten ved 37 ° C i VYSIS HYBrite (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL, USA). Post-hybridisering vask ble utført med 2 x standard saltløsning citrat ved 72 ° C i 5 minutter og deretter skylt i PBS med 0,25% Tween 20 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Preparatglassene ble deretter montert med 10 ul av Vectashield monteringsmedium (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) med 0,1 ug /ml av 4 «, 6-diamidino-2- fenylindol. De FISH Resultatene fra studien ble vurdert med Leica DMR fluorescens mikroskop (Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Tyskland). De FISH signalene blir først vurdert av to erfarne teknikere uavhengig (THW, YTC) og kontrolleres på nytt av en patolog (SFH) for de fisk positive svulster. Minst 100 ikke-overlappende og intakte kreft kjerner ble evaluert. Svulstcellene ble ansett for å være positive for FISH studiet i henhold til produsentens retningslinjer, dvs. når de røde og grønne signalene var langt fra hverandre i mer enn 2 kjerner eller hadde tap av paret grønt signal (individuell rødt signal, IRS). Bare svulster med mer enn 15% av tumorceller med positive break-apart FISH signalene ble ansett for å ha
ALK
rearrangements.
