Abstract
kromosom 8q24 er den mest forsterket regionen på tvers av flere krefttyper, og den typiske lengden forsterkning tyder på at det kan målrette flere gener til
MYC
. For å utforske rollene til de genene oftest inkludert i 8q24 presiseringer, analyserte vi forholdet mellom kopitall endringer og genekspresjon i tre sett av livmorkreft (N = 252); og i glioblastom, eggstokkene, og brystkreft profilert av TCGA. Blant de genene nabo
MYC
, uttrykk for bromodomain inneholder genet
ATAD2
ble den mest forbundet med forsterkning. Bromodomain holdige gener har vært innblandet som formidlere av MYC transkripsjonen funksjon, og faktisk
ATAD2
uttrykk ble tettere knyttet til uttrykket av gener som er kjent for å være oppregulert ved MYC enn var
MYC
selv. Utdypninger av 8q24, uttrykket av gener nedstrøms fra MYC og overekspresjon av
ATAD2
spådd dårlig resultat og økt fra grunnskole til metastatiske lesjoner. Knockdown av
ATAD2 Hotell og
MYC
i sju livmor og 21 brystkreftcellelinjer vist at cellelinjer som var avhengig av MYC også avhang ATAD2. De samme cellelinjer var også den mest følsom for histon-deacetylase (HDAC) inhibitor Trichostatin-A, i overensstemmelse med tidligere studier som identifiserer bromodomain-inneholdende proteiner som mål for hemmingen av HDAC-inhibitorer. Våre data indikerer høy ATAD2 uttrykk er en markør for aggressiv livmorkreft, og foreslå konkrete hemmere av ATAD2 kan ha terapeutisk nytte i disse og andre MYC avhengig kreft
Citation. Raeder MB, Birkeland E, Trovik J, Krakstad C, Shehata S, Schumacher S, et al. (2013) Integrert Genomisk Analyse av 8q24 Amplification i livmorkreft Identifiserer
ATAD2
som Essential til
MYC-
Dependent Kreft. PLoS ONE 8 (2): e54873. doi: 10,1371 /journal.pone.0054873
Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina
mottatt: 28 september 2012; Akseptert: 17. desember 2012; Publisert: 05.02.2013
Copyright: © 2013 Raeder et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte : Helse Vest Grants 990172 (MBR), 911 351, 911 624 og 911 626 (HBS); Universitetet i Bergen; Den Norske Kreftforening; Forskningsrådet midlene 205404 og 193373 (HBS); National Cancer Institute (K08CA122833 og U54CA143798); og en V Foundation Scholarship (RB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Livmorkreft kreft~~POS=HEADCOMP er den vanligste bekken gynekologisk kreft, med en levetid risiko blant kvinner i 2-3% [1]. Omtrent 75% av svulstene er begrenset til livmoren ved diagnose og resected. Imidlertid, 15% -20% av disse svulstene tilbakefall. Disse svulster, og svulster som er metastatisk til presentasjonen, reagerer dårlig på kjemoterapi eller stråling og er generelt fatal [1], [2].
Det er et behov for nye markører for å identifisere pasienter med høy risiko for tilbakefall og for å utvikle nye behandlingsformer for pasienter med metastatisk sykdom [3], [4]. Dessverre er forskning mot disse målene tungt underrepresentert i livmorkreft sammenlignet med andre kreftformer som brystkreft og eggstokkreft. En tilnærming er å identifisere gener som, når de forandres ved somatiske genetiske hendelser, driver tumorprogresjon. Disse endringene kan da fungere som markører for aggressiv kreft og gener kan tjene som potensielle terapeutiske mål.
Den vanligste fokale forsterkning i livmorkreft er på 8q24 [5]. Faktisk er 8q24 den mest forsterkede område på tvers av flere cancertyper [6], og denne forsterkning er en negativ prognostisk markør i flere krefttyper [7]. Selv
MYC
er et sannsynlig mål [6], virkningene av denne forsterkning i endometrial cancer har aldri blitt dissekert. Det er faktisk mulig at den er rettet mot multiple gener, som har blitt vist for presiseringer andre steder i kreft-genomet [8]. For eksempel, en nabo genet,
ATAD2
, har vist seg å være en co-regulator av
MYC Hotell og overekspresjon av
ATAD2
har vært assosiert med dårlig prognose i bryst , lunge og prostata kreft [9], [10], [11].
Vi utforsker rolle 8q24 forsterkning i livmorkreft gjennom integrerende genomiske analyser av primære og metastatiske livmorkreft med omfattende kliniske data, og identifisere
ATAD2
som en ekstra målet for 8q24 forsterkning i disse kreftformene. Vi identifiserer kopiantall gevinst på
ATAD2
som en regulator av
ATAD2
uttrykk, presentere de første dataene knytte
ATAD2
overekspresjon til
MYC
aktivering, og gi funksjonelle data tyder ATAD2 som et terapeutisk mål i mYC avhengige kreftformer.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
samlingen av endometrial carcinoma primærvalg og metastaser for denne studien var godkjent av norske Datatilsynet (961478-2), norsk samfunnsvitenskapelig datatjeneste (15501) og «regionale forskningsetiske.
Komiteen i medisin, Vest-Norge» (referanse 052,01). Alle deltakerne ga skriftlig informert samtykke.
Pasient Series
endometriet primærvalg og metastaser ble samlet fra pasienter behandlet ved Haukeland Universitetssykehus, Norge som tidligere beskrevet [5]. Svulster som samles for den primære etterforskning og qPCR validering serien ble frosset umiddelbart etter reseksjon; svulster samlet inn for FISH ble formalinfiksert og parafininnebygd. Pasientene ble fulgt fra primærkirurgi til oktober 2010 eller død. De kopinummer profiler av primær etterforskningen serien, og uttrykket profiler (Agilent 21 k og 22 k oligoarrays) fra en undergruppe av 57 svulster, ble publisert tidligere [5].
RNA analyse
RNA ble ekstrahert og hybridisert til Agilent 44k arrays (Art.nr. G4112F) i henhold til produsentens instruksjoner og som tidligere beskrevet [5]. Signal intensiteter ble evaluert ved hjelp av BRB-ArrayTools (National Cancer Institute, USA). Arrays var batch median normalisert.
Sanntids Kvantitativ PCR
cDNA ble syntetisert fra en mikrogram RNA ved hjelp av høy kapasitet RNA til cDNA kits (Applied Biosystems). Uttrykk for
ATAD2 Hotell og
MYC
ble bestemt ved bruk av henholdsvis TaqMan genekspresjon analyser Hs00204205 og Hs00905030 (Applied Biosystems) og alle prøvene ble kjørt på microfluidic kort per produsentens instructuions, bruker GAPDH-Hs99999905_m1 som endogent kontroll. Prøvene ble kjørt i tre eksemplarer og analysert i RQ manager (Applied Biosystems).
FISH
microarray (TMA) som representerer den høyeste grad av områder i hver tumor ble fremstilt som tidligere rapportert [12] og behandlet ved 56C ° natten før hybridisering. Fisken ble gjort ved hjelp av MYC Spectrum Orange FISH sonde kit og Kromosom opplisting probe 8 (CEP8) (Vysis) i henhold til produsentens instruksjoner, som tidligere rapportert [13]. Telling ble utført i områder med optimal vev fordøyelse og ingen overlappende kjerner. Sondestyringssignaler og ble tellet i 40-60 celler innenfor områdene optimal vev fordøyelse og ingen overlappende kjerner. Presiseringer ble scoret da MYC /CEP8 forholdet var . 1.0
TCGA Validering Datasett
Vi får tilgang på nivå 3 data fra TCGA data portal i november og desember 2010. For brystkreft vi innhentet genuttrykk data for 279 svulster og 24 friske kontrollpersoner (Agilent 244K uttrykk arrays), og kopi-nummer fra 176 tumorer (Affymetrix SNP 6,0 arrays). For eggstokkreft vi fått genekspresjon (Agilent 244K uttrykk arrays) og kopitall (Agilent 1M arrays) data fra 514 og 489 svulster, henholdsvis. For glioblastom vi fått genuttrykk data fra 385 svulster og 10 friske kontrollpersoner (Affymetrix U133A arrays) og kopiere-talldata fra 261 tumorer (Agilent 244K arrays).
celleviabilitet
lentiviral vektorer koding shRNAs spesifikk for
ATAD2
,
MYC
, og kontrollene
GFP
,
LACZ1
, og
LACZ2 product: (Tabell S1) ble hentet fra The RNAi Consortium. Lentivirus ble produsert av transfeksjon av 293T celler med vektorer som koder for hver shRNA (5 mikrogram) med emballasje plasmider som koder PSPAX2 og PDM2.G hjelp Fugene HD (Roche). Lentivirus-inneholdende supernatant ble samlet 48 og 72 timer etter transfeksjon, slått sammen og lagret ved -80 ° C. Celler ble infisert i polybren-inneholdende medium, sentrifugert ved 1000 g i 30 min, og velges i puromycin (2,5 ug ml
-1) som starter 24 timer etter infeksjon.
kreftcellelinjer ble oppnådd fra ATCC , DSMZ, ECACC og HSRRB, og vokst i henhold til leverandørens anvisninger (tabell S2). Cellelevedyktigheten etter RNAi ble målt i 96-brønners plater. Åtte brønner sådd med celler ble infisert bruker 1:30 fortynninger av virus som inneholder hver shRNA. Halvparten av brønnene gikk puromycin utvalg, og celle levedyktighet ble målt ved hjelp av Cell-Titer Glo (Promega) en uke senere. Verdiene fra hver fire eksemplarer ble gjennomsnitt; «Uteligger» brønner ble ekskludert dersom replikere brønnene hadde SD /midlere 0,2 og eksklusive vel mindre avvik. De gjennomsnittlige ATAD2- og MYC- hårnål verdier ble normalisert til gjennomsnittsverdiene fra GFP kontroll.
For å bestemme Trichostatin-A følsomhet, Trichostatin-A (Sigma) (0,040 til 10 mm) og kjøretøy (DMSO) kontroll ble hver tilsatt til tre brønner inneholdende hver cellelinje på 96-brønners plater. Celleviabilitet ble bestemt etter 72 timer ved hjelp av Cell-Titer Glo (Promega).
Immunoblotting
Celler ble vasket med PBS, høstet, lysert ved hjelp RIPA lysebuffer med protease og fosfatase-hemmere, og sentrifugeres ved 16.000 x g. Supernatanten ble blandet med 4 X SDS prøvebuffer, kokt i 7 minutter, og underkastet SDS-PAGE på 4-12% gradient-geler. Blotter ble analysert med antistoffer mot ATAD2 (HPA029424, Sigma), MYC (sc-764, Santa Cruz) og aktin (sc-1615, Santa Cruz).
statistikker
Molekylære data var relatert til klinisk fenotype ved hjelp av Pearsons χ
2 eller tosidige Student t test som passer. Vi brukte multivariat lineær regresjonsanalyse for prediksjon av
ATAD2
uttrykk nivåer. Univariate og multivariate overlevelsesanalyser ble utført av log rang og Mantel-Cox metoder, henholdsvis. «MYC signaliserer styrke» og genuttrykk nivåer ble presentert som Z-score.
Resultater
Vurdering av
MYC
som et mål av 8q24 Amplification
Omfattende biologiske data støtte
MYC
som et onkogen [14], og 8q24, husing
MYC
, er den vanligste forsterket regionen på tvers av flere krefttyper [6]. Men betydningen av MYC aktivering i livmorkreft er egentlig ukjent.
Vi utførte en integrert analyse av kopitall og uttrykk data til å lete etter bevis for at
MYC
er et mål for 8q24 forsterkning i livmorkreft. Vi evaluerte uttrykk data fra en serie av 82 livmorkreft oppnådd i et enkelt fylke i Norge, med tilsvarende genomkopitalldata fra 70 svulster ( «primary etterforskningen serien»). Seksten av disse tumorer (23%) hadde 8q24 forsterkning. De fleste av disse amplifikasjonene var lav-nivå, som strekker seg opp til et kopitall på 4,7. Vi validert våre resultater i ytterligere fire datasett. To av disse representerer prøver med genome-wide uttrykk profilering: en «intern validering serien» som vi genererte data fra 40 grunnskoler og 19 metastatisk livmorkreft rekruttert fra samme region i Norge, og en «ekstern validering serien» representerer tidligere utgitt uttrykk profiler fra 111 tumorer [5]. De andre to validerings sett representerer analyserte prøvene med fokuserte analyser: en «qPCR serien» av 162 prøver og en «FISH-serien» av 399 prøver. Pasientkarakteristika og histopatologiske variabler for alle våre interne datasett er vist i tabell S3.
Vi fant at begge
MYC Hotell og gener oppregulert ved MYC ble overuttrykt i livmorkreft med 8q24 forsterkning i forhold til livmor kreft uten den (p = 0,047 og p = 0,0078, henholdsvis) (figur 1A-B). Vi brukte en tidligere publisert liste over 68 gener funnet å være oppregulert ved MYC over flere sammenhenger og analyser (Tabell S4, www.myccancergene.org) [15] og scoret sitt overekspresjon ( «MYC signaliserer styrke») ved hjelp GSEA [16]. Vi har også testet fem ekstra MYC aktiverings underskrifter fra «Gene Sett Enrichment Database», som reflekterer aktivering av MYC i ulike sammenhenger. Fire av disse ble uttrykt på et høyere nivå i livmorkreft med 8q24 forsterkning (figur S1 A).
(a)
MYC
uttrykk og (b) MYC signale er både økt blant livmorkreft med 8q24 forsterkning. (C) Variasjoner i
MYC
uttrykk bare forklare en liten andel av variasjonen i MYC-signalering. Lineære anfall er vist i rødt, gult og grønt for primær etterforskning serien, intern validering serien, og ekstern validering serien, henholdsvis. (D) De lengder av amplifikasjonene som inneholder
myc
er betydelig større enn forventet i forhold til amplifikasjoner observert et annet sted i disse kreftformene. (E) Blant 26 gener i 8q24 topp med tilsvarende uttrykk data, uttrykk for
ATAD2
er sterkest og signifikant assosiert med forsterkning. Blå linjer viser prosent økning i genuttrykk og røde søylene viser p-verdiene. Betydningen Terskelen er Bonferroni-korrigert for flere hypoteser. (F) Uttrykk for
ATAD2
er sterkt korrelert med MYC signaliserer styrke. Lineære passer vises som i panelet c.
Men variasjoner i
MYC
uttrykk i seg selv bare forklart en liten andel av variasjoner i MYC signaliserer styrke (R2 = 0,11, p = 0,002 ) (figur S1b). Vi har fått tilsvarende svake resultater i de interne og eksterne validerings datasett (R2 = 0,00, p = 0,34 og R2 = 0,06, p = 0,012, henholdsvis; Figur S1b). På tvers av alle tre datasett, variasjoner i MYC uttrykk bare står for 5% av variasjonene i MYC signaliserer styrke (R2 = 0,05, Figur 1c).
Videre 8q24 presiseringer er lengre enn den typiske fordelingen av forsterkerstørrelser i livmor kreft (p = 0,0021) (figur 1c), og vanligvis innebære flere gener. Vi har derfor en hypotese om at 8q24 presiseringer kan målrette flere gener, noen som kan fungere gjennom å øke MYC signalering. For å identifisere disse, evaluert vi alle 26 gener i toppen regionen forsterkning på 8q24 som vi hadde uttrykk data, for å identifisere gener som uttrykk korrelert sterkest med forsterkning.
Uttrykk for
ATAD2
korrelerer sterkt med 8q24 Amplification og MYC signale
uttrykk for
ATAD2
var sterkere assosiert med forsterkning av 8q24 enn var uttrykk for noe annet gen i toppen regionen av forsterkning (p-verdi = 2.77E-06) (figur 1d). Fire andre gener,
NDUFB9
,
DERL1
,
FAM91A1
, og
WDR67, etter ble signifikant oppregulert ved 8q24 forsterkning, men mindre sterkt enn
ATAD2
uttrykk for
ATAD2
også korrelert med MYC signaliserer styrke sterkere enn gjorde uttrykk for noe annet gen i 8q24 peak region (R2 = 0,48, p. 0,001; Figur 1e, Figur S1b). Faktisk sammenhengen mellom
ATAD2
uttrykk og MYC signaliserer styrke ble observert selv blant prøvene uten 8q24 forsterkning (R2 = 0,48, p 0,001). Korrelasjonen mellom
ATAD2
uttrykk og MYC signaliserer styrke var mer enn dobbelt så sterk som den nest mest signifikant assosiert genet (
NDUFB9
) og sterkere enn for
MYC
selv ( R2 = 0,05, figur 1c).
ATAD2
er ikke en av de 68 genene i MYC aktivering signatur, og så vidt vi vet
MYC
har ikke funnet å modulere uttrykk for
ATAD2 product: [15]. Imidlertid ATAD2 ble tidligere funnet å binde til MYC og til E-box region av flere myc målgener, og ATAD2-nivåer ble funnet å være begrensende for MYC-avhengig transkripsjon [9].
Både genom-wide validering serien også utstilt sammenhengen mellom MYC signalering og
ATAD2
uttrykk (R2 = 0,54, p 0,001 og R2 = 0,45, p 0,001 i intern og ekstern validering serien, henholdsvis) og den relative mangelen på korrelasjon med
MYC
uttrykk (R2 = 0,00, p = 0,33 og R2 = 0,06, p = 0,012, figurer 1f og S1b). Uttrykk for
ATAD2
også korrelert med fire av de fem nye signaturer av MYC aktivisering, og korrelert sterkere med disse signaturene enn gjorde uttrykk for
MYC
selv (tabell 1). Den siste signatur viste ingen sammenheng med
ATAD2
eller
MYC
uttrykk.
Forsterkning av 8q24 og Expression av
ATAD2
, men ikke MYC , er assosiert med sykdomsprogresjon
Blant de 70 livmorkreft som vi hadde på genom SNP array-data, 8q24 forsterkning ble assosiert med redusert progresjonsfri overlevelse (p = 0,024) og økt risiko for sykdomsspesifikke død (p = 0,043). Forsterkning av 8q24 var mest vanlig i ikke-endometrioid (p = 2.98E-05) og høy grad av svulster (p = 2.90E-08) (tabell S5), har også assosiert med aggressiv kreft [17].
Vi bekreftet 8q24 forsterkning er assosiert med dårlig prognose ved hjelp av FISH i en uavhengig serie av 399 livmorkreft. Tjue kreft (5%) viste økt 8q24 kopi-tall i forhold til kromosom 8 cent (figur 2a). Disse ble assosiert med 64% 5-års overlevelse, vs. 85% for kreft uten 8q24 forsterkning (p 0,001) (figur 2b). Et lignende mønster ble sett for tilbakefall overlevelse (p = 0,001). Forsterkning av 8q24 var også assosiert med høy FIGO stadium (p = 0,003), ikke-endometrioid histologisk subtype (p 0,001), og høy klasse (p 0,001). (Tabell S5)
FISH prober mot 8q24 (rød) og kromosom 8 cent (grønn) i en primærtumor og sammenkoblede metastase showet forsterkning bare i sistnevnte (a) (b) Blant 399 pasienter vurdert av FISH, de med 8q24 presiseringer har dårligere utfall. I den primære undersøkelsen serie, tumorer blant de høyeste kvartil av (c)
ATAD2
uttrykk og (d) MYC aliserte styrke også hadde økt risiko for sykdomsspesifikk død. (E) Østrogen reseptor negative (ER-) svulster med
ATAD2
uttrykk i øvre kvartil var også forbundet med høy risiko for sykdomsspesifikke død; risikoen var mye lavere blant østrogenreseptorpositiv (ER +) svulster med
ATAD2
uttrykk i bunn kvartil. (F)
ATAD2
uttrykk og (g) MYC signale er både høyere blant metastaser enn primære svulster i indre validering serien.
Høy uttrykk for
ATAD2
og MYC signale var også forbundet med økt risiko for progresjon av kreft (p = 0,003 og p = 0,015, respektivt), cancer-spesifikk død (p = 0,004 og p = 0,001) (figurene 2c-d), og andre dårlig prognose egenskaper .
ATAD2
uttrykk var høyere hos ikke-endometrioid, høyverdig og ER negative tumorer (p henholdsvis 0,001 og p = 0,02, 0,001, p høy MYC signale var assosiert med dårlig differensiert (p = 0,0016) og ikke-endometrioid (p 0,001) cancere. Uttrykk for
ATAD2
ble også negativt forbundet med uttrykk av
ESR1 plakater (R2 = 0,10, p = 0,005). Tilsvarende har tidligere studier har funnet at
ATAD2
uttrykk er høyere i trippel negative brystkreftsvulster [18] og er nedregulert av østrogen i cellekultur [19].
Ja,
ATAD2
uttrykk var en uavhengig prediktor for sykdomsspesifikke død (HR = 1,83, p = 0,027) og sykdomsutvikling (HR = 1,62, p = 0,011) etter justering for ER status. ER-negative tumorer med øvre kvartil
ATAD2
uttrykk var spesielt dødelig. (HR = 4,1, p = 0,002; figur 2e)
Vi har bekreftet disse resultatene ved å vurdere
ATAD2
uttrykk ved kvantitativ PCR og ER status ved immunhistokjemi i vår qPCR validering serie 162 flere svulster. Blant disse, ER-negative tumorer med øvre kvartil
ATAD2
uttrykk var assosiert med enda verre utfall enn i primærvaksinasjon (HR = 6,8, p 0,001) (figur S1c). Høy
ATAD2
uttrykk forble også forbundet med økt risiko for sykdomsspesifikke død (p = 0,0043) og kortere progresjonsfri overlevelse (p = 0,016). Korrigert for ER status,
ATAD2
uttrykk fortsatte å forutsi sykdomsspesifikke død (HR = 1,86, p = 0,018), men bare tendert mot en sammenheng med sykdomsprogresjon (HR = 1,31, p = 0,11). Uttrykk for
ATAD2
var også høyere i høy grad (p 0,001)., Ikke-endometrioid (p = 0,005), og ER-negative tumorer (p = 0,02) (Tabell S6)
i motsetning til
MYC
uttrykk var ikke assosiert med progresjon eller risiko for sykdomsspesifikke død i enten vår primære etterforskning serie (p = 0,07 og p = 0,68 henholdsvis) eller qPCR validering serie (p = 0,53 og p = 0,28 henholdsvis). Høy uttrykk for
MYC
var assosiert med høy klasse i begge seriene (p 0,001 og p = 0,02, henholdsvis), og med ikke-endometrioid histologi i den primære undersøkelsen serien (p = 0,03) (Tabell S6) .
metastaser også vise mer 8q24 forsterkning,
ATAD2
uttrykk, og
MYC
signaliserer styrke enn primære svulster. I forhold til primærsvulster, metastaser utstilt 2,4 × høyere forekomst av brenn 8q24 forsterkning av fisk (14,3%; p 0,007). Blant de 399 pasientene i FISH-serien, 49 hadde paret primære og metastatiske svulster. Fem av disse prøvene (10%) ikke oppviser 8q24 forsterkning i den primære men kjøpte det i den metastasering. Bare en prøve (2%) oppviste motsatt mønster. For å undersøke
ATAD2
uttrykk og MYC signalering, vi også sammenlignet de 42 primære svulster med de 19 metastaser i vår interne validering serien. Begge
ATAD2
ekspresjon og MYC aliserte styrke var høyere i de metastaser (p = 0,002 og 0,004 henholdsvis figur 2f-g), som blant annet hos 8 pasienter med parede primære tumorer og metastaser (p = 0,01 og 0,05 henholdsvis) .
Utvidelse til andre krefttyper og normalt vev
Vi har også undersøkt om 8q24 forsterkning er assosiert med økt
ATAD2
uttrykk i andre krefttyper. Spesielt har vi brukt data fra 514 eggstokkreft, 279 brystkrefttilfeller og 385 glioblastomas fra Kreft Genome Atlas [20], [21]. Disse inkluderte uttrykk data fra tilstøtende normalt vev for 24 brystkrefttilfeller og 10 glioblastomas. 8q24 amplifikasjoner ble observert i 72% (N = 126) av brystkreft, 74% (N = 364) av ovariekreft, og 10% (N = 27) av glioblastom.
ATAD2
ble co-forsterket til samme nivå som
MYC
i nesten alle svulster (som det var blant våre livmorkreft, Figur S1d-g)
Uttrykk for.
ATAD2
korrelert med 8q24 forsterkning blant alle tre krefttyper (R2 = 0,47, 0,11, og 0,36 for brystkreft, glioblastom, og eggstokkreft henholdsvis; p 0,001 i alle tilfeller; Tabell S7), og var 2,6 × og 2,5 × høyere blant de kreftformer i forhold til normalt vev i brystkreft og glioblastom, henholdsvis (p 0,001 i begge tilfeller).
MYC
uttrykk korrelert mindre sterkt med 8q24 forsterkning i alle tre krefttyper (R2 = 0,12, 0,07, og 0,10 for brystkreft, glioblastom, og eggstokkreft henholdsvis; p 0,001 i alle tilfeller).
MYC
uttrykk i brystkreft var overraskende halvparten av normalt vev (p 0,001); i glioblastom var det høyere med en faktor på 3,5 (p 0,001).
ATAD2
uttrykk også korrelert med MYC signalering i alle tre krefttyper (R2 = 0.11, 0.21, og R2 = 0,31, henholdsvis for brystkreft, glioblastom, og eggstokkreft, p 0,001 i alle tilfeller), og ble mer sterkt korrelert med MYC signaliserer styrke enn
MYC
uttrykk var (R2 = 0,10, p 0,001; R2 = 0,09, p 0,001;., og R2 = 0,02, p = 0,003 i de tre krefttyper)
ATAD2
Expression er korrelert til
E2F
Gene Expression og
ATAD2
Kopier nummer i en additiv Manner
Vi utforsket også de relative bidrag fra E2F, østrogen, og kopiere-nummer på ATAD2 uttrykk.
ATAD2
promoter-regionen inneholder bindingsseter for flere E2F proteiner og tidligere funksjonelle data har vist at E2F øker
ATAD2
uttrykk i cellekultur [9], [22];
ATAD2
har også blitt indusert av østrogen [23]. I våre data, uttrykk for hver
E2F
transkripsjonsfaktor var assosiert med
ATAD2
uttrykk, men bare inkludering av
E2F1
,
E2F2 Hotell og
E2F8
forbedret den generelle form av en modell forutsi
ATAD2
uttrykk fra
ATAD2
kopitall og
ESR1
uttrykk. Uttrykket nivåer av disse tre genene ble sterkt korrelert, og vi fokuserte på
E2F1
.
Vi fant at
ATAD2
kopitall,
ESR1
uttrykk og
E2F1
uttrykk forklarte 77% av variasjonen i
ATAD2
uttrykk i livmorkreft, og hver av de Predictor variablene forble signifikant assosiert med
ATAD2
uttrykk i justert modell (figur 3a og tabell S7). Vi fant også at
ATAD2
kopitall og
E2F
uttrykk uavhengig spådd
ATAD2
uttrykk i brystkreft, eggstokkreft og glioblastom (figur 3b-d og tabell S7) .
ESR1
, som ble mindre sterkt assosiert med
ATAD2
ekspresjon, ble signifikant i den justerte modellen i endometriecancer (p = 0,016) og glioblastom (p 0,001), ikke i ovarial eller brystkreft. Disse data tyder på at kopi antall
ATAD2
er en viktig faktor for
ATAD2
uttrykk selv i sammenheng med andre cellulære reguleringsmekanismer.
(a) Endometriekreft , (b) brystkreft, (c) eggstokk-kreft, og (d) glioblastom. Gule prikker representerer prøvene og den blå platen er spådd 3-D passform. De grønne og røde linjene er avstanden mellom de predikerte passform og den faktiske observasjoner for prøver over og under 3D-fit plate, henholdsvis.
Avhengighet av
MYC
Spår Avhengighet
ATAD2 Hotell og Response to HDAC hemmere i endometrial og brystkreft celler
resultatene ovenfor førte oss til hypoteser som
ATAD2
uttrykk fremmer MYC signalering, og at livmorkreftceller som er avhengig av
mYC
vil også være avhengig av
ATAD2
. Vi målte effekt på levedyktigheten til shRNA knockdowns av
ATAD2 Hotell og
MYC
i syv endometrial kreft cellelinjer. Vi brukte to shRNAs mot hvert gen, velge de som utviste den største reduksjonen av protein uttrykk blant seks og tre shRNAs skjermet mot
ATAD2 Hotell og
MYC
henholdsvis (figur 4a, b).
Vest-blotter for (a) ATAD2 og (b) MYC indikere omfanget av knockdown med seks shRNAs mot
ATAD2 Hotell og tre shRNAs mot MYC, henholdsvis. ATAD2 eksperimenter ble utført i celler KLE og myc-eksperimenter ble utført i TE9 celler infisert med GFP kontroll og myc-vektorer. Senere forsøk brukes
ATAD2
shRNAs en og e, og MYC shRNAs a og b. Reduksjoner i celleviabilitet blant syv endometrial cancer-cellelinjer (c) og 21 brystkreftcellelinjer (d) var sterkt korrelert etter knockdown av ATAD2 eller MYC og etter knockdown av MYC og behandling med HDAC-inhibitoren Trichostatin-A (1,25 uM) ( e-f).
knockdown av enten
ATAD2
eller
MYC
resulterte i sterkt korrelerte nedgang i levedyktighet på tvers av de sju celle endometriekreft linjer (R2 = 0,70 , p = 0,020; figur 4c). I to tilfeller, observerte vi over 75% reduksjon i levedyktighet. Vi fant ingen sammenheng mellom uttrykk for
ATAD2
eller
MYC
eller 8q24 kopiantall og følsomhet for
ATAD2
eller
MYC
knockdown.
Disse resultatene antydet at myc-avhengige krefttyper av andre typer kan også være avhengig av ATAD2. Ingen reduksjon i spredning hadde tidligere blitt sett med
ATAD2
knockdown i TIG3-T eller U2OS celler [9]. Da vi testet et større panel av 21 brystkreftlinjer, men vi bekreftet den sterke sammenhengen mellom redusert levedyktighet etter knockdown av ATAD2 eller MYC (R2 = 0,61, p 0,001; figur 4d).
Foreningen mellom avhengighet av
MYC Hotell og
ATAD2
antyder ATAD2 som et terapeutisk mål i
MYC
-avhengige kreft. Mens
MYC
har lenge vært et kjent onkogen, kliniske tilnærminger til å blokkere MYC signale har ennå ikke vært vellykket. Histon-deacetylase (HDAC) inhibitorer, imidlertid, har vist seg å inhibere indirekte bromodomain-inneholdende proteiner som ATAD2 [24].
Vi brukte tilkoblings Map [25] for å identifisere forbindelser hvis signaturer anticorrelated med MYC signale signatur. Blant de 1309 små molekyler representert ved Connectivity kart, ble signaturen til HDAC hemmer Trichostatin-A mest anticorrelated med MYC signale signatur. (P-verdi 0,00001; Tabell S8). Vi har også generert en signatur av aggressiv sykdom fra den primære undersøkelsen serien, ved hjelp av de 50 mest over- og under-uttrykte gener hos pasienter med metastatisk sykdom sammenlignet med pasienter uten metastatisk sykdom. Vi fant Trichostatin-A signaturen ble også den mest anticorrelated med denne signaturen med aggressiv sykdom, bundet med signaturer av fire andre molekyler (p 0,00001; Tabell S8).
For å funksjonelt bekrefte forholdet mellom Trichostatin-A og MYC avhengighet, testet vi alle endometrial kreft og brystkreft cellelinjer for veksthemming av Trichostatin-A og sammenlignet resultatene til
MYC
knockdown. Trichostatin-A hemmet vekst i de samme cellelinjene som var avhengig av
MYC
både i endometriet (R2 = 0,74, p = 0,013; figur 4e), og i brystcancercellelinjer (R2 = 0,31,
