Abstract
Bakgrunn
BIRC6 er medlem av hemmere av apoptose Protein (IAP) familie som er tenkt for å beskytte en rekke kreftceller fra apoptose. Hovedmålet med denne studien var å undersøke om BIRC6 spiller en rolle i prostatakreft og kan være nyttig som en roman terapeutisk mål.
Metoder
BIRC6 uttrykk i cellelinjer ble vurdert ved hjelp av Western blot analyse og i kliniske prøver ved hjelp immunhistokjemi av vev mikromatriser. Den biologiske betydningen av BIRC6 ble bestemt av siRNA-indusert reduksjon av
BIRC6
uttrykk i LNCaP celler etterfulgt av funksjonelle analyser.
Resultater
Forhøyet BIRC6 protein uttrykk ble funnet i prostata kreft cellelinjer og kliniske prøver til forskjell fra sine godartede kolleger. Økt BIRC6 uttrykket var forbundet med Gleason 6-8 kreft og kastrering motstand. Reduksjon av BIRC6 ekspresjon i LNCaP-celler førte til en markert reduksjon i celleformering som var assosiert med en økning i apoptose og en reduksjon i autophagosome formasjon. Doxorubicin-indusert apoptose ble funnet å være koblet til en reduksjon i BIRC6 proteinekspresjon.
Konklusjon
Dataene tyder på en rolle for BIRC6 i prostata cancer progresjon og behandling motstand, og indikere for den første tid at
BIRC6
genet og dets produkter er potensielt verdifulle mål for behandling av prostatakreft
Citation:. lav CG, Luk ISU, Lin D, Fazli L, Yang K, Xu Y, et al. (2013) BIRC6 Protein, en hemmer av apoptose: Rolle i Survival of Human prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (2): e55837. doi: 10,1371 /journal.pone.0055837
Redaktør: Kin Mang Lau, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 16 august 2012; Godkjent: 02.01.2013; Publisert: 8. februar 2013
Copyright: © 2013 Low et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostata kreft vanligvis til stede som androgen avhengige tumorer, som er mottakelige for veksthemming /apoptose indusert av androgen ablasjon terapi [1]. Selv om utgangspunktet effektiv, androgen ablasjon ofte fører til utvikling av kastrering-resistente (androgen-uavhengig) prostatakreft, som generelt er også resistente mot andre tilgjengelige behandlinger. Som sådan, kastrering motstand som vanligvis markerer slutten fasen form av prostatakreft og er stor hindring i sykdomshåndtering [1]. Utvikling av kastrasjon resistent prostatakreft er karakteristisk forbundet med markert økning i resistens mot apoptose, en viktig død veien for legemiddelvirkningen [1] – [3]. Apoptose motstand som følge av oppregulering av anti-apoptotiske gener og deres produkter er antatt å være en viktig bidragsyter i utviklingen av kastrering resistens, så vel som generell resistens mot anticancerbehandlinger. Belyse rollen som anti-apoptotiske gener /proteiner i utviklingen av prostatakreft er derfor trolig føre til forbedringer i behandlingen av refraktær sykdom.
hemmere av apoptose Protein (IAP) familie har blitt rapportert å spille en rolle i apoptose motstand i en rekke kreftcellelinjer, og er karakterisert ved nærvær i proteiner på en til tre kopier av en Baculoviral IAP Repeat (BIR) domene. De tilgangspunkter har blitt vist å binde seg til og inhibere en rekke pro-apoptotiske faktorer, for derved effektivt å undertrykke apoptose indusert ved et bredt spekter av effektorer, inkludert kjemoterapeutika og bestråling [4]. Den BIR domenet er avgjørende for samhandling av tilgangspunkter med pro-apoptotiske faktorer, inkludert kaspaser. De caspaser er en familie av cystein-asparaginsyre-spesifikke proteaser, er tilstede i en pro-form som, når aktivert via spaltning, er ansvarlig for nedbrytning av død substrater såsom poly-ADP-ribose polymerase (PARP) for derved å utløse apoptose. Spaltes caspase-3 og spaltet PARP lett kan påvises ved hjelp av Western blot-analyse og blir ofte brukt som markører for apoptose [5].
Apoptose er ofte forbundet med autophagy, en prosess som involverer lysosomal degradering av en cellens egne komponenter [6]. Det involverer pakking av proteiner og organeller innenfor autophagosomes, etterfulgt av fusjon med lysosomer som fører til nedbrytning av proteiner og organeller. Rollen til autophagy i utviklingen av kreft og dens behandling er komplisert, siden det er bevis for at autofagi kan fremme og undertrykke veksten av kreft [7]. Inhibering av autophagy ved avbrudd av essensielle Autophagy gener har vist seg å fremme tumorgenese og dermed autophagy kan ha en tumor-undertrykkende effekt [8] – [11]. Men det er økende bevis for at autofagi kan fungere som en overlevelses mekanisme for kreftceller i respons til et vidt spekter av belastninger, inkludert behandling med antikreftmidler [7].
å detektere autophagic aktivitet i dyrkede celler , Western blot-påvisning av LC3B-II blir ofte brukt. LC3B-II er spesielt forbundet med autophagosomes og nivåer av LC3B-II har blitt vist å korrelere med antallet autophagosomes i celler [12] – [15]. Men siden LC3B-II er degradert på autophagosome-lysosome fusion, LC3B-II tilbyr bare et øyeblikksbilde av antall autophagosomes i celler på en gang-punkt og indikerer ikke en oppregulering eller nedregulering av autofagi i sin helhet [13], [15]. Følgelig kan en reduksjon i antall autophagosomes i en celle forekomme ved en nedgang i autophagosome formasjon eller en økning i autophagosome degradering. Påvisning av andre kritiske autofagi proteiner som Beclin-en kan tilby ytterligere innsikt i aktiveringen av autophagy innenfor disse cellene. Dette proteinet er involvert i både signalveien aktiverende autophagy og i det innledende trinn av autophagosome formasjon [12], [16]. Foreløpig er det ingen bevis som tyder på en rolle for tilgangspunkter i reguleringen av autophagy hos mennesker.
BIRC6 protein er på 528 kDa, en uvanlig stor medlem av IAP familien. Den består av en enkel N-terminale BIR domene og et C-terminalt ubikvitin-konjugasjon (UBC) domene; den sistnevnte har kimære E2 /E3 ubiquitin ligase aktivitet så vel som anti-apoptotiske aktivitet [17]. Gjennom sin BIR domene, er BIRC6 stand til binding til og inhibering av aktive caspaser, inkludert caspaser-3, 6, 7 og 9, og slike vekselvirkninger er blitt vist å ligge under BIRC6 evne til å inhibere caspase kaskade og til slutt apoptose [17]. Gjennom sin UBC domene, letter BIRC6 proteasomal nedbrytning av pro-apoptotiske proteiner caspase-9 [18], SMAC /DIABLO [18], [19] og HTRA2 /OMI [17], [20]. BIRC6 er også en viktig regulator av cytokinese og følgelig spiller en viktig rolle i celleproliferasjon [21].
Nylige bevis støtter en utstrakt rolle for BIRC6 i overdragelse apoptose resistens mot kreftceller, som indikert ved
i studier med celler vitro
fra hjernesvulst [22], lunge kreft [23], livmorhalskreft [19], [21], [24], [25], fibrosarkomer [18], [24], osteosarcomer [21] , brystkreft [24], [26] og tykktarm kreft [27]. I bryst og lunge kreftceller, og apoptose utløst ved tap av BIRC6 ekspresjon er vist å involvere p53 stabilisering [23], [26]. BIRC6 uttrykk i kliniske kreftprøver har blitt observert for tykktarmskreft [28] og barndom
de novo
akutt myelogen leukemi (AML) [29]. I sistnevnte, forhøyet uttrykk for
BIRC6
mRNA ble assosiert med en ugunstig reaksjon på kjemoterapi og fattige tilbakefall frie overlevelsesraten [29]. En rolle for BIRC6 i prostata kreft, men har ikke blitt rapportert.
I denne studien, analyse av menneskelig prostata kreft cellelinjer og kliniske prøver viste markert stigning i BIRC6 uttrykk ved de ondartede celler /vev som tydelig fra sine godartet kolleger. Spesielt ble øket BIRC6 uttrykk forbundet med Gleason 6-8 kreft og kastrering motstand. Videre siRNA-indusert knockdown av BIRC6 førte til en markert reduksjon i celle spredning av LNCaP prostatakreftceller. Til sammen tyder resultatene på at BIRC6 representerer en ny terapeutisk mål for behandling av ildfaste prostatakreft.
Materialer og metoder
Material
kjemikalier, løsemidler og løsninger ble oppnådd fra Sigma-Aldrich Canada Ltd, Oakville, ON, Canada, med mindre annet er angitt.
klinisk prostatakreft Vev
Prøvene ble innhentet fra pasienter, med deres samtykke, etter en protokoll godkjent av klinisk forskningsetiske styret for University of British Columbia og BC Cancer Agency. Gleason-gradert microarray (TMA) ble brukt som består av 35 godartet prostata prøver, 6 prostata-intraepitelial neoplasi eksemplarer og 157 radikale prostatektomi prostatakreft prøver. Kreft prøvene besto av 74 Gleason score 6, 23 Gleason score 7, 43 Gleason scorer 8, 2 Gleason scorer 9 og 15 Gleason score 10 vev som ikke hadde blitt utsatt for neo-adjuvant hormonbehandling og 10 prostatakreft vev som hadde vært utsatt for neo-adjuvant hormonbehandling og hadde kommet til kastrering-resistent sykdom. De sistnevnte 10 vev hadde Gleason score til 8 (n = 6) og 10 (n = 4) før behandling. Prøver for TMA bygging hadde blitt valgt tilfeldig fra samlingene ved Vancouver Prostata Centre, Vancouver General Hospital (levert av Avdeling for patologi, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada). Tissue forberedelse og TMA byggingen ble utført som beskrevet [30].
Immunohistochemistry
Immunohistokjemiske analysene ble utført som beskrevet [31] med en kanin polyklonale anti-BIRC6 antistoff (Novus Biologicals, Littleton, CO ; NB110-40730) på en 1:100 fortynning. Alle deler som brukes for immunhistokjemi ble kontra med 5% (w /v) Harris hematoxylin.
BIRC6 Protein Scoring
BIRC6 farging av vev ble evaluert av en patolog og gitt en score fra 0, 1 , 2 eller 3, som representerer ingen BIRC6 farging, svak, moderat og sterk BIRC6 fargeintensitet, henholdsvis. Prosent positivitet (som et mål på farging frekvens) ble beregnet for hver gruppe basert på antall seksjoner med flekker intensiteter av «1» eller høyere.
Cellelinjer
Seks menneskelige prostata kreft celle linjer (LNCaP, PC3, PC3-M, DU145, C42, Vcap), to benign prostatahyperplasi cellelinjer (BPH1, RWPE1) og to cellelinjer som er kjent for å uttrykke BIRC6 (OVCAR-8, HeLa) ble opprettholdt i media supplert med FBS ( 10%), penicillin G (100 IU /ml) og streptomycin (100 ug /ml) i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2 [22]. Kreftceller ble dyrket ved hjelp av RPMI-1640 medium, ble BPH1 celler dyrket ved hjelp av DMEM, og RWPE1 celler ved hjelp av keratinocyte-SFM (Gibco-BRL, Burlington ON, Canada). Cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). For å bestemme effekten av apoptose på BIRC6 ekspresjon i LNCaP-celler, ble 600.000 celler sådd ut i 6-brønns plater og inkubert over natten og deretter inkubert med doksorubicin (1 pg /ml).
Western blotting
Cellelysater ble fremstilt ved anvendelse av cellelyseringsbuffer (1% NP-40, 0,5% natrium-deoksykolsyre). For påvisning av BIRC6 (528 kDa), 10 ug helt cellelysat ble kjørt på en to-del (5% og 12,5%) SDS-polyakrylamidgel. Geler ble kuttet, og BIRC6 ble elektrooverført til en PVDF-membran i tris (25 mM), glycin (191,5 mM), metanol (10%), SDS (0,05%), ved anvendelse av en semi-tørr overføring apparat. Membraner ble undersøkt for BIRC6 med kanin polyklonale anti-BIRC6 antistoff (1:500; Novus Biologicals). For påvisning av PARP, caspase-3, ble LC3B-I, LC3B-II og Beclin-1-protein ekspresjon, 5-15 ug hele cellelysatet kjøre på 10 eller 12,5% SDS-polyakrylamidgeler og, som følge av protein- overføring, membraner var probet ved bruk av kanin anti-PARP og anti-Caspase-3-antistoffer (1:1000, Cell Signaling, Beverly, MA), kanin anti-LC3B antistoffer (0.85:1000; Abcam, Cambridge, MA) og kanin anti-Beclin-1-antistoffer (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California). Actin eller vinculin ble brukt som laste kontroller og oppdaget på membraner ved hjelp av kanin anti-aktin polyklonale antistoff (1:2000, Sigma-Aldrich) og mus anti-vinculin antistoff. (1:3000, Sigma-Aldrich)
liten interfering RNA (siRNA) og Cell Transfeksjon
Custom sirnas syntetisert av Dharmacon (Lafayette, CO) og kjent for å målrette
BIRC6
hadde følgende sekvenser: siRNA-1, forstand, 5′ Guu-UCA-AAG-CAG-GAU-GAU-G-dTdT-3 «[23] og siRNA-2, følelse, 5′-CUC-AGG-AGA-GUA-CUG-CUC-A-dTdT-3» [ ,,,0],21]. Non-targeting siRNA (siGENOME Non-Targeting Smartpool; Dharmacon) ble brukt som kontroll. For å undersøke effekten av sirnas på BIRC6 protein ekspresjon, ble LNCaP-celler sådd ut i 6-brønns plater i antibiotika-fritt RPMI-1640-medium supplert med føtalt bovint serum (10%). Etter 24 timer ble cellene transfektert med 100 nM siRNA i lipofektamin 2000 reagens (Invitrogen, Burlington, ON) i henhold til produsentens instruksjoner. Vehicle kontroll og ikke-måls siRNA ble brukt til å gjenskape cellekulturer.
MTT levedyktighet analysen
tjuefem tusen celler ble sådd per brønn i en 24-brønners skål og transfektert med siRNA-2 . Ved 0, 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon, 50 ul av MTT (5 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn, og kulturene ble inkubert i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2 i 4 timer . Fem hundre ul 20% SDS-løsning ble deretter tilsatt til hver brønn og inkubert over natten ved romtemperatur i fravær av lys. Prøver (100 ul) ble deretter overført til 96-brønners plater. Absorbansen ble målt ved 570 nm.
Cell Cycle
cellesyklus distribusjon av LNCaP celler ble bestemt ved flowcytometri av propidiumjodid (PI) fargede celler. Celler ble dyrket i RPMI-10% FBS medium og deretter behandlet med
BIRC6
siRNA. Førti-åtte timer etter behandling med siRNA ble cellene fiksert med 70% etanol og deretter lagret ved 4 ° C over natten. Fikserte celler ble vasket en gang med PBS. Etter sentrifugering ble cellene farget med 10 ug /ml propidiumjodid (PI), 1 mg /ml RNase og 0,1% Triton X-100 i 30 minutter på is. DNA-histogrammer ble oppnådd ved å analysere 10.000 celler. Andelen av celler i G1, S og G2 + M av cellesyklusen, ble bestemt.
Annexin V-Assays
Apoptose ble målt ved fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS) analyse med annexin -V konjugert med fluoresceinisotiocyanat (annexin-V-FITC) (BD Biosciences PharMingen) for tidlig apoptose og propidiumjodid (PI) for sent apoptose farging følge produsentens protokoll. Celler ble dyrket i RPMI-10% FBS medium og deretter behandlet med
BIRC6
siRNA. Førti-åtte timer etter behandling med siRNA, ble cellene høstet, vasket med kald PBS og deretter resuspendert i 1 x bindingsbuffer (BD PharMingen, San Diego, CA) ved en konsentrasjon på ~ 1 x 10
6 celler /ml. Cellesuspensjoner (100 ul; ~ 1 x 10
5 celler) ble overført til nye rør, og 5 ul Annexin V-FITC og 5 ul alikvoter PI ble tilsatt. Cellene ble inkubert i mørke i 15 minutter ved 21 ° C. Annexin-FITC fluorescens ble målt i FL1-kanalen (ved hjelp av en 530/30 band pass filter) og PI i FL3 kanal (660/20 BP filter band pass filter). Ti tusen hendelser ble samlet. Apoptose ble bestemt ved å telle hvor mange prosent av AnnexinV-positive celler. Data er vist som gjennomsnitt ± SD av tre eksemplarer kultur.
LC3-GFP puncta Formation analysen og Kvantifisering
LNCaP celler ble sådd på dekkglass i 6-brønners plater og transfektert med 100 nM non-target siRNA eller BIRC6 siRNA-to neste dag ved hjelp Oligofectamine. Førti-åtte timer etter siRNA transfeksjon ble cellene transfektert med 3 ug LC3-GFP per brønn av XtremeGENE (Roche), og cellene ble fiksert med 4% paraformaldehyd 27 timer etter transfeksjon. LC3-GFP puncta dannelse ble indusert 6 timer før fiksering ved behandling med 10 uM klorokin i serumfritt medium. Etter fiksering, ble dekk montert med DAPI monteringsløsning. Fluorescent bildene ble tatt av konfokal mikroskop. Kvantifisering av autophagic celler: autophagic celler ble referert til som celler som inneholder mer enn 15 LC3-GFP puncta. Andel autophagic celler ble beregnet som antall autophagic celler dividert med antall LC3-GFP positive celler × 100.
Statistical Analysis
Studentenes
t
-test ble brukt og resultater med en
P
-verdi. 0,05 ble vurdert som signifikante
resultater
Forhøyet BIRC6 protein nivåer i menneskelig Prostate Cancer Cell Lines
Western blotting viste sterk BIRC6 protein ekspresjon i alle prostatakreft-cellelinjer som ble undersøkt (fig. 1). I motsetning til dette var bare lave nivåer av BIRC6 protein ekspresjon detektert i BPH1 og RWPE1 godartet prostatacellelinjer. Moderat til sterk BIRC6 uttrykk ble påvist i OVCAR8 og Hela celler som rapportert av andre [17], [22]. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
BIRC6 protein ekspresjon i ondartet prostataceller (kolonnene 1-6), positiv kontroll ondartede cervical og eggstokkceller (søyle 7-8) og benign prostataceller (søyle 9-10 ).
Forhøyet BIRC6 protein nivåer i Gleason Scoret Kliniske prostate Cancer vev
Kliniske prostata vev seksjoner, morfologisk kategorisert i godartet vev og kreft Gleason scorer 6-8 og 9-10 ble farget og scoret for BIRC6 uttrykk. Positiv cytoplasma farging for BIRC6 var generelt lav i godartet epitel, vesentlig mer intens i godt differensiert Gleason grad 3 og sterkest i dårlig differensiert Gleason grad 4 prostata kreft vev (Fig. 2A-D). Gleason grad 5 vev generelt uttrykt lavere nivåer av BIRC6 flekker i forhold til de andre prostata kreftvev, i likhet med godartede vev. Seksjoner som inneholder både godartet vev og kreftvev (Gleason grad 3) viste sterk positiv BIRC6 flekker i ondartet epitel og fraværende eller svak uttrykk i godartet epitel (data ikke vist). Bety fargeintensitetene av PIN-koden var litt forhøyet sammenlignet med benign epitel, men ikke signifikant forhøyet (data ikke vist). I Gleason scoret vev (Fig. 2E), uttrykk for BIRC6 var lav for godartet vev og steg jevnt og trutt, med en topp i Gleason score 7 kreft. Expression i Gleason scorer 8 kreft var lavere og en videre nedgang til nivåer tilsvarende de som av godartede vev ble sett for Gleason score 9-10 prøver. De midlere fargeintensitetene for hver gruppe var 1,00 ± 0,80 S.D. for godartet epitel og 1,53 ± 0,92 S.D. (
P
= 3.24 × 10
-3) for Gleason score seks, 2,22 ± 0,90 S.D. (
P
= 4,45 × 10
-6) for Gleason score 7 og 1,60 ± 0,82 S.D. (
P
= 1,63 × 10
-3) for Gleason scorer 8 prostatakreft vev. Intensiteten av BIRC6 uttrykk i Gleason score 9-10 prostata kreft vev var lik som godartet vev (0,71 ± 0,47 S.D .;
P
= 0,10). Også lav intensitet i uttrykket observert i Gleason score 9-10 prostata kreft vev var representativ for den store andelen vanligvis svake BIRC6-uttrykke Gleason grad 5 kreft som finnes i denne gruppen.
A, piler indikerer svak cytoplasma BIRC6 flekker i benign prostatahyperplasi luminal celler (poengsum «1»). B, piler indikerer moderat cytoplasma BIRC6 farging i Gleason grad 3 prostatakreftceller (poengsum «to»). C, piler indikerer sterk cytoplasma BIRC6 farging i Gleason grad 4 prostatakreftceller (poengsum «3»). D, piler indikerer svak cytoplasma BIRC6 farging i Gleason grade 5 prostatakreftceller (poengsum «1»). E, Svarte striper som representerer gjennomsnitts BIRC6 fargeintensitet i benign prostata epitel (n = 35) og Gleason score 6 (n = 74), 7 (n = 23), 8 (n = 43) og 9-10 (n = 17) pasient prostata kreft vev. Grey barer representerer frekvensen av BIRC6 uttrykk (poengsum ≥1). Forhøyede fargeintensitet ble observert i Gleason scorer seks (*
P
= 3.24 × 10-3), 7 (*
P
= 4.45 × 10-6) og 8 (*
P
= 1.63 × 10-3) prostata kreft vev som sammenlignet med benign prostata epitel. Feilfelt skildre standardavvik. F, Svarte striper som representerer gjennomsnitts BIRC6 fargeintensitet i ubehandlet høy klasse (Gleason score 8-10) prostata kreft vev (n = 60) og kastrering resistent prostatakreft (CRPC) vev som hadde utviklet seg fra Gleason score 8-10 kreft følgende neo -adjuvant hormonbehandling (n = 10). Grey barer representerer frekvensen av BIRC6 uttrykk (poengsum ≥1). Kastrering resistent prostatakreft vev viste en signifikant høyere gjennomsnittlig BIRC6 fargeintensitet enn ubehandlede høy klasse prostata kreft vev (*
P
= 1.38 × 10-3). Feilfelt skildre standardavvik.
Gleason score 6, 7 og 8 ondartet epithelia oftere uttrykt BIRC6 (fargeintensitet poengsum ≥1) enn benign prostata epitel (Fig. 2E). Alle ondartet vev viste en høy frekvens av BIRC6 uttrykk koplet til høy BIRC6 intensitet, med unntak av Gleason ballen 9-10 vev som viste en høy frekvens av BIRC6 uttrykk er koplet til en lav gjennomsnittlig intensitet. Til sammen dataene antyder at prostata kreft progresjon fra godartet til Gleason scorer 8 prostatakreft er assosiert med forhøyede BIRC6 protein uttrykk.
Forhøyet BIRC6 protein nivåer i Kastrering bestandig Clinical Prostate Cancer Vev
Tissue seksjoner fra pasientenes prostatakreft (Gleason score 8-10) som hadde kommet til kastrering motstand følgende neo-adjuvant hormonbehandling (n = 10) ble farget og scoret for BIRC6 uttrykk og sammenlignet med deler av høy klasse prostatakreft (Gleason scorer 8-10) som ikke hadde blitt utsatt for neo-adjuvant hormonbehandling (n = 60). Den midlere fargeintensitet for BIRC6 var signifikant høyere i kastreringsfast prostata cancer enn i ubehandlede kontroller (2,30 ± 0,67 og 1,35 ± SD 0.84 SD henholdsvis;
P
= 1,38 x 10
-3) (Fig . 2F). BIRC6 uttrykk frekvens var meget høy i begge typer vev. Dataene tyder på at utviklingen av kastrering resistent prostatakreft er assosiert med forhøyede BIRC6 protein uttrykk.
Reduksjon av BIRC6 Expression Reduserer Prostate Cancer Cell Livskraftig og sprednings
Det har blitt rapportert at reduksjon av BIRC6 uttrykk induserer apoptose (for eksempel i brystkreftceller). Vi brukte LNCaP-cellelinjen for å studere effekten av å redusere BIRC6 uttrykk på prostatakreft celle-levedyktighet. Inkubasjon av LNCaP-celler transfektert med
BIRC6
for målretting for siRNA-1 og -2 (banene 3, 4, 7, 8, 11, 12) resulterte i betydelig tap av BIRC6 protein, sammenlignet med celler behandlet med lipofektamin bare (Sporene 2, 6, 10), lipofektamin + ikke-målsøkende siRNA (Sporene 5, 9, 13) eller ingen behandling (kolonne 1) (fig. 3A). Effekten var tydelig etter 30 timer med transfeksjon og ble mer fremtredende på 54 og 78 timer. Det kan bemerkes at celler transfektert med lipofektamin bare, eller med lipofektamin + ikke-målsøkende siRNA, viste en liten økning i ekspresjon BIRC6, antagelig på grunn av kjøretøyet. Alle påfølgende knockdown eksperimenter ble utført ved hjelp av siRNA-2.
En behandling av LNCaP cellekulturer med sirnas målretting BIRC6 fører til reduksjon av BIRC6 protein uttrykk. BIRC6 protein ekspresjon i ubehandlede LNCaP-celler (bane 1; ved 78 timer) og i LNCaP-celler inkubert med kun lipofektamin (baner 2, 6, 10), siRNA-1 målretting BIRC6 (banene 3, 7, 11), siRNA-2 målretting BIRC6 (søyle 4, 8, 12) eller ikke-målsøkende siRNA (kolonnene 5, 9, 13) for 30, 54 og 78 timer etter transfeksjon. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. B, behandling av LNCaP-cellekulturer med siRNA-2 målretting BIRC6 fører til redusert celleproliferasjon som vist ved MTT-analyse. Kulturer ble behandlet i 30 timer med lipofektamin bare eller med lipofektamin pluss enten ikke-målsøkende siRNA eller siRNA-2 målretting BIRC6 og deretter inkubert i 24, 48 og 72 timer i friskt medium. De relative celleantall i siRNA-2 kulturene var betydelig lavere enn i de ikke-målsøkende siRNA behandlede kulturer med 2,85%, 10,78% og 25,88% ved 54, 78 og 102 timer, henholdsvis. Feilfelt skildre standardavvik.
Etter transfeksjon, siRNA-2 transfekterte kulturer viste en markert reduksjon i celle levedyktighet i forhold til de ikke-målretting siRNA-behandlede kulturer (fig. 3B). Således cellelevedyktigheten av siRNA-2 kulturene var betydelig lavere enn den for henholdsvis ikke-målsøkende siRNA-behandlede kulturer med 2,85%, 10,78% og 25,88% ved 54, 78 og 102 timer. Det var en tendens til at siRNA-2-behandlede celler til å danne syncytia-lignende strukturer der klynger av celler ble sammen av lange spindel-lignende fremspring. Resultatene er representative for to uavhengige eksperimenter. Effekten av BIRC6 stanse på cellecyklusprogresjonen ble også undersøkt. Knockdown av BIRC6 i LNCaP celler førte ikke til vesentlig endring i celle sykling (fig. S1).
Effekten av BIRC6 reduksjon ble også undersøkt i PC-3 prostatakreftceller. I likhet med LNCaP-celler, siRNA-2-transfekterte PC-3-celler viste en signifikant reduksjon i celleviabilitet i forhold til de ikke-målretting siRNA-behandlede celler 72 timer etter transfeksjon (fig. S2).
Reduksjon av BIRC6 Expression induserer apoptose og hemmer Autophagosome Formation
BIRC6 reduksjon induserer apoptose i LNCaP celler som demonstrert av Annexin-V farging og immmunoblotting. Som vist på fig. 4A, var det en betydelig økning i Annexin-V-positive celler i siRNA-2-transfekterte celler (12,19% ± 1,9%) sammenlignet med ikke-target-siRNA (3,65% ± 0,60%, p = 0,0104) og Lipofectamine behandlede celler (3.55% ± 0,0447%, p = 0,0123). I samsvar med Annexin-V analyseresultatene, BIRC6 knock-down cellene viste markerte endringer i uttrykket av apoptose markører (figur 4B). En økning i spaltede caspase-3, tap av full lengde PARP og en økning i et spaltet PARP ble observert sammenlignet med LNCaP-celler transfektert med ikke-målsøkende siRNA (felt 3, 4). Interessant, observerte vi en full lengde PARP-reduksjon etter transfeksjon av LNCaP-celler med lipofektamin eller ikke-målsøkende (kontroll) siRNA (baner 2, 4), som kan ha blitt forårsaket av uspesifikk degradering av full lengde PARP særlig i LNCaP-celler. Tapet av full lengde PARP i disse kontrollene var ikke assosiert med en tilsvarende økning i spaltede PARP og er ikke koblet til en betydelig økning i spaltede caspase-3, noe som indikerer at disse kontrollene ikke resulterte i induksjon av apoptose.
A, apoptose av LNCaP celler transfektert med Lipofectamine (Lipo), ikke-targeting kontroll siRNA (NT) eller
BIRC6
siRNA2 og deretter inkubert i 48 timer, som vurderes av flowcytometrisk analyse av Annexin V /PI farget celler. På grunnlag av Q2 + Q3-verdier (apoptotiske cellepopulasjoner),
BIRC6
siRNA markant økt apoptose av LNCaP-celler sammenlignet med lipo (p = 0,0104) eller NT siRNA behandlede celler (p = 0,0123). (Data er representativ for 3 uavhengige eksperimenter); B, behandling av LNCaP-celler med siRNA-2 målretting BIRC6 fører til aktivering av kaspase-3 (som vist ved opptreden av spaltet caspase-3) og nedbrytning av dets substrat, PARP (som vist ved tap av full lengde PARP og utseende av en spaltede PARP produkt). Ubehandlet LNCaP-celler (kolonne 1); LNCaP-celler inkubert med lipofektamin bare (spor 2), siRNA-2 målretting BIRC6 (felt 3) eller ikke-målsøkende siRNA (felt 4) i 96 timer etter transfeksjon. C, behandling av LNCaP celler med siRNA-2 målretting BIRC6 fører til nedgang i Beclin-1 uttrykk og reduksjon av LC3B-II. Ubehandlet LNCaP-celler (kolonne 1); LNCaP-celler inkubert med lipofektamin bare (spor 2), siRNA-2 målretting BIRC6 (felt 3) eller ikke-målsøkende siRNA (felt 4) for 113 timer etter transfeksjon. D, autophagosome formasjonen i BIRC6-forstummet celler var betydelig lavere sammenlignet med celler behandlet med ikke-måls kontroll siRNA. Celler transfektert med ikke-måls siRNA kontroll (venstre) viste mer LC3-GFP puncta enn celler transfektert med siRNA-2 målretting BIRC6 (til høyre), som viste diffust uttrykk for LC3-GFP. E, Redusert BIRC6-uttrykke LNCaP celler viser betydelig færre autophagic celler (33,6%) sammenlignet med kontrollceller (51%). Autophagic celler ble kvantifisert ved å telle celler med mer enn 15 LC3-GFP puncta under et konfokal mikroskop.
Transfeksjon av LNCaP celler med siRNA-2 (Lane 3) førte til markerte endringer i autofagi markør uttrykk ( fig. 4C). En reduksjon i LC3B-II-protein (lipidert form av LC3-I) ble ikke observert noen effekt på LC3B-I-proteinnivåer, så vel som en nedgang i Beclin-1-proteinet uttrykket (sammenlignet med kontroller, baner 1, 2, 4) . Videre autophagosome formasjonen i BIRC6-forstummet celler var betydelig lavere sammenlignet med celler behandlet med ikke-måls kontroll siRNA (
P
= 0,036) som avslørt av fluorescerende LC3 puncta opphopning i cytoplasma (fig. 4D, E) . Tatt sammen, viser resultatene at reduksjon av BIRC6 protein ekspresjon i siRNA-2-behandlede LNCaP-celler resulterer i en økning i apoptose og en reduksjon i autophagosome formasjon. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Doxorubicin-indusert apoptose i LNCaP celler er assosiert med en reduksjon i BIRC6 Protein Expression
Doxorubicin, et stoff som brukes til behandling av prostatakreft [32], har blitt rapportert å utløse apoptose sammen med en markert akkumulering av p53 [33]. For å undersøke effekten av doksorubicin-indusert apoptose på BIRC6 ekspresjon i prostatakreftceller, ble LNCaP-celler inkubert i 24 timer med eller uten doksorubicin (1 pg /ml). Som vist ved Western blot-analyse, behandling med doxorubicin resultert i vesentlig reduksjon av BIRC6 ekspresjon (Fig. 5A). I tillegg var det en reduksjon i full lengde PARP proteinekspresjon og en økning i et spaltet PARP, en indikasjon på apoptose. Videre var det en reduksjon i celletetthet med tegn på forringelse celle (Fig. 5B). Behandling av LNCaP-celler med doksorubicin viste en dose- og tidsavhengig reduksjon av BIRC6 ekspresjon (Fig. S3). For å forstå hvorvidt BIRC6 reduksjon var en sak eller et resultat av doksorubicin indusert apoptose, temporal ekspresjon av BIRC6 og PARP etter doksorubicin behandling ble undersøkt.
