Abstract
Bakgrunn
I denne studien undersøkte vi om PKR protein uttrykk er korrelert med mRNA nivåer og også vurdert molekylære biomarkører som er forbundet med PKR, som fosforyleres PKR (p- PKR) og fosforylert eIF2α (p-eIF2α).
Metode og funn
Vi bestemte nivåene av PKR proteinuttrykk og mRNA i 36 friske primære lunge svulst vev ved hjelp av Western blot analyse og real -time revers-transkriptase PCR (RT-PCR), respektivt. Vi brukte microarray for immunhistokjemisk vurdering av ekspresjonen av p-PKR og p-eIF2α proteiner. Vi viste at PKR mRNA nivået er signifikant korrelert med PKR proteinnivåer (Spearmans rho = 0,55,
p
0,001), noe som tyder på at PKR proteinnivået i tumorprøver er regulert av PKR mRNA. Vi har også observert at pasienter med høyt p-PKR eller p-eIF2α ekspresjon hadde en betydelig lengre median overlevelse enn de med liten eller ingen p-PKR eller p-eIF2α uttrykket (
p
= 0,03 og
p
= 0,032, henholdsvis). Vi evaluerte videre prognostisk effekt av kombinert uttrykk for p-PKR pluss PKR og p-eIF2α pluss PKR og fant at begge kombinasjonene var sterke uavhengige prognostiske markører for pasientene, overlevelse på scenen jeg og alle scene pasienter.
Konklusjoner
Våre funn tyder på at PKR protein uttrykk kan kontrolleres av transkripsjon nivå. Kombinerte uttrykk nivåer av PKR og p-PKR eller p-eIF2α kan være nye markører for å forutsi prognosen for pasienter med NSCLC
Citation. Han Y, Correa AM, Raso MG, Hofstetter WL, Fang B, Behrens C, et al. (2011) The Role of PKR /eIF2α signalveien i Prognose av ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 6 (11): e24855. doi: 10,1371 /journal.pone.0024855
Redaktør: John D. Minna, University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 25 mars 2011; Godkjent: 22 august 2011; Publisert: 10.11.2011
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering: Dette arbeidet støttes delvis av National Institutes of Health gjennom MD Anderson Cancer Center Support Grant CA-016672 – Lung Program, en Specialized. program for fremragende forskning (SPORE) Grant CA-070907 (til IW), og en R01 Grant CA-124591 (til BF). Ytterligere støtte kom fra Department of Defense gi W81XWH-07-1-0306 (til IW), Stiftelsen National Natural Science of China (30600611, 81071912) (til YH) og «1510-prosjektet» av Third Military Medical University of China (til YH), og fra Homer Flower Gene Therapy fondet, Charles Rogers Gene Therapy fondet, Margaret Wiess Elkins Velsignet forskningsfond, Flora og Stuart Mason Lung Cancer Research Fund, Phalan Thoracic Gene Therapy Fund, og George P. Sweeney esophageal forskningsfond (SS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter. LY er ansatt i Ziren Research LLC. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
protein kinase (PKR) er et interferon-induserbar serin /treonin kinase som formidler proteinsyntese, en tett regulert prosess som er kritisk i cellulær proliferasjon og differensiering [1] – [3]. Økt PKR uttrykk har vist seg å korrelere med bedre prognoser i hode- og halskreft og tykktarmskreft [2], [3], og samler bevis viser at PKR kan fungere som en tumor suppressor i leukemi og andre blodkreft maligniteter [4], [ ,,,0],5]. Binding av enten dobbel-strandet RNA (dsRNA) eller strukturerte enkelt-strandet RNA kan megle PKR fosforylering [6], [7]. Aktivert PKR fosforylerer sin veldokumentert nedstrøms mål, alfa-underenhet av proteinsyntese initiering faktor eIF2 (eIF2α), som fører til hemming av proteinsyntesen og utløsning av antiviral og antitumor-aktivitet [8], [9]. I tillegg til sin rolle i translasjonelle kontroll har PKR vært implisert i antiviral medfødt immunitet, apoptose, celleproliferasjon, og stress signalering [10]. Videre er PKR uttrykk og autofosforylerings økt i flere typer kreft, inkludert melanom, tykktarmskreft og brystkreft [11], [12]. Resultatene fra flere studier har vist viktigheten av fosforylert eIF2α (p-eIF2α) i kreftterapi [10], [13], [14]: aktivering av PKR-eIF2a fosforylering veien er vesentlig for de antiproliferative og proapoptotiske funksjoner av tumorsuppressorgenet [15].
Nylig, fant vi at lav uttrykk for dsRNA avhengig PKR var signifikant assosiert med kortere overlevelse hos NSCLC pasienter, noe som tyder på at biologiske funksjoner av PKR eller nedstrøms molekyler kan være verdifulle prognostiske faktorer i NSCLC [1]. I denne nye studien, vårt mål var å avgjøre om PKR protein uttrykk er assosiert med sine mRNA nivåer og om nedstrøms mål, for eksempel fosforylert PKR (p-PKR) og p-eIF2a, er også prognostiske faktorer i NSCLC. Vi først bestemt PKR mRNA nivåer og protein uttrykk i fersk frosset NSCLC vev og fant en positiv korrelasjon mellom PKR protein uttrykk og mRNA nivåer. Deretter bruker immunhistokjemisk farging, undersøkte vi uttrykket av p-PKR og dens godt karakterisert nedstrøms molekyl p-eIF2α i arkiverte vevet microarray prøver. Våre resultater viser at p-PKR og p-eIF2α er prediktive biomarkører for NSCLC utfall, og at når ekspresjon av PKR ble kombinert med ekspresjon av p-PKR eller p-eIF2α, ble virkningen på forutsi pasientens overlevelse forbedret.
Resultater
PKR protein uttrykk korrelerer med mRNA nivåer
For å undersøke om PKR protein uttrykk er assosiert med mRNA nivåer, vi bestemt PKR og p-PKR protein expression og PKR mRNA nivåer i 36 friske primære lunge tumorvev ved hjelp av Western blot-analyse og sanntids RT-PCR, henholdsvis. Protein ekspresjon av β-aktin, og dens mRNA-nivåer ble også bestemt og anvendt som kontroller. Resultatene av Western blotting analyser viste at tumorprøver uttrykt forskjellige nivåer av PKR på både protein- og mRNA-nivåer (figur 1A og 1B). Statistisk analyse viste en signifikant sammenheng mellom PKR protein uttrykk og dets mRNA nivåer. (Spearmans rho = 0,55,
p
0,001; figur 1C). Disse resultatene tyder på at PKR genekspresjonen kan føre til de forskjellige nivåene av PKR protein ekspresjon i tumorer.
A. Western blot-analyse av PKR og p-PKR proteinet i tumorprøver. En densitometrisk analyse av forholdet mellom PKR eller PKR p-aktin er representerer normaliserte proteinnivåer. Hvert felt representerer en tumorprøve fra en individuell pasient. B. mRNA nivåer av tilsvarende prøvene ble bestemt ved hjelp av kvantitativ real-time PCR. Nivåer av β-aktin-proteinet og dets mRNA av den samme prøven ble anvendt som kontroller. C. Scatter tomt på PKR protein uttrykk korrelert med mRNA uttrykk (Spearmans rho = 0,55,
p
0,001).
Sammenheng mellom p-PKR og p-eIF2α protein uttrykk hos NSCLC tumorer med clinicopathologic funksjoner
Fordi den biologiske funksjonen til PKR er nært knyttet til sin fosforylering, og eIF2α fosforylering er et kjennetegn på PKR aktivering, neste evaluert vi uttrykket av p-PKR og p-eIF2α proteiner TMA eksemplarer ved hjelp av immunhistokjemisk farging. Tabell 1 oppsummerer forholdet mellom p-PKR eller p-eIF2α ekspresjon og andre clinicopathologic egenskaper. Høy p-PKR uttrykket var forbundet med adenokarsinomer subtype (
p
0,001). Ingen korrelasjon ble observert mellom p-PKR uttrykk og kjønn sex, TNM stadium, eller røykestatus. Vi fant heller ingen sammenheng mellom p-eIF2α uttrykk og clinicopathologic funksjoner. Representative bilder av immunhistokjemisk farging resultater for p-PKR og p-eIF2α er vist på figur 2. p-PKR og p-eIF2α proteiner ble uttrykt i cytoplasma av tumorceller.
høy-uttrykkende tilfeller (A og C). Lav-uttrykke tilfeller (B og D). Uttrykk for p-PKR og p-eIF2α ble oppdaget i cytoplasma.
Sammenheng mellom p-PKR og p-eIF2α protein uttrykk i NSCLC tumorer med sykdom utfall
for ytterligere å vurdere om p-PKR eller p-eIF2α protein uttrykk korrelerer med klinisk utfall av pasienter med NSCLC, Kaplan-Meier analyse viste at for trinn i og alle stadier, pasienter med relativt forhøyet p-PKR hadde signifikant lengre overlevelse enn de med liten eller ingen p-PKR uttrykk (figur 3A og 3C). For alle scene pasienter, var median overlevelse var 105 måneder for pasienter med høy p-PKR uttrykk og 51 måneder for de med liten eller ingen p-PKR uttrykk. En signifikant assosiasjon ble også observert mellom høy p-eIF2α protein uttrykk og lengre overlevelse på scenen jeg og alle trinn (Figur 3D og 3F). Det er ingen signifikant sammenheng ble observert mellom høy p-PKR eller høy p-eIF2α protein uttrykk og lengre overlevelse på scener II-IV (figur 3B og 3E).
A-F. Kaplan-Meier-overlevelseskurver i henhold til forskjeller i (A, B, C) p-PKR og (D, E, F) p-eIF2-α ekspresjon i pasienter med stadium I (A, D), stadier II-IV ( B, E), og alle trinn (C, F) NSCLC. Overlevelsesratene var betydelig verre i pasienter med lav p-PKR eller p-eIF2α uttrykk enn hos dem med høy p-PKR eller p-eIF2α uttrykk (Stage I:
p
= 0,01 og
p
= 0,02; Alle faser:.
p
= 0,03 og
p
= 0,03, henholdsvis)
I en univariat analyse, en Cox modellen indikerte at p-PKR og p-eIF2α hadde prognostisk betydning (tabell 2). I en multivariat analyse, fant vi at p-PKR og p-eIF2α uttrykk var statistisk signifikant assosiert med overlevelse (tabell 2). Disse resultatene indikerer at p-PKR og p-eIF2α uttrykk er uavhengige biomarkører for pasientenes overlevelse.
Vi har også undersøkt assosiasjoner mellom uttrykket nivåer av PKR, p-PKR, og p-eIF2α. Våre resultater indikerer at p-PKR uttrykk signifikant korrelert med p-eIF2a uttrykk (Spearmans rho = 0,48,
p
0,001). PKR uttrykk også signifikant korrelert med uttrykk av p-PKR (Spearmans rho = 0,31,
p
= 0,004) og p-eIF2α (Spearmans rho = 0,45,
p
0,001). Vi evaluerte videre prognostisk effekt av kombinert uttrykk for p-PKR pluss PKR og p-eIF2α pluss PKR og fant at begge kombinasjonene var sterke uavhengige prognostiske markører for pasientene, overlevelse på scenen I (Figur 4A og 4B) og alle scene pasienter (figur 4C og 4D). For alle objekt pasienter, pasienter med høy PKR og høy p-PKR ekspresjon hadde en median overlevelsestid på 132 år, som var signifikant lenger enn for pasienter med høy PKR og lav p-PKR uttrykket (median overlevelse, 80 måneder, Figur 4C ). Pasienter med liten eller ingen PKR og p-PKR ekspresjon hadde en vesentlig kortere median overlevelse (43 måneder, figur 4C). Det er en forskjell i utfall for PKR (H) /p-PKR (H) vs PKR (L) /p-PKR (H) pasienter på figur 4A. Vår IHC poengsum serien er 0-300 for PKR og p-PKR. I denne studien bruker vi median cut-off (150 for PKR og 70 for p-PKR). På figur 4A, 106 Stage I pasienter delt inn i fire grupper, 43 pasienter med høy PKR og høy p-PKR, 21 pasienter med høy PKR og lav p-PKR uttrykk, 32 Pasienter med lav PKR og p-PKR uttrykk og 10 pasienter med lav PKR og høy p-PKR uttrykk. Disse 10 pasientene har p-PKR poengsum range 80-120, er svært nær median cut-off score (70), og kan også tilhøre lav PKR lav p-PKR gruppe. For alle objekt pasienter, pasienter med høy PKR og høy p-eIF2α ekspresjon hadde en median overlevelsestid på 132 år, som var signifikant lenger enn for pasienter med høy PKR pluss lav p-eIF2α uttrykket (median overlevelse, 80 måneder), og de med lav PKR pluss høy p-eIF2α uttrykk (median overlevelse, 47 måneder; Figur 4D). Til slutt, pasienter med liten eller ingen uttrykk for både PKR og p-eIF2α hadde en betydelig kort median overlevelse (median overlevelse, 35 måneder, figur 4D).
A og C. Overlevelse var signifikant lavere hos pasienter med lav PKR eller lav p-PKR uttrykk enn hos dem med høy PKR eller høy p-PKR uttrykk på scenen i (A) og alle trinn (C) (
p
= 0,001 og
p
= henholdsvis 0,001,). B og D. overlevelse var også signifikant lavere hos pasienter med lav PKR eller lav p-eIF2α uttrykk enn hos dem med høy PKR eller høy p-eIF2α uttrykk på scenen I (B) og alle stadier (D) (
p
= 0,001 og
p
= 0,001, henholdsvis).
Diskusjoner
resultatene fra denne studien viser at PKR mRNA nivåer er forbundet med PKR protein uttrykk i primær NSCLC svulster. Våre funn tyder på at PKR protein uttrykk kan styre transkripsjonsnivåer. Videre våre data at sanntids RT-PCR, en følsom metode for kvantitativ analyse av mRNA-nivåer, kan brukes til å bestemme mRNA-nivåer i biopsiprøver og kan derfor være nyttig for å forutsi pasientens overlevelse. Vi fant også at pasienter med høy p-PKR uttrykk hadde signifikant lengre median overlevelse enn de med liten eller ingen p-PKR protein uttrykk. Resultater fra ulike studier av humane kreftformer har antydet at høy PKR uttrykk indikerer gunstig prognose for pasienter med plateepitelkarsinom i hode eller lever [2], [16], og dermed tyder på at PKR kan spille en viktig rolle i å undertrykke tumorprogresjon og påvirker apoptose [17]. Vi har også studert PKR stier og har funnet dem til å være strengt nødvendig for å indusere apoptose i enkelte kreftceller, blant annet lungekreft, etter visse behandlinger som melanom differensiering-assosiert genet 7 (
MDA7
), E2F-1 og TNFa [18], [19]. Flere nylig, vi og andre har vist at noen små forbindelser kan indusere PKR-avhengig apoptose i både kreftceller og murine embryonale fibroblaster [20], [21], noe som indikerer at moduler PKR aktivitet kan være en interessant tilnærming til kreftbehandling. Våre funn at NSCLC-tumorceller som uttrykker et høyt nivå av p-PKR korrelerer med en gunstig prognose er i overensstemmelse med tidligere observasjoner som PKR aktivering er assosiert med apoptose-induksjon.
Våre funn også vist at pasienter med høy ekspresjon av både PKR og p-PKR hadde signifikant lengre overlevelse enn gjorde de med andre kombinasjoner av uttrykk nivåer, inkludert de positive for PKR og negative for p-PKR og de negative for både PKR og p-PKR. Vår observasjon at 53% av NSCLC tumorprøver sterkt uttrykt PKR og at 61% av dem sterkt uttrykt p-PKR [data ikke vist] Disse resultatene førte oss til å spekulere i at PKR uttrykk (dvs. PKR) og PKR aktivering (dvs. p -PKR) påvirkes av ulike uttrykk for PKR aktivator eller PKR inhibitor. Andre forskere har rapportert at funksjonen av PKR kan reguleres ved å cellulære proteiner enten positivt (f.eks, MDA-7 /interleukin-24 og PKR-aktiverende protein [PACT]) eller negativt (f.eks p58IPK, nucleophosmin og varmesjokkproteiner 90 og 70) [18], [19]. I fremtidige studier, vil vi søke å finne ut hvilke PKR aktivatorer og hemmere påvirker PKR signalveien hos NSCLC tumorprøver.
Vi observerte at svulster med høy p-eIF2α uttrykk hatt en betydelig lengre median overlevelse. I tillegg har vi vist at pasienter med høye uttrykk for både PKR og p-eIF2α hadde også signifikant lengre overlevelse enn gjorde de med andre kombinasjoner av uttrykk nivåer. Våre funn at 47% av tumorprøver hadde lav PKR uttrykk og 27% hadde høy p-eIF2α uttrykk [data ikke vist]. Disse resultatene tyder på at fosforylering eIF2α i noen NSCLC-tumorer oppstår uavhengig av den PKR pathway. Foruten PKR, har tre forskjellige eIF2α kinaser som kan fosforylerer eIF2α i respons til ulike stressforhold blitt identifisert: heme-regulert hemmer, homolog av
Saccharomyces cerevisiae
protein kinase generell kontroll non-derepressible-2, og RNA- avhengige protein-kinase-lignende endoplasmatiske retikulum (ER) kinase (PERK, også kjent som bukspyttkjertel eIF2α kinase) [13]
I konklusjonen, våre data tyder på at PKR /fosforylert PKR /fosforylerte eIF2α signalveien. spiller en viktig rolle i prognosen for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). PKR pathway aktiviteter kan være nyttig for å forutsi NSCLC utfall, og moduler PKR pathway aktiviteter kan være en potensiell NSCLC behandling alternativet.
Metoder
Pasient og vev
NSCLC omgår radikal reseksjon av deres primære kreft ved The University of Texas MD Anderson Cancer Center mellom 2007 og 2008 ble brukt i denne studien basert på tilgjengelighet. Pasienter ble ekskludert fra studien dersom de tidligere hadde gjennomgått strålebehandling eller cellegift for kreft. Pasienter alle gitt skriftlig informert samtykke til bruk av sine vev, og studien ble godkjent av vår Institutional Review Board (University of Texas, MD Anderson Cancer Center). Etter å ha blitt kirurgisk reseksjon ble hver frisk tumor umiddelbart oppdelt i to deler; en ble umiddelbart frosset og lagret i flytende nitrogen for protein og RNA-ekstraksjon, og den andre ble fiksert med formalin og innstøpt i parafin for rutine histopatologisk evaluering og diagnose. Vev med en anslått tumorcelleinnhold på 70% eller mer ble anvendt for molekylære analyser. I tillegg til våre pasienters vev, fikk vi 193 NSCLC Tissue microarray (TMA) prøver (114 adenokarsinomer, og 74 plateepitelkarsinom) mellom 1997 og 2001 fra Lung Cancer Specialized Program for fremragende forskning Tissue Bank ved MD Anderson Cancer Center (Houston , TX). Alle prøvene ble histologisk undersøkt og klassifisert med 2004 World Health Organization klassifiseringssystemet [22]. I de fleste tilfeller, detaljert klinisk og patologisk informasjon, inkludert pasientenes demografiske data, røyking historie, og total overlevelse pluss sykdommen TNM staging og tid til tilbakefall, var tilgjengelig (tabell 1).
Western Blot analyse
Frosne tumorvev ble opprinnelig preparared ved å bli vasket to ganger i kald PBS. Omtrent 20 mg av vev fra hver ny prøve ble homogenisert i 0,5 ml iskald lyseringsbuffer (1% NP40, 50 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl
2, 100 mM NaF, 1 mM EGTA, 1 mM Na
3VO
4, 10% glycerol og 10 mM Na-pyrofosfat [Roche Applied Science]), som inneholder ferskt tilsatt protease og fosfat-inhibitor. Lysatene ble sentrifugert ved 14000 g i en mikrosentrifuge ved 4 ° C i 10 minutter, og de resulterende supernatantene ble anvendt som vevsekstrakter. Ekstraktene, tilsvarende 60 ug av det totale protein, ble separert ved anvendelse av en 10% SDS-polyakrylamidgel og deretter overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert med TBS inneholdende 5% fettfri tørrmelk og deretter probet i PBS inneholdende 5% bovint serum. De følgende antistoffer ble anvendt: kanin-anti-PKR (K-17, Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-p-PKR (pT446) (Epitomics), kanin-anti-p-eIF2a (Epitomics), og mus anti-β-actin (Sigma). Immunreaktive bånd ble påvist og kvantifisert ved hjelp av et Li-Cor Odyssey infrarød imaging system.
Reverse Transcription og Real-time absolutt kvantitativ revers-transkripsjon-Polymerase Chain Reaction (Real-Time AqRT-PCR)
det totale RNA (1 ug) fra hver frossen klinisk prøve ble ekstrahert ved anvendelse av en Trizol ekstraksjon sett (Invitrogen) og revers transkribert i et 20 ul reaksjonsvolum ved hjelp av Taqman revers-transkripsjon reagenser (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. CDNA ble fortynnet og kvantifisert for uttrykk PKR med real-time RT-PCR (SYBR Grønn I) (utført av Ziren Research LLC, Irvine, CA). En enkelt standard ble tatt med for å bestemme den absolutte forholdet av ekspresjon av hvert mål og referanse-genet, som tidligere beskrevet [23]. Primersekvensene for PKR var som følger: fremover, 5′-TCTTCATGTATGTGACACTGC-3 «, og omvendt, 5′-CACACAGTCAAGGTCCTT AG-3»
immunhistokjemisk farging og evaluering
Antistoffene brukt. for Western blot-analyse ble også anvendt for immunhistokjemisk farging. Formalinfiksert og parafininnstøpte vev histologiske seksjoner (5-um tykke) ble deparaffinized, hydratisert og oppvarmet i en dampkoker i 10 minutter med 10 mmol /l natriumcitrat (pH 6,0) for antigen gjenfinning. Peroksidase ble blokkert med 3% H
2o
2 i metanol ved romtemperatur i 15 min, etterfulgt av inkubering i 10% bovint serumalbumin i TBS-T i 30 min. Objektglassene ble deretter inkubert med primært antistoff ved 1:100 fortynninger i 65 minutter ved romtemperatur. Etter å ha blitt vasket med PBS, ble platene inkubert med biotin-merket sekundært antistoff i 30 min. Til slutt ble prøvene inkubert med streptavidin-peroksidase ved en 1:40 fortynning i 30 minutter. Prøvene ble deretter farget med 0,05% 3 «, 3-diaminobenzidin tetrahydroklorid fremstilt i 0,05 mol /l Tris-buffer (pH 7,6) inneholdende 0,02% H
2o
2 og deretter motfarget med hematoksylin. Som en positiv kontroll ble formalin-fiksert og parafininnstøpte lungevev med normale bronchial epitel anvendt. Som en negativ kontroll ble vevsprøver ikke er inkubert med det primære antistoff som brukes. Immunhistokjemisk farging ble kvantifisert ved to uavhengige patologer (DRS. Raso og Pataer) med en fire-verdi intensitet beskrevet tidligere [1].
Statistical Analysis
Median ble brukt som cutoff point for p-PKR og p-eIF2a. Biomarkørene ble dikotomisert til lav- og høy-nivå grupper som følger: p-PKR: lav (score≤70), høy (poengsum 70); og p-eIF2a: lav (score≤150), høy (poengsum 150). I univariat analyse, uavhengig prøve
t Hotell og
X
2
tester ble brukt til å analysere kontinuerlige og kategoriske variabler, henholdsvis. Overlevelse sannsynlighet som en funksjon av tiden, ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier-estimator. Den log-rank test ble brukt for mellom-gruppe sammenligninger av pasientens overlevelse. Den Cox modellen ble brukt til å beregne påvirkning av p-PKR og p-eIF2a uttrykk på overlevelse, med justeringer som er gjort for kliniske og histopatologiske parametre (alder, kjønn, røykestatus og tumor histologisk undergruppe. De to-sidig test var brukes til å teste lik andel mellom grupper i to-veis krysstabeller Den generalisert estimere ligning tilnærming ble brukt til å beregne forskjeller i middel for data Statistisk signifikans ble satt til P … 0,05
Takk
Vi takker Markeda Wade for redaksjonell vurdering. Vi takker Denise M. Woods og Lakshimi Kakarala for deres teknisk assistanse.
