Abstract
Epitelial celleadhesjonsmolekyl (EpCAM), en kreftstamcelle (CSC) markør er over uttrykt i epiteliale kreftformer og i retinoblastom (RB ). Vi fabrikkert en EpCAM målretting aptamer-siRNA chimera og undersøkt sin anti-tumor eiendom og EpCAM intracellulært domene (EpICD) mediert signalering i epithelial kreft. Den anti-tumor effekt av EpCAM aptamer-siEpCAM kimær (EpApt-Siep) ble evaluert ved qPCR, nordlig og Western blotting i WERI-Rb1- RB cellelinje, primære RB-tumorceller og i MCF7- brystkreftcellelinje. Anti-tumor aktivitet av EpApt-Siep ble studert
in vivo
hjelp epithelial kreft (MCF7-) mus xenograft modell. Mekanismen og trasé som er involvert i anti-tumor aktivitet ble ytterligere undersøkt ved hjelp av protein matriser og qPCR. EpApt-Siep chimera ble behandlet
in vitro
av dicer enzymet. Behandling av WERI-RB1 og MCF7 celler med EpApt-Siep viste statistisk signifikant nedregulering av ekspresjon EpCAM (P 0,005) og samtidig reduksjon i celleformering. I primær RB celler dyrket fra RB svulster, EpApt-Siep forstummet EpCAM, betydelig hemmet (P 0,01) celleproliferasjon og indusert cytotoksisitet. Knockdown av EpICD uttrykt i RB primære svulster førte til undertrykkelse av pluripotency markører, SOX2, OCT4, Nanog, og CD133.
In vivo
studier viste fullstendig tumorvekst regresjon uten toksisitet hos dyr (P 0,001) og tumorvev viste signifikant nedregulering (P 0,05) av EpCAM, MRP1, ABCG2, stathmin, Survivin og oppregulering av ATM ( P 0,05) som fører til apoptose av indre vei med mindre endring i cytokiner. Våre resultater viser at EpApt-Siep potensielt utrydde EpCAM positive kreftceller gjennom CSC markør undertrykkelse og apoptose, mens sparsom normal EpCAM negative tilstøtende celler
Citation. Subramanian N, Kanwar JR, Kanwar RK, Sreemanthula J, Biswas J , Khetan V, et al. (2015) EpCAM Aptamer-siRNA Chimera Mål og regress epithelial kreft. PLoS ONE 10 (7): e0132407. doi: 10,1371 /journal.pone.0132407
Redaktør: Vittorio de Franciscis, Consiglio Nazionale delle RICERCHE (CNR), ITALIA
mottatt: 8 oktober 2014; Godkjent: 14 juni 2015; Publisert: 15.07.2015
Copyright: © 2015 Subramanian et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er tilgjengelige i papiret. I tillegg er rå bilder som brukes for montering tall avsatt i Figshare. (Lenke: figshare.com/s/cb264ee0178b11e5be5906ec4b8d1f61)
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av BARC av 2010/35/19 /BRNS og delvis fra Institutt for bioteknologi- Indo-australske innvilges BT /Indo-Aus /06/08/2011 og COE-Grant BT /01 /CE1B /11 /V /16-programmet støtte på RB
Konkurrerende interesser.: forfatterne hevder at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Epitelial celleadhesjonsmolekyl (EpCAM) er en velkjent kreft stamceller (CSC) markør uttrykt på celleoverflaten og regnes som en svulst assosiert antigen [1]. EpCAM er over-uttrykt i epiteliale tumorer slik som brystcancer og barndom øye kreft så som Retinoblastoma (RB) [2-4]. EpCAM er assosiert med økt proliferasjon, migrering og invasjon i både brystkreft og RB [5, 6] .EpCAM proteinet blir differensiert i ekstracellulære domene (EPEX), transmembrandomene (EpTM) og intracellulært domene (EpICD). Det spiller en viktig rolle i onkogene signalisering av EpCAM proteolyse og EpICD trans inn i kjernen [7, 8] .Proteolysis av EpCAM fører EpICD å danne komplekse withFHL2, β-catenin og Lef1. Dette komplekset binder til theLef1 binding stedet av målgener og modulerer deres transkripsjon [7] .EpICD er kjent for å okkupere promoter-regionen og positivt regulere SOX2, OCT4 og Nanog som bidrar til selvfornyelse og pluripotency av kreftceller [9].
EpCAM er ansett som en ideell terapeutisk mål for behandling av kreft på grunn av forskjellen i sin romlige fordeling mellom normale og kreftceller. EpCAM er overuttrykt i den apikale overflate av tumorcellene [10] og minimal i den basolateral overflaten av normale epitelceller og mutasjoner har ikke blitt beskrevet i EpCAM hittil i kreftceller [11]. Flere anti-EpCAM antistoffer som edrecolomab og adecatumumab ble generert for å målrette kreft og undersøkt i kliniske studier [12]. For ytterligere å forbedre den terapeutiske potensialet av EpCAM målretting, ble aptamerer med større spesifisitet og høyere affinitet søkt [13].
aptamerer er syntetisk oligonukleotid (RNA /ssDNA) eller peptid-molekyler som bindes til et bestemt mål med høy affinitet på grunn av deres tredimensjonale strukturer [14]. De er syntetisert fra store molekylære bibliotekene ved en utvelgelsesprosess som kalles «Systemisk utviklingen av ligander ved eksponentiell berikelse» (SELEX) [15, 16]. Både RNA- og ssDNA aptamerer ble utviklet mot celleoverflate EpCAM [13, 17]. Siden EpCAM RNA aptamer ble vist å bli internalisert ved endocytose, vil det være i stand til å levere siRNA inn i cellen ved chimerization. Flere aptamer-siRNA chimerization strategier ble undersøkt for å målrette kreftceller. RNA aptamerer mot overflatemarkører som PSMA, EGFR, BAFF-R, inte og DNA aptamer mot nucleolin ble rapportert for å levere siRNA i ulike kreftmodeller (oppsummert i S1 tabell).
Funksjonaliteten aptamer-siRNA kimære konstrukter kan forklares i tre trinn slik som (i) binding og internalisering, (ii) dicer prosessering og (iii) RNAi mediert lyddemping [18]. Tidligere har vi demonstrert spesifikk målretting av RB ved hjelp av aptamer-doxorubicin (EpDT3-DOX) som binder celleoverflaten EpCAM for å levere doksorubicin [19]. Her for første gang, har vi bygget EpCAM RNA aptamer-EpCAM siRNA chimera (EpApt-Siep) for å oppnå målrettet EpCAM genet Slå i EpCAM positive celler. Vi rapporterer også for første gang at EpICD er over-uttrykt i RB, og slå ned EpCAM fører til nedregulering av CSC markører som SOX2, OCT4 og Nanog uttrykk. Vi har også utført
in vivo
studier med xenograft modell i naken mus med MCF7- brystkreft cellelinje, som et bevis på konseptet for faste epiteliale kreftformer som uttrykker EpCAM. Høy anti-tumor aktivitet ble oppnådd ved hjelp av vår EpApt-Siep kimære konstruksjon uten toksisitet. Videre studerte vi mekanismen som er involvert i celledød og inhibering av celleproliferasjon i tumorxenografter ved å undersøke de komplette apoptotiske og cytokiner molekyler ved hjelp av protein-arrayer.
Metoder
Fremstilling av kimære konstruksjon og
in vitro
dicer cleavage analysen
EpApt-Siep ble konstruert som beskrevet i Dassie
et
.,
al
. 2009 [20]. Den sekundære strukturen til konstruksjonen ble studert ved RNA-struktur v5.3 [21] og Mfold programvare [22]. De designede konstruksjonene ble kommersielt syntetisert av Dharmacon Inc. (GE biovitenskap, Lafayette, CO).
In vitro
dicer analysen ble utført for å vise at EpApt-Siep chimera blir behandlet av dicer enzym for utgivelsen av siRNA fra kimære aptamer hjelp rekombinant dicer kit (rekombinant human dicer Enzyme Kit Cat No: T510002) etter produsentens anvisninger. De reagerte produkter ble elektroforese og analysert ved hjelp av UV transilluminator (detaljert protokoll gitt i S1 File).
Cellelinjer og hoved RB cellekultur og aptamer opptak studie
Menneske RBcell linje (WERI-RB1) , brystkreft cellelinje (MCF7-) kjøpt fra Riken cell bank, Riken Bioresource Senter (Ibaraki, Japan) ble inkludert i studien. Cellelinjer var fri for mycoplasma forurensning, som bekreftet ved utkikk etter Mycoplasma kit (Sigma Aldrich, Bangalore). MCF7 andWERI-RB1 celler ble dyrket i Dulbeccos modifikasjon av ørnen media (DMEM) og Rosewell Park Memorial Institute media (RPMI-1640) mediarespectively med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Life-teknologi, Bangalore, India). Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i en 5% CO2 incubator.RB tumorprøver fra utskrapte øynene kuler ble samlet opp som en del av terapien og anvendes for forskningsformål anonymt. En generell skriftlig samtykke er innhentet fra foreldre /foresatte til pasienten gjennomgår enucleation. Studien ble utført i henhold til erklæringen av Helsinki, på Vision Research Foundation, etter å ha innhentet godkjenning fra etikk Sub-Committee (Institutional Review Board) av Sankara Nethralaya øye sykehus [Etisk klaring. Nei. 240-2010-P]. Primære RB-tumorceller oppnådd fra de utskrapte øynene ble dissosiert ved manuell triturering, og dyrket i RPMI-medium inneholdende 20% FBS. RPMI og DMEM media ble kjøpt fra Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, Bangalore, India). Opptak av FITC-merket EpApt-Siep av MCF7- og WERI-RB1 celler ble undersøkt ved hjelp av flowcytometri og fluorescerende mikros følgende protokoll gitt i S1 File.
In vitro
effekt av EpApt-Siep i celle linjer
effekten av EpApt-Siep ble evaluert
in vitro
hjelp MCF7- og WERI-RB1 cellelinjer. Kort, 2X10
5 celler ble behandlet med EpApt-Siep eller transfektert med siEpCAM for 48t, RNA isolering etterfulgt av Nord-blot, qPCR for mRNA analyse og Western blotting for protein nivåer (S1 File).
kvantitativ real-time PCR, nordlige og Western blotting
for å analysere effekten av siEpCAM og EpApt-Siep på EpCAM uttrykk, ble qPCR og nordlige blotting utført ved hjelp av total RNA. qPCR ble utført ved å normal målgenet p-2-microgloublin (B2M) ved SYBR grønn basert metode å bruke primer sekvenser som er oppført i S2 tabell. Northern blotting ble utført ved electrophoresing den totale RNA i formaldehyd agarosegel, transblottet ved hjelp av SSC-buffer, probet med biotin-merket anti-sense EpCAM RNA probe og utviklet ved bruk av kjemiluminescens-metoden. Western blotting ble utført for å analysere EpCAM proteinnivået ved hjelp av standard protokoll med anti-EpCAM (c-10) antistoff (detaljert protokoll gitt i S1 File).
Immunohistochemistry
Immunohistochemistry (IHC) var utføres ved hjelp Novolink polymerregistreringssystem (Leica Biosystems, Bangalore, India) følge instruksjonene gitt av produsenten å bruke de-paraffinized human RB vevssnitt. I korthet antigen gjenfinning ble gjort ved hjelp av trykkoker metode, så vev peroksydase blokkering og primær blokkering ble utført, etterfulgt av inkubasjon med anti-EpICD antistoff (IMGENEX, India). Polymer basert gjenkjenning ved bruk av DAB kromogen ble gjort, tørket lysbilder ble montert og scoret for uttrykket nivåer (detaljert protokoll gitt i S1 File).
MTT celleproliferasjonsanalyse
like mange MCF7 og WERI -Rb1 celler (10.000 per brønn) ble sådd ut henholdsvis i en 96-brønners plate. Etter 24 timer ble cellene behandlet med 400nm aptamer-siRNA chimera. Cellene ble også transfektert hjelp lipofektamin 2000 (Invitrogen Lifescience, Bangalore, India) med 200nm EpCAM siRNA (Qiagen, Tyskland). De behandlede cellene ble inkubert i 48hat 37 ° C i 5% CO2-inkubator. Etter 48 timer, ble MTT (Sigma Aldrich, Bangalore, India) i friskt medium tilsatt til cellene og inkubert i 4 timer. De dannede krystaller ble oppløst i DMSO og absorbansen ble avlest ved 570 nm ved hjelp av Spectramax spektrofotometer.
In vivo
anti-tumor effekt av EpApt-Siep i epitelial kreft xenograft modell
å studere
in vivo
effekt av EpApt-Siep, MCF7, ble epitelial kreft modellen som er valgt siden
in vitro
effekt var bedre enn WERI-Rb1 cellelinje. Denne studien ble utført i lokalene til Syngene International Pvt. Ltd., kommersielt. Alle dyrene ble behandlet på en måte for å minimalisere eller eliminere smerte og lidelse ved hjelp av isofluran basert bedøvelsen. Dyr omsorg var i samsvar med anbefalingene fra komiteen for formålet med kontroll og tilsyn med dyreforsøk (CPCSEA), Government of India og Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). The «Form B» for å gjennomføre dyreforsøk ble gjennomgått og godkjent av Syngene International Pvt. Ltd, Institutional Animal Ethics Committee (IAEC protokoll Godkjenning: Syngene /IAEC /430 /10-2013). Dyrene ble opprettholdt under kontrollerte og aseptiske tilstand og utstyrt med maiskolber, RO vann autoklaveres ad libitum og med lys /mørke syklus av 12h hver. MCF7cells ble suspendert ved en konsentrasjon på 5×10
6cells i 200 ul serumfritt medium inneholdende 50% av Matrigel og injisert subkutant på baksiden av atymiske nakne-Foxn1
nuovariectomized hunnmus av 7-8 uker gamle implantert med 17β- østradiol pellets. Når svulstene ble håndgripelig, ble dyrene tilfeldig gruppert basert på tumorvolumet (TV≈80mm
3) og dosering ble igangsatt. Behandlingen tidsplanen følges er gitt i S3 tabell. Den kroppsvekt og tumorvolum ble målt en gang hver tredje dag og% forandring i kroppsvekt ble beregnet. Under offer, ble blod samlet etter isoflurananestesi fra alle grupper for klinisk vurdering av leverfunksjon (ASAT, ALAT) nyrefunksjon (BUN, Urea), perifert blodutstryk for differensial leukocytter telling. Tumor vev og organer ble skåret ut og analysert histo-patologisk ved haemotoxylin og eosin farging.
Protein array for apoptotiske markører og cytokiner
Proteome profilering ble utført for å studere mekanismen av EpApt-Siep konstruere mediert anti-tumor-aktivitet og å studere dets virkning på apoptose angrep og inflammatorisk respons. Protein arrays-menneske apoptose matrise, katalog # ARY009 og mus cytokin rekke panel En katalog # ARY006 (R
in vitro
dicer mediert behandling og cellulært opptak
EpCAM aptamer siRNA chimera ble fabrikkert følge tidligere optimalisert strukturer PSMA aptamer siRNA kimære konstruksjon [20]. I forrige undersøkelse, stem og sløyfe aptamer chimera med strand swap utstilt bedre lyddemping i forhold til de andre kimære former. Derav i denne studien, fabrikkert vi aptamer chimera ved å utvide aptamer sekvens med siRNA sekvens på sitt 5’end og 3’end. Den fabrikkerte EpApt-siRNA gjennomført siRNA rettet mot EpCAM. Stammen og løkke struktur ble manuelt laget ved å inkorporere siRNA sekvens målrettet mot EpCAM. I tillegg aptamerer-siRNA utført nuklease-resistente modifikasjon (2’F) i pyrimidiner. Den 5’end av aptamer var slutten merket med FITC å overvåke aptamer binding og opptak av celler og 3’end av aptamer næret to uridine overheng som hjelpemidler i anerkjennelse og lasting av dicer enzym [23]. Den EpApt og konstruerte aptamer kimære strukturer ble spådd å bruke RNA struktur v5.3 og Mfold og presentert i figur 1A og 1B. De EpApt hjelpemidler i å binde seg til EpCAM, intern og slipper inn i celle cytoplasma. Den EpApt-Siep under påvirkning av dicer, generates21bp siRNA som laster inn i RISC-komplekset, arrangerer hemming av oversettelse av EpCAM mRNA cleavage.
A. EpCAM aptamer sekundær struktur prediksjon fra Mfold online. B. EpCAM aptamer siRNA kimære konstruksjon bærer siRNA rettet mot EpCAM (EpApt-Siep) er foldet hjelp Mfold online og aptamer er angitt i blå boks og siRNA inne røde boksen. C. EpCAM aptamer siRNA chimeriske konstruksjon ble inkubert med det rekombinante dicer enzymet ved 37 ° C i 18 timer. Reaksjonene ble utført uten dicer som kontrollreaksjonen. Polyakrylamidgelelektroforese av reaksjonene med og uten dicer enzym ble kjørt på 15% gel og farget med EtBr. Den behandles 21bp siRNA og ubehandlet konstruere ble observert. D. EpCAM aptamer siRNA chimeriske konstruksjon ble tilsatt til WERI-RB1 og MCF7 celler i bindingsbuffer og analysert ved strømningscytometri. Overlegget Grafen viser opptak av kimære aptamer. E. Sprednings plott som viser opptaket av EpApt-Siep av RB-cellelinjen, WERI-RB1 og RB primære tumorceller. F. EpCAM aptamer siRNA chimeriske konstruksjon ble tilsatt til primær RB-celler i medium uten serum i 2 timer ved 37 ° C etterfulgt av vasking med 1 x PBS. Mikroskopiske bilder ble tatt på 20X objektiv under fase og FITC kanaler med kontrollceller alene og celler med EpApt-Siep. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger uavhengig med lignende resultater. ** P-verdi på 0,01 til 0,001; * P-verdi fra 0,05 til 0,01.
For funksjonaliteten syntetisert EpApt-Siep er nødvendig dicer anerkjennelse. Dette ble testet ved å utføre
in vitro
dicer cleavage analysen. Den EpApt-Siep konstruksjonen ble inkubert med rekombinant human dicer i 18 timer og deretter underkastet elektroforese på agarosegel. Resultatene viste 21bp og 19merproducts tilsvarer henholdsvis siRNA og aptamerer (S1 fig). Dette ble ytterligere bekreftet ved å kjøre en ikke-denaturerende PAGE, ble spaltede fragmenter av ~ 20-22bp lengde oppnådd (figur 1C). Vi har videre forsøkt å undersøke stabiliteten av konstruksjonen under fysiologiske betingelser etterligne. Konstruksjonen resulterte i minimal nedbrytning ( 10% degradering) til 72 timer i media uten og med henholdsvis 10% FBS. Konstruksjonen i 100% FBS var stabil til 96h, selv om en liten degradering var tydelig på 48t varighet. Dermed konstruerer kan være stabil under fysiologiske ligne forhold till 72h (S1A figur).
cellulært opptak studier av EpApt-Siep er nødvendig for å underbygge den internalisering av aptamer gjennom reseptor endocytose. Den EpCAM aptamer (EpDT3 /EpApt) har allerede blitt belyst for reseptoren endocytose [13] .Earlier studier og studien anvendes EpCAM krafse aptamer (ScrApt), med 2’OMe endring i EpApt ryggraden hindrer binding til EpCAM [13 , 19]. Ligner på EpApt-Siep ble ScrApt chimera (ScrApt-Siep) konstruert. Den ScrApt-Siep ved chimerization resulterte i ikke-spesifikk binding til MCF7-celler (S1B fig) og ikke undersøkt videre. Vi fant høyere cellulært opptak av EpApt-Siep konstruere i MCF7- enn WERI-Rb1cells (fig 1D). Den primære RB celler og WERI-Rb1 cellelinjen viste opptak av chimera. De primære RB-celler ble funnet å utvise høyere bindingseffektivitet enn cellelinjer, på grunn av høyere nivåer av ekspresjon EpCAM i tumorer (figur 1E). Fra de mikroskopiske undersøkelser 75% av primær RB celler viste opptak av EpApt-Siep (Fig 1F).
EpApt-Siep stiller EpCAM spesielt i cellelinjer og primære RB kreftceller
målet spesifikk levering, siRNA generasjon og lyddemping evne ble undersøkt ved hjelp av WERI-RB1 og MCF7 cellelinjer. Siden uttrykket nivået av EpCAM er høyere i MCF7-celler enn WERI-RB1 [24], den chimeriske konstruksjon ble først evaluert for den stanse av EpCAM i MCF7-celler. De nordlige blotting Resultatene viste kneble av EpCAM ca 40% i EpApt-Siep behandlede celler og rundt 25% i Siep transfekterte celler normalisert til 28S rRNA (Fig 2A og panel rett til det). En kvantitativ analyse av mRNA ekspresjon ved qPCR viste bedre inhibering av ekspresjon EpCAM, -1,8 og -3,4 fold nedregulering (73% og 90% hemming av mRNA-ekspresjon) i MCF7 cellelinje (P 0,01) og -1,4 og -1,0 fold nedregulering (63% og 51% hemming av mRNA-nivåer) i WERI-Rb1cell linje (P 0,05) (figur 2B). Den EpCAM downregulation ble også observert på proteinnivå (figur 2C), WERI-RB1 celler utstilt 47% og 43% og MCF7- utstilt 65% og 49% av nedregulering av EpCAM protein (P 0,05) (figur 2D). De ubehandlet nordlige og vestlige blotter er vist i S2 File.
A. De EpCAM mRNA nivåer ble oppdaget fra total RNA av kontroll, Siep og EpApt-Siep behandlet MCF7 celler ved Nord-blotting. Det totale RNA ble elektroforert i formaldehyd agarosegel-elektroforese, blottet og utviklet ved kjemiluminescens basert metode. EpCAM målretting siRNA ble anvendt for syntetisering av probe. På sin rett, ble det densitometry analyse av bandene utført ved hjelp ImageJ programvare og plottet som graf med% mRNA uttrykk mot 28S rRNA. B. EpCAM mRNA nivåer ble kvantifisert ved SYBR grønn basert qPCR fra cDNA av kontroll, Siep og EpApt-Siep behandlet WERI-RB1 og MCF7 celler. C. Western blotting ble utført på Siep transfektert og EpApt-Siep behandlet WERI-RB1 og MCF7 celler for EpCAM og b-tubulin. EpCAM målretting siRNA ble anvendt for syntetisering av probe. D. densitometry analyse av de vestlige blotting båndene ble utført ved hjelp av ImageJ programvare og plottet som graf med% protein (EpCAM) uttrykk normalisert til p-tubulin. E. Andelen celleproliferasjon ble kvantifisert ved å utføre MTT-analyse på kontroll, Siep transfektert, EpApt-Siep, EpApt og ScrApt behandlet WERI-RB1 og MCF7 celler. Grafen viser% celleproliferasjon normalisert til kontrollceller. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger uavhengig med lignende resultater. ** P-verdi på 0,01 til 0,001; * P-verdi fra 0,05 til 0,01.
Effekten av kimære konstruksjon ble testet i RB primærtumorceller for å kneble. Den funksjonelle /metabolske activityof primære celler wasevaluated bytransfecting pGFP plasmid. 24 timer etter transfeksjon fleste cellene viste meget høy ekspresjon (fig S2A). Dette bekreftet metabolsk aktiv tilstand av de primære celler, vi deretter søkt å analysere effekten av EpApt-Siep og Siep på disse cellene. Den primære kreftceller viste hemming av EpCAM uttrykk ved -0,5 fold og -2,4 fold i siRNA og kimære konstruksjon behandlede celler henholdsvis (S2B fig). Den cellulære cytotoksisitet målt ved hjelp av LDH-analyse viste 37% og 35% økning i LDH-aktiviteten ved lyddemping av EpCAM ved hjelp av siRNA og EpApt-Siep. Den EpApt-Siep konstruere signifikant (P 0,01) downregulated EpCAM mRNA nivåer og forårsaket cytotoksisitet i primær RB tumorceller (S2C Fig). Den celleproliferasjon som en lest ut av metabolsk aktivitet ble målt ved MTT-analyse. TheWERI-RB1 og MCF7 celler viste signifikant celledeling hemming med EpApt-Siep, mens EpApt eller ScrApt alene ikke viser noen effekt på celleproliferasjon (Fig 2E)
EpICD i primær RB svulster. Regulering av kreft stammen cellemarkører
EpCAM har vist seg å være overuttrykt i kreftceller initiere eller kreft progenitor /stamceller (CPC /cscs) [25-27]. Mekanismen bak dette hotellet ble regulert av intramembrane proteolyse av EpCAM fører til EpICD utgivelsen og fortrenge til Nucleus [7] .Vi rapportert tilstedeværelse av EpCAM tidligere i 2004, og i denne studien vi søkt å studere uttrykket av EpICD i primær RB tumorer [28]. IHC Resultatene viste intens nukleær farging og intensiteten av nukleær farging varierte mellom tumorene som ble studert. Tumorene viste 40-60% av cellene positive og noen tilfeller viste 70-80% av cellene var positive for nukleær farging. Den normale netthinnen undersøkt viste ingen tydelig nukleær farging (fig 3A). Intensitet og den prosentvise fordelingen av EpICD positive celler i tumoren er presentert i tabell 1.
A. Immunohistokjemi av den normale netthinnen snitt som viser ingen tydelig EpICD i kjernen, RB vevssnitt viser intens farging av cellekjernen. Ekspresjon av EpICD ble majorly observert i kjernen av tumorcellene som er vist med hvite piler. B. ganger endring i mRNA nivåer av SOX2, ble OCT4, Nanog, CD44S, CD133 og Survivin (BIRC5) kvantifisert ved SYBR grønn basert qPCR fra Siep og EpApt-Siep behandlet WERI-Rb1 celler og normalisert til p-2-mikroglobulin som husholdningsgenet. C. ganger endring i mRNA nivåer av SOX2, ble OCT4 og Nanog kvantifisert ved SYBR grønn basert qPCR fra Siep og EpApt-Siep behandlet MCF7 celler og normalisert til p-2-mikroglobulin som housekeeping gene.Data representerer gjennomsnitt ± SD. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger uavhengig med lignende resultater ** P-verdi fra 0,01 til 0,001.; * P-verdi fra 0,05 til 0,01.
Den frigjorte EpICD danner kjerneproteinkompleks ved å samhandle med den FHL2, β-catenin og Lef1 formidler genet transkripsjoner og hjelpemidler i celleproliferasjon. Reguleringen av EpICD på uttrykk for pluripotency markører ble rapportert tidligere [9], og vi var interessert i å studere modulering av EpCAM bak uttrykk for OCT4, SOX2, Nanog, CD133, CD44s. Vi i tillegg studert uttrykk for Survivin nivåer ved å stanse all EpCAM i RB cellelinje, WERI-RB1. EpCAM stanse hjelp av siRNA transfeksjon eller EpApt-Siep viste høyere nedregulering av SOX2, OCT4 og Nanog i siRNA transfekterte celler sammenlignet med EpApt-Siep, mens CD133, CD44s og Survivin nivåer ble mer nedregulert i EpApt-Siep transfekterte celler (fig 3B ). Vi i tillegg studert uttrykk for SOX2, OCT4 og Nanog i MCF7 celler og fant nedregulering av SOX2 og Nanog men ikke OCT4 på å kneble EpCAM hjelp siRNA eller EpApt-Siep konstruere (Fig 3C). Dermed var vi i stand til å belyse regulering av stamcellemarkører ved EpCAM gjennom EpICD
EpApt-Siep regress brystkreft.
In vivo
xenograft studie
Den anti-tumor effekten av EpApt-Siep ble undersøkt ved hjelp av brystkreft
in vivo
modell. MCF7 celler ble injisert i bilateralt ovariectomized nakne mus supplert med ekstern østrogen. Doseringen av EpApt-Siep ble utført på alternative dager fra day0 til day14 og på day20 ble dyrene dosert, 24 timer senere n = 4 ble ofret fra hver gruppe. Tumorvekstkinetikken viste signifikant reduksjon (P 0,01) i tumorvolum, viste bærerkontroll 584mm
3, mens det behandlede dyr viste 52 mm
3 betyr tumorvolum. Resten av n = 4 i bilen kontrollgruppen og EpApt-Siep gruppe ble dosert på day22 og day24, videre studert til day33. Gjennomsnittlige tumorvolumer på day33, for kjøretøy kontrollgruppe og EpApt-Siep var 922mm
3 og 64mm
3 hhv. Den tumorvekst profil for begge gruppene i løpet av denne perioden er vist på figur 4A. Det% tumorvekstinhibering (TGI) for EpApt-Siep gruppe ved den testede dosenivå ble funnet å være 102% (Day33,
#indicates p 0,001). På day33, ble musene (figur 4B) avlivet og tumorene skåret ut (figur 4C), etterfulgt av analyse av ekspresjonen av EpCAM og kreft stamcelle markører, apoptotiske maskin og medikament-resistente proteiner ble utført.
tumorvekst kinetikk MCF7- Xenotransplantat behandlet med EpApt-Siep. Kvinne naken mus (Hsd: atymiske nakne-Foxn1
nu, bilateralt ovariektomiserte) holder til i Individuelt Ventilerte Bur (IVCs) ble brukt til å se nærmere. Den tumorgenisitet av MCF7-celler i mus er østrogenavhengig. Tjue timer før MCF-7 celleinjeksjon, dyr ble implantert med 17p-østradiol pellets (0.36mg /pellet, 60-dagers utgivelse; nyskapende forskning of America, Sarasota, FL) i ryggskulderblad regionen i mus ved bruk trochar. MCF-7-tumorceller (5 x 10
6 celler /dyr) ble injisert subkutant i flankene av dyrene. Etter 7-10 dager etter injeksjon av cellene, ble dyrene randomisert basert på tumorvolum (TV≈80mm3) og doseringen ble påbegynt. Grafisk fremstilling som viser (A) Tumor volum av kjøretøyet kontrollgruppen injisert med PBS subkutant nær tumorstedet, EpApt-Siep injisert subkutant nær tumorstedet på alternative dager. De oransje piler indikerer EpApt-Siep injeksjoner gitt og den blå stjernen angir dag av offer. På dag 21 og 33, på grunn av eksperimentelle og etiske grunner dyrene fra begge gruppene ble avlivet 50% ved hvert tidspunkt. Fotografier av de representative mus (B) og skåret svulster (C) av kjøretøy kontroll og behandlede grupper. D. Endringer i protein uttrykk ved Western blotting av proteiner utvinning fra representanten vev av kontroll mus eller mus behandlet med EpApt-Siep (0.6nmol) og avsluttet på henholdsvis 21 og 33days (på høyre, graf som representerer den relative uttrykket beregnes ved ImageJ programvare. E. kurve som viser endringene i MCF7 xenograft tumorvev EpCAM, CD44s, CD24 og MRP1 mRNA-nivåer etter behandling med EpApt-Siep konstruere. Verdien for bærerkontrollgruppen ble benyttet for å normalisere fold uttrykket og den β-2 mikroglobulin ble anvendt som F. Graf internkontroll. viser endringene i STMN, BIRC5, BCL2, Bax og ATM mRNA nivåer etter behandling med EpApt-Siep aptamer konstruere normalisering ble gjort med både kjøretøy kontroll /ingen behandling gruppe. data representerer gjennomsnitt ± SE for
in vivo
eksperiment (n = 8) og middelverdi ± SD for andre forsøk forsøk ble utført i tre paralleller, og signifikans ble beregnet ved t-test # P .. 0,001; ** P-verdi fra 0,01 til 0,001, * P-verdi fra 0,05 til 0,01.
effekten av EpApt-Siep bygge på uttrykk for EpCAM og andre CSC markører ble undersøkt mellom kjøretøy kontroll og behandlet gruppe (n = 2) tumorsnitt hentet fra day21 og day33 henholdsvis. For å sjekke effekten av EpCAM lyddemping indusert av EpApt-Siep konstruere, ble uttrykket av EpCAM analysert ved Western blot på proteinnivå, ble i tillegg ABCG2 protein inkludert. Den densitometry analyse viste 55% og 60% av EpCAM protein nedregulering i day21and day33 gruppe, mens ABCG2 protein viste 60% og 85% av nedregulering i day21 og day33 henholdsvis i EpApt-Siep behandlede prøvene sammenlignet med vehikkel-kontroll (figur 4D).
