Abstract
Bakgrunn
tilbakefall av tykktarmskreft (CRC) er hyppig i løpet av det første året av kurativ reseksjon kirurgi og kan være uunngåelig. microRNAs har blitt foreslått å spille roller i kreftutvikling og kreft tilbakefall. Vi har nylig identifisert mikroRNA-29C (miRNA-29c) som en prediktor for tidlig tilbakefall i CRC. I denne studien har vi undersøkt videre av funksjoner og serumnivå av miRNA-29C i forhold til tidlig tilbakefall av CRC.
Metoder
Først vi ytterligere bekreftet overekspresjon av miRNA-29C i ikke- tidlige tilbakefall fag. Gain-of-funksjon
in vitro
studier ble brukt for å evaluere effekten av miRNA-29c på celleproliferasjon, migrasjon, invasjon, og cellesyklusprogresjon. Den tykktarmskreft cellelinje Caco2 og en stabil klone overekspresjon miRNA-29c var xenopodet å evaluere
in vivo
effekten av miRNA-29c i null mus. Til slutt ble sirkulerende miRNA-29c forsket som en potensiell biomarkør for å identifisere tidlig tilbakefall.
Resultater
miRNA-29c uttrykk betydelig redusert i løpet av tidlig tilbakefall sammenlignet med ikke-tidlig tilbakefall i UICC stadium II og III CRC pasienter (
P
= 0,021).
In vitro
studier viste at overekspresjon av miRNA-29c hemmet celleproliferasjon og migrasjon. cellesyklus studerer også avdekket at miRNA-29c forårsaket en opphopning av G1 og G2 befolkningen.
In vivo
, miRNA-29c undertrykte tumorvekst i null mus. Serumet miRNA-29c økt betydelig i tidlige tilbakefall pasienter sammenlignet med ikke-tidlige forløpt pasienter (
P =
0,012).
Konklusjoner
miRNA-29c viser anti-tumorigenesis aktivitet, og preoperative sirkulerende miRNA-29C nivåer kan brukes til å forutsi postoperativ tidlig tilbakefall av CRC
Citation. Yang IP, Tsai HL, Huang CW, Huang MY, Hou MF, Juo S-HH, et al . (2013) Den funksjonelle betydningen av mikroRNA-29c hos pasienter med tykktarmskreft: en potensiell Sirkulasjons biomarkør for å forutsi tidlig Relapse. PLoS ONE 8 (6): e66842. doi: 10,1371 /journal.pone.0066842
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 03.12.2012; Godkjent: 10 mai 2013; Publisert: 28 juni 2013
Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Council of republikken Kina (NSC 99-2320 B-037-014-My3); Kaohsiung Medical University Hospital (KMUH98-8I04, KMUH100-OR16); Biosignature i kolorektal kreft, Academia Sinica, Taiwan; og en Excellence for Cancer Research Center Grant finansiert av Department of Health Executive Yuan, Taiwan, Kina (DOH102 TD-C-111-002). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den høye forekomsten og dødeligheten av tykktarmskreft (CRC) utgjør et betydelig folkehelseproblem i verden [1]. Selv kirurgisk fjerning kan være svært effektive for en lokalisert sykdom, 30-40% av pasientene utvikler tilbakefall etter operasjon [2] og 40-50% av tilbakefall åpen løpet av det første året etter første kirurgisk reseksjon [3], [4]. Tiden fra den innledende behandling for utvikling av tilbakefall har blitt rapportert å være sterkt relatert til overlevelse, særlig hos pasienter i løpet av ett år etter kirurgisk reseksjon [5]. Kontinuerlig innsats har blitt gjort for å søke etter enkle og pålitelige metoder /biomarkør for tidlig påvisning av svulster og for CRC prognose for å gi tidlig, tilstrekkelig og effektiv behandling.
En moden mikroRNA (miRNA) er en liten, ikke-kodende RNA som inneholder omtrent 20 nukleotider og kan post-transkripsjonelt regulere ekspresjonen av flere målgener ved samme tid [6]. Den tumorigenesis av CRC involverer flere trinn genomiske forandringer, deriblant aktivering av onkogener og inaktivering av tumorsuppressorgener [7]. mirnas har blitt foreslått å spille roller i utviklingen av kreft, blant annet kreftutvikling, progresjon og tilbakefall [7] – [10]. De fleste publiserte studier har fokusert på vev-baserte miRNA uttrykk [8], [11], [12], og bare noen få studier har undersøkt sirkulerende mirnas hos pasienter med CRC [13] – [15]. Nyere studier har indikert at serumnivåene av visse mirnas kan tjene som potensielle biomarkører for ulike kreftformer [16] – [18]
Vi har nylig brukt en kombinasjon av bioinformatikk og eksperimentelle tilnærminger for å forutsi og validere miRNA-29c. som kandidat biomarkør assosiert med CRC tilbakefall [19]. I denne studien har vi først brukt et stort datasett for å bekrefte forholdet mellom miRNA-29c uttrykk og tidlig CRC gjentakelse. En serie
in vitro
og
in vivo
eksperimenter ble utført for å illustrere den funksjonelle rollen til miRNA-29c i CRC tumorigenesis. Deretter utforsket vi om serumnivået av miRNA-29c kan brukes som en biomarkør for å forutsi tidlig CRC tilbakefall.
Metoder
Pasienter og Prøver
For å unngå mulige påvirkning av neoadjuvant behandling på miRNA uttrykket, ble pasientene ekskludert dersom de hadde gjennomgått neoadjuvant behandling med enten kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. CRC tumorprøver ble innhentet fra 107 pasienter med primær CRC på UICC stadier II /III (56 non-tidlige tilbakefall pasienter og 51 tidlig-residiverende pasienter etter radikal reseksjon). Blant disse 107 pasienter, har miRNA-29c data for 68 pasienter (27 non-tidlige tilbakefall pasienter og 41 tidlig tilbakefall pasienter) er rapportert i vår pervious papir [19]. CRC tidlig tilbakefall ble definert som lokalt tilbakefall eller fjernmetastaser som forekommer i løpet av 1 år etter radikal reseksjon [5], [20], [21], og de pasientene som fikk tilbakefall etter det første året og ikke opplever tilbakefall i løpet av tiden for undersøkelsen var klassifisert i den ikke-tidlig tilbakefall gruppe. Fordi CRC tilbakefall i fase I er relativt lav, og pasienter med stadium IV CRC allerede har metastatisk enheter [19], [20], denne studien rekrutterte bare CRC pasienter stadium II og stadium III. CRC vev ble raskt frosset i flytende nitrogen etter kirurgisk reseksjon. Serumprøver fra 61 CRC pasienter med primær CRC på UICC stadier II /III (41 non-tidlig tilbakefall og 20 tidlig tilbakefall pasienter) før de fikk operasjonen ble samlet og serum miRNA-29C ble målt. Serum miRNA-29C nivåer ble også målt i 23 friske forsøkspersoner (14 kvinner og 9 menn). Både serum og CRC tumorprøver ble erholdt fra 38 pasienter i denne studien. Alle fag var urelaterte etniske kinesere bosatt i Taiwan. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hvert fag for å samle sine kliniske prøver og å publisere disse tilfelle detaljer og alle pasientdata ble anonymisert. Studien protokollen ble godkjent av Kaohsiung Medical University Hospital Institutional Review Board (Protocol Antall: KMUH-IRB-990343)
RNA utdrag fra Tissue
Om lag 100 mg hver vev ble homogenisert ved hjelp. en benk-top homogenisator (Polytron PT1600E, Kinematica AG, Lucerne, Sveits) og total RNA, inkludert mRNA og miRNA, ble renset ved hjelp av en Qiagen RNAeasy system (Qiagen, Hamburg,
Tyskland
), i henhold til produsentens instruksjoner.
miRNA-29C uttrykk nivåer i begynnelsen og ikke-tidlige tilbakefall CRC Pasienter
for å måle miRNA-29C uttrykk nivåer, ble miRNA-29c cDNA syntetisert fra 20 ng av total RNA med en unikt primer (Applied Biosystems Inc., California) og TaqMan RT-miRNA qPCR-analyse (Applied Biosystems Inc.) ble benyttet. De relative uttrykk nivåer av miRNA-29c i vev ble normalisert til at av U6b som en intern kontroll ved hjelp av ligningen: log
10 (2
-ΔCt), hvor ΔCt = (Ct
miRNA-29c – Ct
U6b). Gjennomsnitt og standardavvik (SD) verdier av log
10 (2
-ΔCt) ble beregnet.
Cell Culture
Den menneskelige kolon karsinom cellelinje Caco2, Lovo, SW480 og SW620 (ATCC, Manassas, VA) ble dyrket i DMEM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS, Gibco-BRL) og 100 U /ml penicillin [21]. Cellene ble holdt ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2.
Bygging av et plasmid til Over-uttrykk for miRNA-29c
pCDH vektor (System biovitenskap, Mountain View, CA) ble brukt for å vurdere de funksjonelle konsekvensene av miRNA-29c overekspresjon. Vi konstruerte pCDH- miRNA-29c plasmid ved å innføre miRNA-29c PCR-produkt inn i det multiple kloningssted regioner av pCDH. Sekvensene til primerne anvendt for å amplifisere miRNA-29c ble tcctgaattcgaggatgccctggagtattcgg og ctaggcggccgcgcatgatcttccttccctattc. Den fremre primer ble utvidet ved 5 «enden for å inkludere den GAATTC sekvens for å skape en
EcoR1
-restriksjonssete, og den reverse primer ble forlenget i 5′-enden for å inkludere den gcggccgc sekvens for å skape en
Not1
restriksjonssete. Konstruksjonen ble bekreftet ved direkte DNA-sekvensering.
etablering av stabile kloner
Caco2 celler (5 × 10
5) var seeded og transfektert med 400 ng av konstruksjonene (enten den negative egge pCDH vektor eller pCDH-miRNA-29c plasmid) med Lipofectamine 2000 (Invitrogen). De stabilt transfekterte Caco2 celler som inneholder pCDH-NC plasmid (NC: negativ kontroll) eller pCDH-miRNA-29C plasmid (O miRNA-29c: overekspresjon av miRNA-29C) ble valgt over en 4-ukers periode ved hjelp av standard dyrkingsmedium supplert med 12 ug /ml puromycin (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MI). Stabil transfeksjon av plasmider ble bekreftet ved å utføre en MIR QRT-PCR-analyse.
Analyse av Cell Proliferation
Caco2 stabile kloner celler ble sådd og inkubert i 22 timer, deretter ytterligere inkubert i en annen 2 t med 1/10 volum av WST-en reagens (Roche Diagnostics, Corp., Indianapolis, IN) før absorbansen ved 450 nm ble kvantifisert ved hjelp av et spektrofotometer [21].
for ytterligere å undersøke hvilken rolle miRNA -29c i spredning, vurderte vi effekten av miRNA-29C over-uttrykk på veksten av 3 ulike kreftcellelinjer (Lovo, SW480 og SW620). Vi overgang transfektert med-miRNA-29C miRNA (MIR-29c etterligne, Ambion, USA) eller negativ kontroll (NC, Mirvana miRNA etterligne, Ambion, USA) i Lovo, SW480 og SW620 celler. Celler var sådd, inkubert i 22 timer, og deretter ytterligere analysert som beskrevet gjennomtrengelig.
Cell Cycle Analysis
Etter inkubering i 36 timer ble cellesyklusprogresjon kvantifisert ved propidiumjodid (PI, Sigma -Aldrich Co.) farging og etterfølgende analyse på en FACScan cens (Becton Dickinson, NJ) med Cellquest programvare (BD Biosciences), i henhold til produsentens instruksjoner.
analyse av Cell Migration
Cell migrering ble målt ved bruk av Transwell polykarbonat membraninnsatser (Millipore, GmbH, Schwalbach, Tyskland) i 24-brønners plater. Cellene (2 x 10
4) ble sådd ut på 24-brønners millicells og lov til å migrere i 24 timer ved 37 ° C. Innsatsene ble skylt i 1 x PBS, og cellene ble fjernet fra membranene med 1% trypsin i cellekultur lyse-reagens (Promega, Corp., Madison, WI, USA). Cellemigrasjon ble vurdert ved å tallfeste den grønne fluorescens av pCDH vektor som beskrevet tidligere [21].
sårhelende analysen
Etter å danne et monolag, et sår ble opprettet i cellen arket ved manuell skraping med en 200-mL mikropipette tips. Dyrkningsmediet ble så byttet ut, og cellene ble inkubert ved 37 ° C. Sårheling ble overvåket og fotografert på ulike tidspunkter (0, 24, og 48 h) under et mikroskop.
Matrigel invasjonen analysen
Cell invasjonen ble analysert ved hjelp av 24-brønners Transwell permeable støtter ( BD Biosciences, San Jose, CA) med 8-mikrometer pore polykarbonat membran inserts. Cellene (1 x 10
4) ble plassert på det øvre kammer og lov til å invadere i 24 timer. Cell invasjonen ble analysert som beskrevet tidligere [21]
In vivo dyrestudier
Fire uker gamle Balb /c nakne mus (kroppsvekt: 12,6 til 15,6 g). Ble kjøpt fra BioLasco Taiwan Co., Ltd (Taipei, Taiwan) og vedlikeholdes på en bestemt patogen-fritt miljø (sertifikat nr .: 26-99S029). På 6 ukers alder, ble hver naken mus injisert subkutant med 1 × 10
7 Caco2 celler (enten NC eller Omir-29C;
N
= 4 per transfektert cellelinje) i nakken. Tumoren diameteren ble målt, og tumorvolumet (cm
3) ble beregnet ved anvendelse av følgende formel: volum = (lengde x bredde x høyde) /2 [22]. Dyrene ble avlivet 3 uker etter injeksjon av tumorceller, og tumorene ble undersøkt og talt umiddelbart uten forutgående fiksering. Før ofre, en ikke-invasiv bildesystem (Ultra Sensitive Molecular Imaging System Berthold Nightowl, Berthold Technology, Oak Ridge, Tennessee) ble brukt til å spore kreft celler
in vivo Hotell og godkjenne at miRNA-29c overekspresjon plasmider fremdeles var til stede i kreftcellene. Denne bilde strategien gir en ikke-invasiv og ultra metode for påvisning av de transfekterte plasmider som uttrykker GFP. Bruken dyr protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Kaohsiung Medical University (IACUC godkjenning No: 99 052). I tråd med Retningslinjene med omsorg og bruk av forsøksdyr
Serum Forberedelse, RNA Utvinning og miRNA-29c uttrykk nivåer
venøs blod ble innhentet før operasjonen. Blodprøvene ble sentrifugert ved 3000 rpm i 15 min og serumet ble alikvotert inn i 1,7-ml Eppendorf-rør. I fravær av en veldokumentert stabilt uttrykt endogent sirkulerende mirnas å tjene som normalisering kontroller,
C. elegans
syntetisk
lin-4
miRNA (Cel-lin-4, delenummer: 4398988, Invitrogen) som ble lagt til serum forberedelser før RNA ekstraksjon ble brukt som en normalisering kontroll som i tidligere studier [ ,,,0],23], [24]. For RNA isolert fra serum, ble 300 ul serum homogenisert i 900 mL av Trizol LS i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen) med små modifikasjoner: 6 mL av 1 nM Cel-lin-4 ble lagt inn i serumprøver. Deretter ble 250 ul kloroform tilsatt til prøven, og den blandede oppløsningen ble sentrifugert. Etter ytterligere kloroform ekstraksjon og utfelling med isopropanol, ble pelleten vasket to ganger ved sentrifugering med 70% etanol. RNA-pelleten ble tørket i 10 min ved romtemperatur og oppløst i 30 ul destillert vann. DNase-behandling (Qiagen) ble utført for å fjerne eventuelle forurensende DNA.
For å måle miRNA-29C uttrykk nivåer, miRNA-29c cDNA ble syntetisert og TaqMan MIR RT-qPCR analyse ble utført som pervious beskrevet. De relative uttrykk nivåer av miRNA-29c i serum ble normalisert til at av Cel-lin-4 ved hjelp av ligningen: log
10 (2
-ΔCt), hvor ΔCt = (Ct
miRNA-29c – Ct
Cel-lin-4). Gjennomsnitt og standardavvik (SD) verdier av log
10 (2
-ΔCt) ble beregnet.
Statistical Analysis
De kontinuerlige variabler ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) verdier, og de dikotome variabler ble analysert ved Pearsons kji-kvadrat test og presenteres som antall og prosentverdier. Analyse av samvariasjon ble utført ved bruk av JMP (versjon 7.0.1, SAS Institute Inc., Cary, NC) å sammenligne de midlere miRNA-29C nivåer mellom tidlig og ikke-tidlig tilbakefall CRC pasienter. Alder, ble kjønn og stadium av CRC inkludert som covariables i de statistiske modellene. En 2-tailed
P
-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Den statistiske styrken ble beregnet ved hjelp av den elektroniske DSS Forskning Statistiske strømkalkulator (https://www.dssresearch.com/Home.aspx), på følgende basis: ensidige test, en alfa på 0,05, serum av 20 tidlig tilbakefall pasienter og 41 ikke-tidlige tilbakefall pasienter, og de empiriske uttrykk nivåer i hver gruppe.
Resultater
Demografiske data
det som kjennetegner de 107 selvstendige CRC pasienter (56 ikke- tidlig tilbakefall og 51 tidlig tilbakefall pasienter) er oppsummert i tabell S1. De gjennomsnittlige aldre (år) av de tidlige tilbakefall og ikke-tidlige tilbakefall pasientene var 67.20 og 64.90, henholdsvis med utvalget er 24 til 88 år. Informasjon om sykdommen stadium, kjønn og alder på de tidlige tilbakefall og ikke-tidlige tilbakefall pasienter er vist i tabell 1. Tidlig tilbakefall var signifikant assosiert med tumortype og perinevral invasjon (
P
0,05, tabell 2), men alder, kjønn, tumorstørrelse, UICC stadium av pasienter eller histologi distribusjoner var ikke signifikant forskjellig mellom tidlig og ikke-tidlige tilbakefall pasienter (
P
0,05, tabell 2)
Vi har samlet serumprøver fra 61 CRC pasienter (41 ikke-tidlige tilbakefall og 20 tidlig tilbakefall pasienter) før de fikk kirurgi. Karakteristikken av de 61 CRC-pasienter for serumet studien er oppsummert i Tabell S2. Av de 61 pasientene som donerte preoperative serumprøver, CRC tumorprøver var også tilgjengelig for 38 pasienter (30 ikke-tidlig tilbakefall og 8 tidlig tilbakefall pasienter). Derfor både serum og CRC prøver ble samtidig analysert for 38 pasienter i denne studien.
miRNA uttrykk i tidlig og ikke-tidlige tilbakefall Pasienter
De miRNA-29C uttrykk nivåer i 107 CRC svulst prøvene var forskjellig mellom tidlig og ikke-tidlig tilbakefall pasienter. Gjennomsnittet av log
10 (2
-ΔCt) var 0,67 i den ikke-tidlig tilbakefall gruppen og 0,37 i tidlig tilbakefall gruppe (
P =
0,021, fig. 1A). Derfor miRNA-29C nivåene var lavere i prøvene fra tidlig tilbakefall hos pasienter med 2,00 ganger sammenlignet med i prøver av ikke-tidlige tilbakefall pasienter. Dette ligner på vår forrige rapport av en 2,04 ganger endring [19]. Tidlig tilbakefall var signifikant assosiert med perinevral invasjon, tumortype og lavere ekspresjon av tumor miRNA-29c ved univariable og multivariate analyser (tabell 2), men de miRNA-29C-ekspresjonsnivåer ble ikke signifikant assosiert med noen clinicopathological variabel (tabell 3). Derfor er det uttrykk for miRNA-29c en uavhengig prediktor faktor for å detektere tidlig tilbakefall av CRC. Disse resultatene igjen bekrefter våre tidligere data [19], og støtte miRNA-29c som en potensiell prediktor for tidlig tilbakefall av CRC etter operasjonen.
(A) miRNA-29c uttrykk nivåer i 56 ikke-tidlig og 51 tidlige tilbakefall CRC tumorprøver. Uttrykket nivået er betydelig redusert i de tidlige tilbakefall svulster (
P =
0,021). (B) WST-1-analysen viser at miRNA-29c undertrykker tumor celleproliferasjon (
P =
0.006). Omir-29c viser Caco2 celleklon stabilt overekspresjon miRNA-29c, og NC indikerer den negative kontrollen stabil klone. (C) Overekspresjon av miRNA-29c fører til en signifikant akkumulering av celler i G2-fasen (
P =
0,02). Svart: G1 /G0 fase; lys grå: S fase; og mørk grå: G2 fase. (D) Transwell analysen viser at overekspresjon av miRNA-29C undertrykker tumor-celle migrasjon (
P
0,0001). (E) Overuttrykte miRNA-29c påvirker ikke tumorcelle invasjon (
P =
0,349). (F) Overekspresjon av miRNA-29c avtar cellemigrasjon, som indikert ved en åpning av øket bredde i O miRNA-29c i forhold til NC ved 24 og 48 timer. Fotografiene viser hemming av tumorcellemigrasjon ble hentet fra såret healing analysen.
For å klargjøre hvilken rolle miRNA-29c uttrykk i tidlig tilbakefall pasienter, vi videre mot miRNA-29c uttrykk mellom tilbakefall
vs.
ikke-tilbakefall grupper. Sju pasienter av ikke-tidlig tilbakefall gruppe ble tilbakefall etter første året; dermed ble omklassifisert til tilbakefall gruppe. De miRNA-29C uttrykk nivåer mellom tilbakefall og ikke-tilbakefall pasienter og gjennomsnittet av log
10 (2
-ΔCt) var 0,65 i den ikke-residiverende gruppen og 0,43 i residiverende gruppe (
P
= 0,099, fig. ikke vist).
Overuttrykte miRNA-29C Influences celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon
for å undersøke hvilken rolle miRNA-29C i tumorigenesis, vurderte vi effekten av miRNA-29c på veksten av Caco2 celler. Vi etablerte en Caco2 stabil klone (Omir-29c) overekspresjon miRNA-29c. Gjennomsnittlig miRNA-29c nivået i Omir-29C var 0,45 (uttrykt som log
10 (2
-ΔCt)), som var høyere enn gjennomsnittlig nivå av miRNA-29c i negativ kontroll (NC) klone av 2.82-fold. Som vist på fig. 1B, spredning frekvensen av Omir-29c var bare 58,7% av prisen av NC etter 24 timer (
P =
0.006). Fordi noen av de forutsagte miRNA-29c målgener er relatert til cellesyklusprogresjon og cellevekst, vurderte vi hvorvidt miRNA-29c påvirket cellesyklus ved strømningscytometri. Våre data viste at Omir-29c opphopning av G2 cellepopulasjonen betydelig høyere (19,4% i Omir-29c
vs
14,7% i NC,
P =
0,02;. Fig. 1C) svakt økt opphopning av G1 /G0 befolkningen (47,1% i Omir-29c
vs
. 43,1% i NC,
P =
0,43), og redusert opphopning av S- fase befolkningen (33,48% i Omir-29c
vs
. 42.21% i NC,
P
= 0,14). Disse funnene antydet at overekspresjon av miRNA-29c hemmer veksten av tykktarmskreftceller på grunn av redusert S-fasen og indusere G2 arrest.
Ved analyse spredning med overgangen transfektert har-miRNA-29C miRNA (miRNA-29c ligne ) eller negativ kontroll (NC, Mirvana miRNA etterligne) inn Lovo, SW480 og SW620 celler, fant vi at spredning frekvensen av miRNA-29C over-uttrykk celler var signifikant ned til 50,9% (Lovo) og 51,9% (SW480) av frekvensen av NC etter 24 timer (
P =
0,016 og 0,009, henholdsvis fig. S1). Imidlertid formeringshastigheten av SW620 ble ikke vist signifikant forskjellige (ned til 92,4%) i de miRNA-29C over-ekspresjon celler. Følgelig, i tillegg til CaCo2, miRNA-29c vil også undertrykke veksten av tykktarmskreft cellelinjer:. Lovo og SW480, men ikke SW620
Effekter av miRNA-29c Overuttrykte på Cell Migration
dataene fra transwell analyse (fig. 1D) indikerte at Omir-29c vises langsommere migrering enn gjorde NC med 56% (
P
0,0001). Inhibering av migrering ble også evaluert i en sårhelende analyse hvori bredden av såret var 800 um. Bredden av hullene i NC og Omir-29c var 100 og 180 um ved 24 timer, henholdsvis, og var 0 og 100 pm etter 48 timer, henholdsvis. Disse funnene antydet at cellemigrasjon ble betydelig redusert i Omir-29c. Disse analysene viste konsekvent at cellemigrasjon ble dramatisk redusert når miRNA-29C ble overexpressed (Fig. 1F).
Effekter av miRNA-29c Overuttrykte på Tumor Cell Invasion
Dataene fra Matrigel invasjonen analysen viste ingen signifikante forskjeller mellom Omir-29c og NC kloner om deres evne til invasjon. Dette funnet antydet at overekspresjon av miRNA-29c ikke påvirke invasjon av tumorceller (
P =
0,349, fig. 1E).
Effekt av Overuttrykte miRNA-29c i Nude Mice
for ytterligere å validere anti-tumorigenesis effekten av miRNA-29C, undersøkte vi effekten av miRNA-29c overekspresjon på tumorvekst
in vivo
. Etter subkutan injeksjon av Omir-29C og NC-kloner i halsen på nakne mus, tumormasser ble følbar 7 dager etter inokulering og fikk lov til å vokse inntil slutten av tredje uke (fig. 2A). Mus som fikk Omir-29C celler hadde betydelig mindre kreft klumper enn gjorde de som fikk NC celler (
P =
0,018 Fig. 2B og 2C). Dataene fra Ultra Sensitive Molecular Imaging Strategy bekreftet overekspresjon av miRNA-29c i Omir-29c klone 3 uker etter såing kreftceller via påvisning av grønn fluorescens
protein plakater (Fig. 2D). Resultatene fra
in vivo
eksperiment gitt ytterligere støtte det faktum at overekspresjon av miRNA-29C resulterer i en reduksjon av tumor spredning i forsøksdyr.
Omir-29c er Caco2 klone stabilt overekspresjon miRNA-29C, og NC er kontroll stabil klon. (A) Fotografier av null mus subkutant injisert med NC celler (
N =
4, øvre panel) eller med Omir-29C celler (
N =
4, nedre panel) ble tatt 21 dager etter injeksjonen. (B) Tumor klumper var mindre i Omir-29C gruppe (lavere panel) enn i den NC gruppen (øvre panel) etter 21 dager. (C) Svulsten (cm
3) vekstkurver for Omir-29c (- – -, grå) og NC celler (-, svart) over 21 dager (
P =
0,018). (D) Bruke Ultra Sensitive Molecular Imaging Strategy, luciferase aktiviteten i klumper kan skannes uten invasjon fra fotografier av null mus subkutant injisert med Omir-29C celler tatt 21 dager etter injeksjon.
Sirkulasjons miRNA uttrykk i tidlig og ikke-tidlige tilbakefall pasienter
Preoperativ serum miRNA-29C nivåene var signifikant forskjellig mellom tidlig og ikke-tidlige tilbakefall pasienter. Gjennomsnittet av log
10 (2
-ΔCt) var -3,841 i den ikke-tidlig-tilbakefall gruppe og -3,216 i tidlig-tilbakefall gruppe (Fig. 3A). Serum miRNA-29C-nivåer var ikke signifikant forskjellig mellom friske personer gruppe og ikke-tidlig-tilbakefall gruppe (
P
= 0,256), men miRNA-29c økt betydelig i tidlige tilbakefall pasienter sammenlignet med friske forsøksgruppen og non-tidlig tilbakefall gruppe (
P
0,0001 og
P =
0,012, henholdsvis). Basert på serum data, vår utvalgsstørrelse på 61 oppnådde en statistisk styrke på 83,1%. Gjentakelse analyse av tidlig tilbakefall (blank linje) og ikke-tidlige tilbakefall (grå linje) gruppene ble vurdert av Kaplan-Meier metoden og tilbakefall mønstre ble vist i fig. 3B.
(A) Uttrykket nivåer av sirkulerende miRNA-29c er deregulert i serumprøver fra 23 friske personer, 41 ikke-tidlig og 20 pasienter tidlig-tilbakefall CRC. Serum miRNA-29C-nivåer var ikke signifikant forskjellig mellom friske personer gruppe og ikke-tidlig-tilbakefall gruppe (
P
= 0,256). Uttrykket nivået er betydelig økt i serumprøver av tidlig tilbakefall hos pasienter som sammenlignet med friske forsøksgruppen (
P
0,0001) og ikke-tidlig-tilbakefall gruppe (
P =
0,012 ). (B) Den tilbakefall analyse i CRC pasienter ble vurdert av Kaplan-Meier metoden og mønstre av tidlig tilbakefall (blank linje) og ikke-tidlige tilbakefall (grå linje) gruppene ble vist.
Diskusjoner
Økende gransking funksjon miRNAs har skapt en ny æra der tumorigenesis kan bli bedre forstått. Men rollen miRNAs i tilbakefall av CRC, spesielt i begynnelsen av tilbakefall CRC, er fortsatt uklart. Nylig, ved hjelp av matematisk analyse av mRNA uttrykk profiler, rapporterte vi at miRNA-29c er en prediktor for tidlig tilbakefall CRC [19]. I denne studien brukte vi en økt utvalgsstørrelse for å bekrefte at miRNA-29c uttrykk i tumorvev og serum kan forutsi CRC tidlig tilbakefall, og vi gjennomført en rekke
in vitro Hotell og
in vivo
funksjonelle studier for ytterligere å avklare rollen til miRNA-29c i CRC tumorigenesis.
In vitro, etter vi viste at miRNA-29c fremtredende hemmer tykktarmskreft celleproliferasjon og migrasjon, men ikke invasjon. Overekspresjon av miRNA-29c kan stanse cellesyklus G2 i fase, noe som fører til hemming av celleproliferasjon. I nakne mus, tykktarm kreft celler som overuttrykker miRNA-29c vist en betydelig lavere vekst enn gjorde kontroll kreftceller. Videre preoperative serumnivåer av miRNA-29c ble fremtredende assosiert med postoperativ tidlig tilbakefall. Følgelig er resultatene fra mobilnettet, dyr, og studier på mennesker gående indikerte at miRNA-29c utøver en anti-tumorgenese effekt, og det kan være en nyttig biomarkør for prediksjon av tidlig tilbakefall i CRC-pasienter etter operasjon.
Nylige studier har vist at miRNA-29c er involvert i en rekke biologiske prosesser, herunder carcinogenesis av forskjellige humane cancerformer så som kronisk lymfatisk leukemi [25], lungecancer [26], prostatakreft [27], og invasiv brystkreft [ ,,,0],28]. Men bortsett fra vår siste utgivelse [19], studier knyttet til rollen miRNA-29c i CRC patogenesen og tilbakefall er begrenset. Den kritiske rollen miRNA-29c i reguleringen av genuttrykk i tumorigenesis gjenstår å bli utforsket via målrettet mRNA profilering. Tumornekrosefaktor alfa-indusert protein 3 (TNFAIP3), en nøkkel regulator i inflammasjon og immunitet, ble funnet å være inverst korrelert med miRNA-29C nivåer, og ble identifisert som et mål for miRNA-29c [29]. Overekspresjon av miRNA-29c i hepatitt B-virus-relaterte hepatocellulære karsinomceller effektivt undertrykkes TNFAIP3 ekspresjon og HBV DNA-replikasjon, såvel som inhibering av celleproliferasjon og indusere apoptose [29]. miRNA-29c kan påvirke tumorigenesis ved å arbeide innenfor rammen av kjente tumor suppressor (dvs. p53) veier. Svulsten suppressor p53, kodet av
TP53
genet, er anerkjent som vokteren av det menneskelige genom fordi det regulerer mange nedstrøms gener til å utøve sin funksjon i cellesyklusprogresjon og celledød. Kumar
et al
påpekt at den menneskelige
kan TP53
genet bli negativt regulert av flere mirnas:. MiRNA-125b, miRNA-504, miRNA-25, og miRNA-30d [30] . En fersk studie har vist at miRNA-29 er også involvert i p53 vei, og miRNA-29 familiemedlemmer (miRNA-29a, miRNA-29b, og miRNA-29c) kan oppregulere p53 nivåer og indusere apoptose i en p53-avhengig måte ved direkte undertrykke P85 alfa (regulatorisk subenhet av PI3 kinase) og CDC42 (en Rho familie GTPase [31]. Våre siste arbeidet med miRNA-29C målgener antydet at DNMT3A, DNMT3B, og p53 er trolig involvert i potensiell vei fra CRC utvikling [19]. oven~~POS=TRUNC nevnte~~POS=HEADCOMP undersøkelser gir bevis for rollen miRNA-29c i å undertrykke CRC progresjon eller tilbakefall. Likeledes en fersk undersøkelse indikerte at miRNA-29c ble ofte nedregulert i vev som er berørt av esophageal plateepitelkarsinom, og miRNA-29c kunne undertrykke tumorvekst ved å indusere cellesyklus G (1) /G (0) arrestere hovedsakelig gjennom modulering av Cyclin E uttrykk [32]. Tilsvarende viste vi at overekspresjon av miRNA-29c kan hemme proliferasjonen av tykktarmskreftceller ved å redusere akkumulering av S-fasen befolkningen.
Våre data tyder på at miRNA-29c fremtredende hemmer spredning og migrasjon av tykktarmskreftceller, men har ingen effekt på celle invasjon.
