Abstract
Vi har nylig utviklet en metode for å generere myeloide celler med spredning kapasitet fra menneskelige iPS celler. IPS-ML (IPS-celle-avledede myeloid /makrofag-linjen), generert ved å innføre spredning og anti-senescence forhold til IPS-celle-avledede myeloidceller, vokste kontinuerlig i en M-CSF-avhengig måte. Et stort antall celler som oppviser makrofaglignende egenskaper kan lett oppnås ved hjelp av denne teknologien. I denne studien har vi evaluert mulig anvendelse av iPS-ML i anti-kreft terapi. Vi etablerte en modell av peritonealt spres magekreft ved intraperitoneal injeksjon NUGC-4 humane mage kreft celler i SCID-mus. Når iPS-ML ble injisert intraperitonealt i musene med pre-etablert peritoneal NUGC-4 svulster, iPS-ML massivt akkumulert og infiltrert inn i tumorvev. IPS-ML som uttrykker IFN-β (IPS-ML /IFN-β) inhiberte signifikant intra-peritoneal vekst av NUGC-4 kreft. Videre, IPS-ML /IFN-β også hemmet veksten av human kreft i bukspyttkjertelen MIAPaCa-2 i en lignende modell. iPS-ML er derfor en lovende behandling agent for peritonealt spredte kreftformer, som ingen standard behandling er for tiden tilgjengelig
Citation. Koba C, Haruta M, Matsunaga Y, Matsumura K, Haga E, Sasaki Y, et al. (2013) terapeutiske effekten av menneskelige iPS-Cell-Avledet myeloide celler som uttrykker IFN-β mot peritonealt disseminert Kreft i xenograft modeller. PLoS ONE 8 (6): e67567. doi: 10,1371 /journal.pone.0067567
Redaktør: Joseph Najbauer, Universitetet i Pécs Medical School, Ungarn
mottatt: 30 september 2012; Godkjent: 21 mai 2013; Publisert: 24 juni 2013
Copyright: © 2013 Koba et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grants-in-Aid nr. 23650609 og 24300334 til YN og 23659158 til S.S. fra MEXT, Japan; et tilskudd til Y.N. fra Princess Takamatsu Cancer Research Fund; Forskning Grant til S.S. for vanskelige sykdommer fra Helse- og velferdsdirektoratet, Japan; og et tilskudd til S.S. fra Japan Science and Technology Agency (JST). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Makrofager spille viktige roller for å opprettholde homeostase i kroppen. De bor i alle vev i kroppen og er engasjert i ulike funksjoner, slik som å eliminere invaderende patogener, ombygging vev, og fjerne døde celler. I tillegg er makrofag infiltrering hyppig observert i forskjellige cancere [1]. Nyere undersøkelser tyder på at disse tumor-assosierte makrofager (TAM) hovedsakelig fremme utviklingen av kreft ved å akselerere lokal invasjon og metastase av cancer [2]. I kontrast til andre studier viser tumorici-dal effekt av makrofager [3], [4]. Basert på anti-kreft effekt av makrofager observert i prekliniske studier, har bruk av makrofager til kreftbehandling blitt forsøkt; for eksempel overføring av makrofager pre-aktivert med IFN-γ ble testet som en potensiell behandlingsmiddel for kreftpasienter [5] – [9]. Imidlertid har ingen klar terapeutisk fordel mot kreft er observert så langt i makrofag terapien.
For å etablere makrofag terapi som et mer effektivt anti-kreft terapi, forbedring av fremgangsmåten for tilførsel av makrofager er nødvendig. I de rapporterte kliniske studier ble makrofager brukes til terapeutiske formål generert fra donor perifert blod monocytter som ble isolert ved leukaferese. Imidlertid perifere blodmonocytter isolert fra ikke lett kan forplante seg. Antall makrofager som genereres ved hjelp av slike fremgangsmåter er derfor begrenset (høyst 10
9 til 10
10), og kan være utilstrekkelig for å oppnå klinisk effekt. Hvis tilstrekkelig antall (for eksempel mer enn 10
10) av makrofager med den potente anti-kreft eiendom kan være gjentatte ganger administreres, kan vi realisere effektive anti-kreftterapi med makrofager.
pluripotent stamceller, slik som embryonale stamceller (ES) celler eller indusert pluripotent stammen (iPS) celler, kan forplante seg i det uendelige og har evnen til å differensiere til ulike typer av somatiske celler, inkludert blodceller. Ødeleggelse av et humant embryo er nødvendig for å generere humane ES-celler. iPS-celler, på den annen side, kan genereres ved å innføre flere definerte faktorer inn i somatiske celler avledet fra en hvilken som helst donor [10] – [13]. Dermed kan iPS celleteknologi vinne etiske problemstillinger samt histoincompatibility sak mellom de terapeutiske donorceller og mottaker, og fremtidig bruk av iPS celler til klinisk medisin forventes [14], [15].
Flere grupper, inkludert vår, har så langt etablert metoder for å generere makrofager fra mus eller menneskelige pluripotente stamceller [16] – [24]. Men menneskelige pluripotente stemα celler gi lavere antall makrofager enn mus pluripotente stamceller. Så langt etablerte metoder generere menneskelige makrotall som er mindre enn 100 ganger så mange av de udifferensierte iPS celler brukt som utgangsmaterialer; I tillegg genererer makrofager ved konvensjonelle metoder tar mer enn en måned. Således konvensjonelle metoder er også arbeidskrevende og dyrt å bli brukt til praktisk medisin.
Nylig har vi etablert en metode for å indusere proliferasjon av IPS-celle-avledet myeloide celler (IPS-MC) ved lentivirus-mediert transduksjon av gener som kan fremme celleproliferasjon eller inhiberer cellealdring, slik som cMYC pluss BMI1, EZH2, eller MDM2, for å generere en iPS-celle-avledede myeloid /makrofag-cellelinjen (iPS-ML) [25]. IPS-ML kan proliferere i en M-CSF-avhengig måte i minst flere måneder, og samtidig beholde muligheten til å differensiere til dendrittiske celler (IPS-ML-DC) med en potent T-celle-stimulerende kapasitet.
I denne studien evaluerte vi potensialet for bruk av iPS-ML som anti-kreft-effektorceller. Vi undersøkte hvorvidt genmodifiserte iPS-ML uttrykker anti-HER2-antistoff eller interferon (IFN) kunne utøve terapeutisk effekt mot peritonealt spres mage og bukspyttkjertel kreft i xenograft modeller.
Materialer og metoder
celler og reagenser
Denne studien ble godkjent av etisk gjennomgang styret i Kumamoto Universitetet Graduate School of Medical Sciences. En human magekreft cellelinje, NUGC-4, og en human bukspyttkjertelkreft cellelinje, MIAPaCa-2, ble gitt av den japanske Innsamling av forsknings Bioressurser (JCRB, Osaka, Japan). Metoder for generering, vedlikehold og genmodifisering av menneskelige iPS-celler har vært beskrevet tidligere [21].
flowcytometrisk analyse
Følgende mAbs konjugert med FITC eller PE ble kjøpt fra BD Pharmingen (San Diego, California), Beckman Coulter (Brea, California), Miltenyi Biotec (Bergish-Gladbach, Tyskland), Sigma (St. Louis, MO), eller eBioscience (San Diego, California): anti-CD45 (klon HI30, mus IgG1), anti-CD33 (WM53, mus IgG1), anti-CD36 (FA6.152, mus IgG1), anti-CD11b (ICRF44, mus IgG1), anti-CD14 (61D3, mus IgG1), anti-CD4 ( 11830, mus IgG2a), anti-CD97 (VIM3b, mus IgG1), anti-CD13 (WM15, mus IgG1), anti-CD87 (62022, mus IgG1), anti-CD115 (2-3A3-1B10, rotte IgG2a), anti-CD116 (4H1, mus IgG1), anti-TLR2 (T2.5, mus IgG1), anti-TLR4 (HTA125, mus IgG2a), anti-HER2 /neu (Neu 24,7, mus IgG1), og anti-cMYC ( 9E10, mus IgG1). Isotype-matchet kontroller, mus IgG2a (G155-178) og mus IgG1 (MOPC-21), ble brukt. Celleprøver ble behandlet med FcR-blokkerende reagens (Miltenyi Biotec) i 10 minutter og farget med det fluorokromkonjugerte-konjugerte mAb’er i 30 minutter, og vasket 3 ganger med PBS /FCS (2%). Stained celleprøver ble analysert ved hjelp av en FACScan (Becton Dickinson) strømningscytometer.
Zymosan fagocytose analysen
Cell suspensjoner i DMEM /10% FCS ble satt til 48-brønners kulturplater (2 × 10
5-celler /brønn i 200 ul) og inkubert ved 37 ° C i 2 timer for å tillate cellene å overholde platene. FITC-merket zymosan A-partikler (Molecular Probes) ble tilsatt til brønnene (2 x 10
6-partikler /brønn i 200 ul). Etter inkubasjon i den angitte perioden ble cellene mikroskopisk observert (Axio Observer Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland) og høstet av trypsin /EDTA behandling for flowcytometrisk analyse ved hjelp av et FACScan strømningscytometer.
Konstruksjon av ekspresjonsvektorer
et plasmid klon som inneholder cDNA for en enkelt kjede variabel region fragment (scFv) spesifikk for humant HER2 /neu var en gave fra Lieberman (Addgene plasmid # 10794) [26]. ScFv-sekvensen ble koblet ved hjelp av PCR for å nukleotid-sekvenser for et cMYC tag (EQKLISEEDL) og et C-terminalt fragment av mus FcγRI. Protein-kodende DNA-fragment ble først klonet inn i pENTR-D-Topo (Life Technologies) og deretter overført inn i en pattedyr-ekspresjonsvektor pCAG-IRES-Puro, som er drevet av CAG promoteren og har en indre ribosomale innføringsstedet (IRES) -puromycin
N
acetyl-transferase gen kassett. cDNA for human IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, TRAIL, og FAS-ligand ble levert av NITE Biological Resource (Kazusa, Japan), Kazusa DNA Research Center (Kazusa, Japan), Riken Senter eller BRC (Tsukuba, Japan). En lentivirus vektor, CSII-EF, og emballasje konstruksjoner ble generert av H. Miyoshi (Riken BRC) og kolleger [27]. CDNA-fragmentene ble innsatt i CSII-EF plasmid sammen med IRES-hygromycin fosfotransferase å generere lentivirale ekspresjonskonstruksjoner. Rekombinant lentivirus ble produsert og renset ved en tidligere beskrevet metode [21].
Generering av iPS-ML uttrykker scFv
Et plasmid vektor (pCAG-IRES-Puro) som koder for anti-HER2 scFv var introdusert i menneskelige iPS celler ved elektroporering og valgt å bruke puromycin (5 mikrogram /ml). Stabilt transfekterte kloner ble isolert ved en fremgangsmåte som tidligere er beskrevet [21]. Deretter ble IPS cellekloner som bærer anti-HER2-scFv-konstruksjonen plassert inn differensiering kultur for å generere IPS-MC /anti-HER2. IPS-MC uttrykker scFv spesifikk for HER2 ble omformet med lentivirus vektorer for cMYC pluss BMI1, eller cMYC pluss EZH2, for å generere iPS-ML. Metoden for å generere og vedlikeholde iPS-ML har tidligere blitt rapportert [25].
Genmodifisering av iPS-ML /scFv å uttrykke flere faktorer
iPS-ML ble omformet med lentivirus vektor koding IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, FAS-ligand eller TRAIL. For å velge celler som stabilt uttrykker transgener, ble cellene dyrket i et medium inneholdende hygromycin (0.5~2 mg /ml). For å kvantifisere produksjon av transgene-avledede cytokiner og FAS-ligand, ble de transfekterte IPS-ML dyrket (1 x 10
5-celler /brønn i 200 ul) i 96-brønns flatbunnet kulturplater i 24 timer, og konsentrasjonen av cytokiner og FAS-ligand i kultursupernatanten ble målt ved hjelp av ELISA-sett kjøpt fra Endogen eller R W Isoplate, Wallac) i nærvær av 10 ng /ml rekombinant IFN-α, IFN -β, IFN-γ, eller TNF-α. Tre dager senere ble luciferase substrat løsning (SteadyLite Plus, Perkin-Elmer) tilsatt (50 ul /brønn), og luminescens ble målt på en mikroplateleser (TriStar, BertholdTech, Bad Wildbad, Tyskland).
Analyse av anti-tumor aktivitet av iPS-ML
in vitro
NUGC-4 celler (5 × 10
3 celler /brønn) som uttrykker luciferase ble dyrket med eller uten iPS- ML (2,5 x 10
4 celler /brønn) i 96-brønners flatbunnet kulturplater (B W Isoplate, Perkin-Elmer). Etter en 3-dagers kultur, 50 pl /brønn av luciferase substratløsning ble tilsatt, og luminescens ble målt på en mikroplateleser.
Analyse av IPS-ML infiltrasjon inn i kreftvev i SCID-mus
Museforsøk forsøk~~POS=HEADCOMP ble godkjent av forsøksdyrutvalg av Kumamoto University. Grønn fluorescens protein (GFP) -expressing NUGC-4-celler (5 x 10
6 celler /mus) ble injisert i bukhulen til SCID-mus. Etter 15 dager ble iPS-ML merket med PKH26 (Sigma), etter produsentens anvisninger, og var intraperitonealt (i.p.) injisert i mus (3 × 10
6 celler /mus). Mus ble avlivet dagen etter og underkastes fluorescensanalyse for å makroskopisk detektere beliggenheten til NUGC-4 tumorer og IPS-ML på en nightowl II (Berthold Teknologier, Bad Wildbad, Tyskland). NUGC-4 /GFP ble påvist med 475 nm eksitasjon og 520 nm emisjonsfiltre, og PKH26-merket iPS-ML ble påvist med 550 nm eksitasjon og 600 nm emisjonsfiltre. For mikroskopisk undersøkelse, ble kreft vev i større omentum fjernet, fiksert i 4% paraformaldehyde /PBS, og innebygd i Tissue-TEK oktober forbindelse (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan). Vevssnitt av 20-mikrometer tykkelse ble gjort på en cryostat og analysert på en fluorescens mikroskop (Axio Observer Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).
Analyse av anti-tumor aktivitet av iPS-ML
in vivo
SCID mus var ip injisert med kreftceller (5 × 10
6 celler /mus). På dag 3 eller 4, ble musene underkastet luminescens bildeanalyse for å undersøke tumor etablering. Deretter ble mus med etablerte tumorer ble tilfeldig oppdelt i behandlings- og kontrollgrupper. Mus i behandlingsgruppen ble injisert med iPS-ML i henhold til den angitte tidsplan, og kreftcellevekst ble overvåket i mus ved luminescens bildeanalyse. Omfanget av kreft vekst ble bestemt av endringen av totale luminescens teller for hver mus.
Resultater
Karakterisering av menneskelige iPS-celle-avledet prolifererende myeloide celler
Vi har tidligere etablert en prosedyre for å generere myelomonocytisk celler med prolifererende kapasitet (iPS-ML) av lentivirus-mediert transduksjon av cMYC pluss BMI-en inn i menneskelige iPS celle-stammer myeloide celler (iPS-MC) [25]. IPS-ML vokste for det meste i suspensjon i en M-CSF-avhengig måte. De uttrykte flere macrophage maskin, og var heterogene i morfologien og i ekspresjonen av noen av celleoverflatemolekyler (Fig. 1A, B).
A. En fase-kontrastrikt bilde av levende IPS-ML i en kulturplate (øvre) og et bilde av IPS-ML farget med May-Giemsa på et lysbilde glass (lavere) er vist. B. Cell-overflate uttrykk for makro markør molekyler CD11b, CD14, CD4, CD13, CD33, CD36, CD87, CD97, CD115, CD116, TLR2, og TLR4 på iPS-ML ble analysert ved flowcytometri. Fargingen profiler av den spesifikke mAb (tykke linjer) og en isotype-matchet kontroll mAb (grått område) er vist. C. IPS-ML i kulturplater ble tilsatt med FITC-merket zymosan partikler. Fase-kontrast (øverst) og fluorescens (lavere) bilder etter en 90-minutters inkubasjon vises. D. Etter en 40-minutters inkubasjon i nærvær eller fravær av zymosans, ble cellene høstet ved bruk av trypsin /EDTA og deretter analysert på et strømningscytometer. Prosentandelen av celler med høy fluorescensintensitet som indikerer intracellulær zymosan er vist. E. Tid kurs for fagocytose vises. Viste data er gjennomsnitt ± SD av dupliserte analyser.
For å analysere phagocytic evne til iPS-ML, vi mikroskopisk observert iPS-ML kultur etter tilsetting FITC-merket zymosan partikler. Etter en 90-minutters inkubasjon ble fluorescenssignaler påvist i de fleste celler, noe som indikerer at de fleste av de IPS-ML inge zymosan partikler (Fig. 1C). Omtrent 60% av IPS-ML inneholdt partikler zymosan etter 40 min inkubering med FITC-merket zymosan partikler, som bestemt ved strømningscytometrisk analyse (Fig. 1D). En gang kurs for fagocytose er vist i figur 1E.
Anti-kreft aktiviteten til iPS-ML uttrykker anti-HER2 scFv
in vitro
En kreft-relaterte antigen, HER2 /neu, uttrykkes ved ulike typer kreft hos mennesker, inkludert bryst og mage kreft [28]. Vi bestemte oss for å undersøke anti-kreft effekt av IPS-ML ekspresjon av anti-HER2-scFv mot et HER2-uttrykkende magekreft cellelinje, NUGC-4 (fig. 2A). For dette formål genererte vi IPS-ML stabilt uttrykker anti-HER2-scFv (IPS-ML /anti-HER2) (Fig. 2B). IPS-ML /anti-HER2 ble samlet fra IPS-MC avledet fra en IPS-celleklon innført med en ekspresjonsvektor for anti-HER2-scFv av en tidligere beskrevet metode [21]. Vi sporadisk undersøkt og bekreftet uttrykk for scFv av iPS-ML /anti-HER2.
A. HER2 /neu uttrykk på NUGC-4 humane mage kreftceller ble analysert. Fargingen profiler av anti-HER2-mAb (tykk linje) og en isotype-matchet kontrollantistoff (grått område) er vist. B. Celle-overflate ekspresjon av anti-HER2-scFv på IPS-ML (IPS-ML /anti-HER2) ble påvist ved farging med et anti-cMYC-tag antistoff. C. Luciferase-uttrykk NUGC-4-celler (5 x 10
3 celler /brønn) ble dyrket alene eller ko-dyrket i et 96-brønns kulturplate med IPS-ML (1 x 10
4 celler /brønn ) med eller uten anti-HER2-scFv uttrykk. Antallet levende NUGC-4-celler ble målt ved hjelp av luciferase-aktivitet etter 3-dagers kultur. Dataene er angitt som middel + SD dupliserte analyser.
Ved første vi evaluert effekten av iPS-ML /anti-HER2 mot NUGC-4-celler
in vitro
. Ildflue luciferase-innført NUGC-4-celler ble ko-dyrket med IPS-ML med eller uten anti-HER2-scFv uttrykk. Vi observerte at IPS-ML redusert levende NUGC-4-celler, og at ekspresjon av anti-HER2-scFv IPS-ML forbedret hemmende virkning mot veksten av NUGC-4-celler (Fig. 2C).
Akkumulering og infiltrasjon av ip injisert iPS-ML i tumorvev
Vi ønsket å vurdere om iPS-ML hadde en terapeutisk effekt på peritonealt spres kreft. Makrofag infiltrasjon er hyppig observert i kliniske prøver av kreftvev [1]. Vi undersøkte hvorvidt i.p. administrert iPS-ML infiltrert i kreftvev pre-etablert i bukhulen på mus.
For å oppnå dette, GFP-uttrykke NUGC-4 menneskelige mage kreftceller, etablert fra en peritoneal metastatisk lesjon i en diffus-type magekreft pasient, ble injisert ip i SCID-mus. Etter 15 dager ble IPS-ML merket med rødt fluorescerende fargestoff PKH26 injisert. Vi samtidig injisert rekombinant vevsplasminogenaktivator (tPA) i musen bukhulen, forventer at tPA fremmet infiltrasjon av IPS-ML inn i tumorvevet. Musene ble avlivet på den følgende dag, og dissekert for å bestemme plasseringen av den injiserte IPS-ML ved fluorescens-analyse
Makroskopisk fluorescensanalyse detektering av GFP (eksitasjon /emisjon: 475/520 nm). Indikerte at NUGC-4 svulster hovedsakelig lokalisert i den større omentum (fig. 3A). Støpt iPS-ML oppdaget av PKH26 fluorescens (eksitasjon /emisjon: 550/600 nm) ble også det meste lokalisert i større omentum, viser at iPS-ML effektivt samlet inn i tumorvev.
Et slikt klart akkumulering av IPS-ML inn i det større omentum ble ikke observert når IPS-ML ble inokulert i mus uten etablerte tumorer (data ikke vist).. GFP-uttrykkende NUGC-4-celler (5 x 10
6 celler /mus) ble injisert i bukhulen til SCID-mus. Etter 15 dager ble iPS-ML merket med fluorescerende PKH26 injisert intraperitonealt inn i mus (3 × 10
6 celler /mus). Musene ble avlivet dagen etter, og utsatt for fluorescens bildeanalyse for å bestemme plasseringen av de NUGC-4-GFP tumorer (-eksitasjons- /emisjons: 475/520 nm) og PKH26-IPS-ML (-eksitasjons- /emisjons: 550/600 nm ). B. tumorvev i større omentum av musene ble isolert, og 20-mikrometer tykke frosne snitt ble foretatt. Seksjonene ble analysert på en fluorescens mikroskop, og et sammenslåtte bildet med grønn fluorescens indikerer NUGC-4 /GFP celler og rød fluorescens indikerer PKH26-farget iPS-ML er vist. C, D Vevssnitt ble fremstilt ved en lignende fremgangsmåte som for B, bortsett fra at tPA ikke ble brukt. En høyere forstørrelse utsikt over regionen omgitt av en stiplet firkant i C er vist i D.
Vi så isolert og mikroskopisk undersøkt tumorvev. I vevet seksjonen som er vist på figur 3B, PKH26-merkede IPS-ML infiltrert inn i reiret av GFP-uttrykkende NUGC-4-celler. Lignende eksperimenter ble utført uten tPA injeksjonen, og høyere forstørrelse analyse av vevssnittene klart viser infiltrasjon av IPS-ML inn i kreftvev (fig. 3C, D). Disse resultatene indikerer at IPS-ML effektivt infiltrert inn i kreftvev, når i.p. injisert i mus som bærer kreft etablert i bukhulen.
Ingen anti-kreft aktiviteten til iPS-ML uttrykker anti-HER2 scFv
in vivo
Vi neste undersøkt effekten av iPS-ML /anti-HER2 mot NUGC-4
in vivo
. Luciferase-uttrykk NUGC-4-celler ble podet inn i bukhulen til SCID-mus (5 x 10
6 celler /mus). Etter 3 dager ble kreftcelle innpoding i mus undersøkt ved bioluminescens analyse, og mus som bærer kreftceller ble tilfeldig inndelt i behandlings eller kontrollgrupper. Fra dager 4-8, ble behandlingsgruppen mus injisert daglig med iPS-ML /anti-HER2 (2 × 10
7 celler /mus). På dag 10 ble musene underkastet bioluminescens analyse på nytt for å undersøke utviklingen av kreft.
Som vist i fig S1, NUGC-4 svulster i IPS-ML-behandlede mus ble enda raskere enn i kontroll mus. De heller forbedret NUGC-fire kreftcellevekst i dette
in vivo
modell, selv om statistisk ikke-signifikant. Dette kan være fordi iPS-ML /anti-HER2 ble rammet av kreft mikromiljøet for å få en pro-kreft fenotype.
Følsomhet for NUGC-4 celler til cytokiner og celledrepende molekyler
for å gjøre iPS-ML i stand til å overvinne kreften mikromiljøet og for å utøve anti-kreft effekt
in vivo
, bestemt vi oss for å ytterligere modifisere iPS-ML /anti-HER2 å uttrykke flere molekyler. Cytokiner, slik som IFN, er kjent for å indusere død eller hemme veksten av kreftceller [29], [30]. I tillegg er disse cytokiner er kjent for å forbedre anti-cancer aktiviteten til makrofager [31] -. [33]
Vi analyserte følsomheten av NUGC-4-celler til rekombinant IFN-α, IFN-β, IFN -γ, eller TNF-α. Etter en 24-timers inkubasjon i nærvær enten av disse faktorene (10 ng /ml), analyserte vi apoptose ved å farge cellene med FITC-merket annexin-V. Vi har observert at alle testede cytokiner indusert visse nivåer av NUGC-4 celle apoptose (Fig. S2A). For å undersøke effekten for å redusere antallet levende NUGC-4-celler, ble luciferase-uttrykk NUGC-4-celler dyrket i 3 dager i nærvær av disse faktorer. I samsvar med annexin-V-flekker data, alle testede cytokiner betydelig redusert antall levende NUGC-4-celler (Fig. S2B). I begge analysene, IFN-β og IFN-γ utstilt den mest dyptgripende effekt.
Generering av iPS-ML /anti-HER2 uttrykker flere molekyler
Vi ga lentivirus ekspresjonsvektorer for IFN og TNF-α, og introduserte dem til iPS-ML /anti-HER2. I tillegg innførte vi lentivirus ekspresjonsvektorer på «apoptose-induserende faktorer», FAS-ligand eller TRAIL. Vi var i stand til å generere transfekterte IPS-ML som produserte cytokiner på mer enn 3 ng /24 timer /10
6-celler, med unntak av IFN-γ (fig. S3A). Vi kunne generere transfektant IPS-ML produserer bare et lavt nivå av IFN-γ, sannsynligvis på grunn av giftigheten av IFN-γ til IPS-ML. Celleoverflaten uttrykk for TRAIL i de transfekterte iPS-ML ble bekreftet av flowcytometrisk analyse (Fig. S3b).
Vi samarbeider dyrkes IPS-ML /anti-HER2 uttrykker flere anti-kreft molekyler med luciferase- uttrykk NUGC-4-celler og analysert antall levende NUGC-4-celler basert på luciferase-aktivitet etter 3 dager (fig. 4). IPS-ML /anti-HER2 uttrykker IFN-α, IFN-β, eller TRAIL viste en mer dyptgående effekt for å redusere NUGC-4-celler enn IPS-ML /anti-HER2, og de som uttrykker IFN-β var de mest potente. iPS-ML /anti-HER2 uttrykker IFN-γ eller TNF-α viste en effekt som ligner på iPS-ML /anti-HER2. Mangelen på vesentlig forbedring av anti-NUGC-4 virkning av IFN-γ transduksjon kan skyldes at mengden av IFN-γ produsert av IPS-ML /anti-HER2 /IFN-γ var lavere enn nivået for å utøve anti -cancer effekt. I dette eksperimentet, tvunget ekspresjon av FAS-ligand uventet svekket anti-NUGC-4 Virkningen av IPS-ML /anti-HER2.
luciferase-uttrykkende NUGC-4-celler ble dyrket i et 96-brønners kulturplate (5 x 10
3 celler /brønn) med iPS-ML /anti-HER2 uttrykker IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, FAS-ligand eller TRAIL (2,5 x 10
4 celler /brønn). Antallet levende NUGC-4-celler ble målt ved luminescens-analyse etter tre dagers kultur. Dataene er angitt som middel + SD av tredoble analyser.
terapeutiske effekten av iPS-ML /IFN-β på peritonealt spres NUGC-4 mage kreft celler i SCID-mus
basert på resultatene av
in vitro
eksperimenter, vi undersøkte
in vivo
anti-NUGC-4 effekten av iPS-ML /anti-HER2 uttrykker enten IFN-α, IFN-β, eller TRAIL. Behandling med hverken IPS-ML /anti-HER2 /IFN-α eller IPS-ML /anti-HER2 /TRAIL viste tydelig hemmende effekt på cancercellevekst
in vivo plakater (data ikke vist). På den annen side, IPS-ML som uttrykker IFN-β oppviste betydelig effekt for å hemme veksten av kreft, som beskrevet nedenfor.
I eksperimentene er vist i figur 5, vekst av NUGC-4 tumorer ble overvåket ved bioluminescens analyse på dag 4, 10 og 17 etter at kreftcellen inokulering. Mus med NUGC-4 svulster på dag fire ble delt inn i terapi eller ingen behandling (kontroll) gruppe. Mus av terapigrupper ble injisert intraperitonealt med iPS-ML /IFN-β eller iPS-ML /anti-HER2 /IFN-βfrom dag 4 (2 × 10
7 celler /injeksjon /mus, 3 injeksjoner per uke). Figur 5A viser bildedata av luminescens analyse av musene. Figur 5B viser den ganger endring av luminescens aktivitet fra dag 4 i kontroll- og behandlingsgruppene, noe som viser at tumorvekst ble inhibert ved behandling med IPS-ML /IFN-β eller IPS-ML /anti-HER2 /IFN-β. IPS-ML /IFN-β og IPS -ML /anti-HER2 /IFN-β var ekvivalent effektiv, noe som indikerer at ekspresjon av anti-HER2 er unnværlig for anti-kreft effekt av IPS-ML produserer IFN-β.
luciferase-uttrykk NUGC-4-celler ble injisert ip i SCID-mus (5 × 10
6 celler /mus). På dag 4, ble musene underkastet den luminescens bildeanalyse. Mus ble injisert på dag 4, 6, 8, 11, 13, og 15 med IPS-ML /IFN-β eller IPS-ML /IFN-β /anti-HER2 (2 x 10
7 celler /mus for hvert injeksjon, n = 5 i hver gruppe). Som en kontroll ble 8 mus forblir ubehandlet. Alle mus ble utsatt for bioluminescens analyse på dag 10 og 17. A. luminescens bildene er vist. B. For hver mus ble luminescens signal beregnet som en relativ verdi, der den foton stole på dag 4 ble definert som 1. Den middelverdi ± SD av fold-endring fra dag 4 i kontroll- og behandlingsgruppene er vist.
fig S4 viser resultatene av lignende forsøk til forhold undersøke effekten av iPS-ML, iPS-ML /IFN-β, iPS-ML /anti-HER2, og rekombinant IFN-β mot NUGC-4 cancer
in vivo
. I samsvar med de data som er vist i figur 5, behandling med IPS-ML /IFN-P i betydelig grad undertrykket progresjon av kreft. På den annen side, begge IPS-ML og IPS-ML /anti-HER2 heller fremmet vekst av cancer, selv om statistisk ikke-signifikant. Injeksjon av 400 ng, men ikke 200 ng /mus /injeksjon av rekombinant IFN-β etter samme tidsplan som IPS-ML injeksjon viste noen hemmende effekt på tumorvekst, selv om effekten ikke var statistisk signifikant.
Kollektivt , enkle iPS-ML ikke utviser anti-kreft effekt
in vivo
. Genetisk modifikasjon for å produsere IFN-β dratt betydelige anti-kreft-aktivitet til IPS-ML. På den annen side, fikk ekspresjon av anti-HER2-scFv ikke har en slik virkning.
Terapeutisk effekt av IPS-ML /IFN-β mot kreft i bukspyttkjertelen i en xenograft modell
neste undersøkt effekten av iPS-ML /IFN-β behandling mot kreft i bukspyttkjertelen celler. Tilsetting av rekombinant IFN-β til MIAPaCa-2 menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler indusert apoptose og redusert antall levende celler i
in vitro
eksperimenter (Fig. S5).
Vi har undersøkt effekten av iPS-ML /IFN-β mot MIAPaCa-2 celler
in vivo
. Vi kunne etablere en peritoneal kreft modell ved i.p. injeksjon av de MIAPaCa-2-celler som uttrykte luciferase inn i SCID-mus. I eksperimentene er vist i figur 6, ble 6-mus behandlet med IPS-ML /IFN-β injeksjon 3 ganger pr uke i 2 uker fra dag 4; resultatene av 8 kontrollmusene uten behandling er også vist. Vi observerte at IPS-ML /IFN-β behandling inhiberte signifikant MIAPaCa-2-tumorvekst sammenlignet med kontrollmus. Nedgangen i den gjennomsnittlige luminescens telle fra dag 10 til dag 17 av kontrollen (ingen behandling) gruppe skulle ha vært på grunn av økningen av ascites forårsaket av kreft, fordi vi observerte progressiv utvidelse av buken i mus i denne gruppen. Resultatene er vist i figur 6 viser at behandlingen med IPS-ML /IFN-β er effektiv mot kreft i bukspyttkjertelen.
luciferase-uttrykk MIAPaCa-2-celler ble inokulert i.p. inn i SCID-mus (5 x 10
6 celler /mus), og musene ble underkastet luminescens bildeanalysen på dag 3. Mus innpodet med kreftceller ble tilfeldig inndelt i behandlings (n = 6) og kontroll (n = 8 ) grupper. Mus i behandlingsgruppen ble injisert med IPS-ML /IFN-β (2 x 10
7 celler /mus for hver injeksjon) på dag 4, 6, 8, 11, 13 og 15. Alle musene ble underkastet Bioluminescens analyse på dager 10 og 17. luminescens bildene er vist i A. for hver mus, ble forandringen av luminescens signal per mus beregnet som en relativ verdi, der den fotontelling på dag 3 ble definert som 1. den middelverdi ± SD av ganger endring i kontroll- og behandlingsgrupper er vist i B.
Diskusjoner
makrofagin er hyppig observert i kliniske prøver av solide kreftformer, og disse makrofager kalles TAM. I den foreliggende undersøkelse, observerte vi at i.p. injiserte IPS-ML effektivt samlet og infiltrert i pre-etablerte cancervev i bukhulen til SCID-mus (fig. 3).
